CN104560923A

CN104560923A - 一种酵母活性蛋白酶

Info

Publication number: CN104560923A
Application number: CN201410852713.0A
Authority: CN
Inventors: 陈�光; 赵秋霞; 盛美田
Original assignee: AESTHETIC TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd
Current assignee: AESTHETIC TECHNOLOGY (BEIJING) Co Ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明涉及一种酵母活性蛋白酶。酵母是人类利用最早、最多、最广泛的一种单细胞微生物，其中含有大量优质的活性蛋白酶，同时，酵母来源广泛，生物安全性高的特点，非常适合规模化生产活性蛋白酶。本发明提供的活性蛋白酶即以酵母为原料，克服了现有技术中提取酵母活性蛋白酶时产能有限、过程耗时长、效率低等一系列缺陷，依次采用葡聚糖凝胶柱层析和金属螯合亲和柱层析代替丙酮的二次沉淀，采用环保、高效的聚乙二醇浓缩法对经过柱层析的洗脱液进行浓缩，得到高纯度的活性蛋白酶。本发明提供活性蛋白酶具有较高的纯度和较好的生物活性，可以作为原料用于制备化妆品。

Description

一种酵母活性蛋白酶

技术领域

本发明涉及蛋白酶，具体涉及一种酵母活性蛋白酶。

背景技术

酵母是人类利用最早、最多、最广泛的一种单细胞微生物，其中含有大量优质的活性蛋白酶，是一种提供活性蛋白酶的理想原料。

然而，现有技术提供的从酵母中提取活性蛋白酶的工艺仍存在产能有限、过程耗时长、效率低等一系列缺陷。例如，专利文献CN1800377A公开了一种用酵母菌体提取抗氧化酶的方法；所述方法中使用了丙酮二次沉淀，DEAE-32纤维素柱层析等一系列步骤，得到纯化精制的酶；但是其中使用了会造成污染和破坏蛋白质活性的丙酮成分，且制备步骤复杂，所得产物的酶活性不够理想。

目前，亟需通过一种简洁、高效、安全的方法从酵母中提取活性蛋白酶，并将提取所得的酵母活性蛋白酶应用到化妆品等领域。

发明内容

本发明旨在克服现有技术存在的缺陷，提供一种酵母活性蛋白酶，所述活性蛋白酶纯度高，且具有较高的生物活性。

本发明以酵母作为提取活性蛋白酶的原料，酵母具有来源广泛、生物安全性高的特点，适于规模化生产活性蛋白酶。

本发明提供了一种酵母活性蛋白酶，所述酵母活性蛋白酶由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将酵母与pH4.8～5.2的0.015～0.025mol/L柠檬酸缓冲液混合，500～2000bar条件下高压均质，循环2～10次，离心后取上清，即得粗酶液；

2)将硫酸铵加入步骤1)所得粗酶液中，静置，离心后收集沉淀；

3)将步骤2)所得沉淀溶解于pH7.0～7.4的0.01～0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液；

4)在步骤3)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0.4～0.6mol/L的溶液，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用pH 5.8～6.2的0.015～0.025mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；

5)取步骤4)所得洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得酵母活性蛋白酶。

本发明步骤1)中所述酵母为可应用于工业生产的、安全性高的常用的酵母品种，优选为啤酒酵母。

本发明所述步骤1)中：所述柠檬酸缓冲液的浓度优选为0.02mol/L，pH值优选为5.0；酵母与柠檬酸缓冲液的质量体积比为1：1～10，优选为1：3～5，此处酵母的质量单位为g，柠檬酸缓冲液的体积单位为ml；所述高压均质的压力为500～2000bar，优选为800～1200bar，高压均质应循环进行多次，以保证提取率，循环次数为2～10次，优选为2～5次；所述离心的温度为-5～20℃，优选为0～4℃，离心速度为300～12000rpm，优选为1000～5000rpm，离心时间为0.5～20min，优选为5～15min。

本发明所述步骤2)为硫酸铵分级沉淀法，具体为：将硫酸铵以质量体积比0.3～0.5:1溶解于步骤2)所得粗酶液中，此处硫酸铵的质量单位为g，粗酶液的体积单位为ml，静置20～40min，在0～4℃、7500～8500rpm条件下离心10～20min，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中以质量体积比0.7～0.9:1加入硫酸铵，此处硫酸铵的质量单位为g，上清液的体积单位为ml，静置20～40min，在0～4℃、8500～9500rpm条件下离心25～35min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并。

本发明所述步骤3)采用凝胶层析法除去硫酸铵，能快速获得不含硫酸铵的蛋白溶液，避免了常规透析除盐方法的繁冗过程和可能造成的目标产物损失。具体的，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液；缓冲液的浓度优选为0.015mol/L，pH值优选为7.2；步骤3)所得沉淀以质量体积比1:1～5溶解于磷酸盐缓冲液中，此处沉淀的质量单位为g，磷酸盐缓冲液体积的单位为ml；葡聚糖凝胶柱选用Sephadex G-25，凝胶柱的平衡和流动相的洗脱均为常规操作；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000，浓缩步骤为常规操作。

本发明所述步骤3)中，洗脱液中硫酸铵的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵。按照上述标准，步骤3)收集的目标洗脱液进行该检测后，不应出现棕黄色沉淀。

本发明所述步骤3)中，洗脱液中蛋白质的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在黑色比色磁盘中，加入1滴20％磺基水杨酸混合，若出现白色絮状沉淀则表明洗脱液中含有蛋白质。按照上述标准，步骤3)收集的目标洗脱液进行该检测后，应出现白色絮状沉淀。

本发明所述步骤4)中，金属螯合亲和柱所螯合的金属离子选自铜、锌、铁、镍离子等金属螯合亲和层析中常用的螯合用金属离子；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液；缓冲液的浓度优选为0.02mol/L，pH值优选为6.0；洗脱液中蛋白质的鉴别方法与步骤3)相同；

本发明所述步骤5)中，所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000，浓缩步骤为常规操作。该步骤通过金属亲和层析法进行蛋白纯化，能够快速获得纯化后的活性蛋白酶，能够避免活性蛋白酶的活性损失，且安全性更高，更环保。

作为本发明的最优选方案，所述酵母活性蛋白酶由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将酵母与pH5.0的0.02mol/L柠檬酸缓冲液以质量体积比1：4混合，1000bar条件下高压均质，循环5次，在0℃、5000rpm条件下离心15min，取上清，即得粗酶液；

2)将硫酸铵以质量体积比0.4：1溶解于步骤1)所得粗酶液中，静置30min，在0℃、8000rpm条件下离心15min，分离上清液，收集沉淀；将硫酸铵以质量体积比0.8:1加入所得上清液中，静置30min，在0℃、9000rpm条件下离心30min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并；

3)将步骤2)所得沉淀以质量体积比1：5溶解于pH7.2的0.015mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000浓缩，得浓缩液；

4)在步骤3)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0.5mol/L的溶液，将所得溶液加入平衡好的镍离子螯合亲和柱顶端，用pH6.0、0.02mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；

5)取步骤4)所得洗脱液，用PEG4000浓缩，冷冻干燥，即得酵母活性蛋白酶。

为了保证制备得到的酵母活性蛋白酶的活性，本发明各个步骤的操作温度均优选为0～4℃。

经高效液相色谱法等方法鉴定，本发明提供的酵母活性蛋白酶的主要成分为过氧化氢酶，且过氧化氢酶的含量在88％以上。

本发明进一步保护所述酵母活性蛋白酶在制备化妆品中的应用。

与现有技术相比，发明提供的活性蛋白酶产率高、纯度高，具有很强的酶活性，可作为原料制备化妆品。本发明提供的活性蛋白酶的制备来源安全可靠，制备方法安全、环保，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明各实施例中，采用以下方法鉴定洗脱液中的硫酸铵：

取1滴洗脱液，滴在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵。

本发明各实施例中，采用以下方法鉴定洗脱液中的蛋白质：

取1滴洗脱液，滴在黑色比色磁盘中，加入1滴20％磺基水杨酸混合，若出现白色絮状沉淀则表明洗脱液中含有蛋白质。

实施例1

酵母活性蛋白酶由以下步骤制备而成：

1)将酵母100g与pH5.0的0.02mol/L柠檬酸缓冲液400ml混合，1000bar条件下高压均质，循环5次，在0℃、5000rpm条件下离心15min，取上清，即得粗酶液480ml；

2)将192g硫酸铵溶解于步骤1)所得粗酶液中，静置30min，在0℃、8000rpm条件下离心15min，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入300g硫酸铵，静置30min，在4℃、9000rpm条件下离心30min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并，得沉淀3.72g；

3)将步骤2)所得沉淀溶解于pH7.2、0.015mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液15ml中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000浓缩，得浓缩液17ml；

4)在步骤3)所得浓缩液中加入0.49gNaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的镍离子螯合亲和柱顶端，用pH6.0、0.02mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；

5)取步骤4)所得洗脱液，用PEG4000浓缩得浓缩液，冷冻干燥，得白色粉末15.3mg。

经蛋白凝胶电泳SDS-PAGE检测，所得产品分子量与过氧化氢酶标准品相同，证明产物为过氧化氢酶。

实施例2

酵母活性蛋白酶由以下步骤制备而成：

1)将酵母100g与pH5.2的0.015mol/L柠檬酸缓冲液500ml混合，2000bar条件下高压均质，循环10次，在0℃、1000rpm条件下离心5min，取上清，即得粗酶液625ml；

2)将300g硫酸铵溶解于步骤1)所得粗酶液中，静置40min，在4℃、8500rpm条件下离心10min，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入405g硫酸铵，静置40min，在4℃、9500rpm条件下离心25min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并，得沉淀3.61g；

3)将步骤2)所得沉淀溶解于pH7.4、0.02mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液20ml中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000浓缩，得浓缩液25ml；

4)在步骤3)所得浓缩液中加入0.73gNaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的铜离子螯合亲和柱顶端，用pH5.8、0.025mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；

5)取步骤4)所得洗脱液，用PEG4000浓缩得浓缩液，冷冻干燥，得白色粉末14.2mg。

实施例3

酵母活性蛋白酶由以下步骤制备而成：

1)将酵母100g与pH4.8的0.015mol/L柠檬酸缓冲液缓冲液300ml混合，500bar条件下高压均质，循环10次，在0℃、12000rpm条件下离心10min，取上清，即得粗酶液325ml；

2)将105g硫酸铵溶解于步骤1)所得粗酶液中，静置20min，在0℃、7500rpm条件下离心20min，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入175g硫酸铵，静置20min，在4℃、8500rpm条件下离心35min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并，得沉淀3.58g；

3)将步骤2)所得沉淀溶解于pH7.0、0.01mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液10ml中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000浓缩，得浓缩液15ml；

4)在步骤3)所得浓缩液中加入0.15gNaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的锌离子螯合亲和柱顶端，用pH6.2、0.015mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；

5)取步骤4)所得洗脱液，用PEG4000浓缩得浓缩液，冷冻干燥，得白色粉末14.0mg。

对比例1

与实施例1相比，区别仅在于，所述步骤3)用以下操作代替：将步骤3)所得沉淀溶解于pH7.2、0.015mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液15ml中，置于透析袋中，按照常规方法透析去除硫酸铵，每隔5小时更换一次透析缓冲液，50小时后，溶液中不含有硫酸铵，用PEG4000浓缩，得浓缩液。

所得产物为白色粉末10.4mg。

对比例2

与实施例1相比，区别仅在于，步骤4)所述磷酸盐缓冲液由步骤3)所述磷酸盐缓冲液代替。

所得产物为白色粉末14.8mg。

实验例：酵母活性蛋白酶检测

采用以下方法鉴定酵母活性蛋白酶的纯度：以实施例1～3和对比例1、2所得产物为样品，以市售过氧化氢酶作为标准品，采用反相高效液相色谱法，以C18柱为固定相，以含有0.3％三氟乙酸的乙腈-水为流动相，按照常规操作，参考标准品的出峰情况，确定样品的目标吸收峰，采用峰面积法计算产品纯度。

采用以下方法鉴定酵母活性蛋白酶的活性：以实施例1～3和对比例1、2所得产物为样品，以市售过氧化氢酶作为标准品，采用紫外分光光度法测定各样品的酶活性，具体为240nm波长测定H₂O₂被过氧化氢酶催化分解时吸光度的降低值，1min每毫克蛋白质在240nm波长下使光密度下降0.001个单位的酶量为1个酶活力单位。

检测所得活性蛋白酶的纯度和活性的检测结果见表1；U/mg代表酶的比活。

表1：活性蛋白酶检测结果

样品	纯度(％)	比活(U/mg)
			实施例1	89.6	6542.7
实施例2	88.7	6498.3
			实施例3	88.9.	6478.9
对比例1	75.6	5986.3
			对比例2	60.3	4336.9
标准品	--	6485.4

由以上检测结果可知，本发明提供的方法制备得到的活性蛋白酶的纯度均大于88.5％，优于对比例1且显著优于对比例2，；本发明提供的活性蛋白酶具有很强的酶活性，比活均大于6470U/mg，且不低于标准品的比活，优于对比例1，且显著优于对比例2。

经比较可知，各实施例中，实施例1提供方法所得产品的综合性质最佳。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种酵母活性蛋白酶，其特征在于，所述酵母活性蛋白酶由包括以下步骤的方法制备而成：

4)在步骤3)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0.4～0.6mol/L的溶液，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用pH 5.8～6.2的0.015～0.025mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱；收集含有蛋白质的洗脱液；

2.根据权利要求1所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，所述步骤1)中，高压均质条件为800～1200bar，循环次数为2～5次。

3.根据权利要求1或2所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，步骤1)所述柠檬酸缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为5.0。

4.根据权利要求1所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，所述步骤2)具体为：将硫酸铵以质量体积比0.3～0.5:1溶解于步骤1)所得粗酶液中，静置20～40min，在0～4℃、7500～8500rpm条件下离心10～20min，分离上清液，收集沉淀；将硫酸铵以质量体积比0.7～0.9:1加入所得上清液中，静置20～40min，在0～4℃、8500～9500rpm条件下离心25～35min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并。

5.根据权利要求1所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，步骤3)所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.015mol/L，pH值为7.2。

6.根据权利要求1所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，步骤4)所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH值为6.0。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，步骤5)所述浓缩采用PEG4000浓缩。

8.根据权利要求1所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，所述酵母活性蛋白酶由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将酵母与pH4.8～5.2的0.015～0.025mol/L柠檬酸缓冲液缓冲液以质量体积比1：1～10混合，500～2000bar条件下高压均质，循环2～10次，在-5～20℃、300～12000rpm条件下离心时间为0.5～20min，取上清，即得粗酶液；

2)将硫酸铵以质量体积比0.3～0.5:1溶解于步骤1)所得粗酶液中，静置20～40min，在0～4℃、7500～8500rpm条件下离心10～20min，分离上清液，收集沉淀；将硫酸铵以质量体积比0.7～0.9:1加入所得上清液中，静置20～40min，在0～4℃、8500～9500rpm条件下离心25～35min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并；

3)将步骤2)所得沉淀以质量体积比1:1～5溶解于pH7.0～7.4的0.01～0.02mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000浓缩，得浓缩液；

4)在步骤3)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0.4～0.6mol/L的溶液，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用pH值5.8～6.2的0.015～0.025mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；

9.根据权利要求1所述的酵母活性蛋白酶，其特征在于，所述酵母活性蛋白酶由包括以下步骤的方法制备而成：

10.权利要求1～9任意一项所述酵母活性蛋白酶在制备化妆品中的应用。