CN115381762B - 一种蜗牛发酵滤液的制备方法及含其组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜗牛发酵滤液的制备方法及含其组合物和应用，涉及的是化妆品领域。本发明中通过将植物乳杆菌发酵滤液与蜗牛黏液按比例混合后在一定的温度、时间下进行酶解反应，获得蜗牛发酵分泌滤液，能够最大程度的保留了蜗牛黏液中的活性成分，避免有机溶剂的引入，安全环保，不需要添加酶等外来物质，直接应用微生物发酵滤液中的酶对蜗牛黏液进行酶解，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现人量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。

Description

一种蜗牛发酵滤液的制备方法及含其组合物和应用
技术领域
本发明涉及的是化妆品领域，A61K8/98，尤其涉及一种蜗牛发酵滤液的制备方法及含其组合物和应用。
背景技术
蜗牛分泌的黏液中含天然尿囊素、钙、甘醇酸、骨胶原、蛋白质和维生素等多种营养活性成分，可明显改善皮肤老化状态，此外，蜗牛分泌的黏液还是一种天然抗生素，能够很大程度上杀死皮肤上的多种细菌，较好地渗透到皮肤中，消除皮肤处的斑点和痤疮。而且蜗牛分泌的黏液中含有的化学成分有利于肌肤的再生能力加强，表现出很好地紧肤、抗衰作用。因此，今年来，蜗牛黏液已被广泛应用到医药护肤品行业。中国专利申请CN111481492B公开了一种含中药复合提取物的组合物及其应用，将合欢树皮、豨莶粉碎后提取、发酵得到中药复合提取物，然后与蜗牛分泌物滤液、野大豆胚芽提取物、细齿樱桃花提取物复配，能够促进胶原的合成，淡化皱纹，增强皮肤弹性和紧致度，预防皮肤老化。
现有化妆品使用的蜗牛黏液、蜗牛酶等多为通过使蜗牛在粗糙表面上爬行使之分泌更多粘液得到。存在的问题是通过此方法获得的粘液中含有酶的种类较少，使用效果差；同时未经处理的蜗牛黏液中大分子物质不易吸收，降低了蜗牛黏液作为优良原料在化妆品中的应用。此外，现有蜗牛粘液的制备技术中，天然的蜗牛黏液分泌量非常稀少，采集的黏液中杂质较多；采用水煮方式制备的黏液，在经过长时间高温处理后，部分有效成分招到破坏，大大限制了蜗牛粘液的广泛使用。此外，现阶段都是对蜗牛黏液提取物的充分利用，无法直接添加蜗牛黏液。发酵指借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程，在食品工业生物和化学工业中均有广泛应用。采用发酵技术生产化妆品原料已多有报道，因此，可以采用发酵技术获得蜗牛黏液中的活性成分，中国专利申请CN110680774B公开了一种一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法及产物的应用，较茉莉花干粉利用酿酒酵母初次发酵后接入植物乳杆菌进而二次发酵，获得茉莉花发酵提取物，留了植物的全部功效成分及其活性，而且不添加香精等对化学成分，不会给肌肤造成任何负作用。但是目前根据发酵底物和发酵工艺条件的不同，制备的原料功效差异很大。有赖于研究人员继续探索更多发酵底物组合及发酵方法制备出更多、更优功效的产品以满足消费者需求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种蜗牛发酵滤液的制备方法，包括：
S1.发酵滤液的制备：将高活性菌种的菌悬液在培养基中培养制备得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。
S2.蜗牛黏液的制备：收集蜗牛黏液，离心去掉粘液中的杂质并收集上清液，在冰箱中储存备用。
S3.蜗牛发酵滤液的制备：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液进行混合，经酶解反应后离心并收集上清液，即得。
优选地，所述蜗牛发酵滤液的制备方法，包括：
S1.发酵滤液的制备：将高活性菌种的菌悬液加入到培养基中，在30-37℃，120-230rpm条件下培养19-23h制备得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在30-37℃，100-230rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。
S2.蜗牛黏液的制备：将收集到的蜗牛黏液经在4000rpm-5000rpm下离心8-15min并收集上清液，在冰箱中储存备用。
S3.蜗牛发酵滤液的制备：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液进行混合，调节混合液体的pH，并进行酶解反应，随后在4000rpm-5000rpm下离心5-15min，收集上清液，即得。
S1中
所述高活性菌种为传代培养2-3代后的菌种；优选为2代。
所述菌种选自酵母菌、乳杆菌、米曲霉中的任意一种；优选为乳杆菌；进一步优选为植物乳杆菌。
在一些优选的实施方式中，所述菌悬液的浓度采用分光光度法测定，具体值为OD600nm＝4.5-5.5。
在一些优选的实施方式中，所述培养基为MRS肉汤培养基，具体配制方法为：将肉汤培养基的混合固体粉末取52.5g溶于1000mL去离子水中，调节pH至5.0-6.0，然后在121℃灭菌锅中灭菌15min，并在-4℃冰箱储存备用。
所述发酵液为MRS肉汤培养基，与培养基的营养物质相同，具体实施方式同培养基。
在一些优选的实施方式中，所述菌悬液与培养基的体积比为(180～200)μL：30mL；优选为200μL：30mL。
在一些优选的实施方式中，所述种子液的浓度通过紫外吸收光度法测定得到。优选地，所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.0-5.5。
在一些优选的实施方式中，所述种子液在接种到发酵液中时需要按照一定的接种量进行；优选地，所述种子液在接种到发酵液中的接种量为180-240μL/30mL；进一步优选为200μL/30mL。
在一些优选的实施方式中，所述发酵时间为24-72h，因此，能够得到不同发酵时间段的发酵液(如图1所示)。
在一些优选的实施方式中，所述离心的转速为3500rpm-5000rpm，时间为5-15min；优选地，离心的转速为4000-5000rpm，时间为10-15min；进一步优选地，离心的转速为4200rpm，时间为10min。
S2中
在一些优选的实施方式中，所述蜗牛黏液的收集方法选自水煮收集、自然滴落收集、水洗收集中的任意一种。
在一些优选的实施方式中，所述水煮收集的具体操作为：将蜗牛清洗后放入到100℃的沸水中煮30min，收集水煮液即得，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为1号蜗牛黏液。
在一些优选的实施方式中，所述自然滴落收集的具体操作为：将蜗牛放入到清洗干净的容器中，使其自由爬行，然后收集器滴落的液体，即得，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为2号蜗牛黏液。
在一些优选的实施方式中，所述水洗收集的具体操作为：采用本司发明的多功能化妆品生产仪器，控制温度处于20-30℃，湿度为65-90％RH，每天喷洒温水两到三次，每次喷洒的时间为30min，收集最终的蜗牛水洗液，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为3号蜗牛黏液。
S3中
在一些优选的实施方式中，所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为(1-4)：1；优选为(1-3)：1。
在一些优选的实施方式中，所述混合液体的pH为5.0-6.0；优选为5.20-5.60。
在一些优选的实施方式中，所得进行酶解反应需要一定的温度，本发明中通过水浴锅实现；优选地，所述进行酶解反应的温度为50-60℃，酶解的时间为3.5-4.5h；进一步优选地，温度为55℃，时间为4h。
通过不同的收集方法得到的蜗牛黏液在性能上具有很大的不同，本申请人发现，将植物乳杆菌发酵滤液与多种收集方法收集得到的蜗牛黏液按照(1-4)：1的体积比进行混合，能够使蜗牛黏液与发酵液充分接触，更有利于发酵反应的进行。特别是当pH为5.0-6.5，温度为50-60℃时，微生物发酵滤液中的酶的反应活性高，菌体生长和代谢速率加快，而且能够合理调整细胞膜的带电荷状况，促进微生物对营养物质的吸收以及代谢产物的分泌，进而加快了发酵反应的速率，酶解3.5-4.5h则能够使发酵反应完全，而且保证大幅度提高蜗牛发酵滤液中的生物活性，起到抑制酪氨酸酶、抗敏舒缓等效果。
本发明第二方面提供了一种含有由上述制备方法得到的蜗牛发酵滤液的组合物，还包括多元醇和去离子水。
在一些优选的实施方式中，按重量百分比计，所述含有的蜗牛发酵滤液的组合物，包括：蜗牛发酵滤液5-30％、多元醇1.5-10％，去离子水添加至100％。
优选地，按重量百分比计，所述含有的蜗牛发酵滤液的组合物，包括：蜗牛发酵滤液10-20％、多元醇2-9％，去离子水添加余量至100％。
在一些优选的实施方式中，所述多元醇选自乙醇、1,2-丙二醇、1,2-己二醇、1,3-丁二醇、丙三醇、乙基己基甘油、三氯叔丁醇中的至少一种；优选地，所述多元醇至少包括1,2-己二醇和乙基己基甘油。
在一些优选的实施方式中，所述1,2-己二醇和乙基己基甘油的重量比为(35-60)：1；优选为(40-60)：1；进一步优选为40：1。
优选地，所述多元醇还可以包括1,3-丁二醇。
在一些优选的实施方式中，所述1,2-己二醇、乙基己基甘油和1,3-丁二醇的重量比为(90-100)：(50-65)：1；优选为100：60：1。
本发明第三方面提供了一种含有由上述制备方法得到的蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用。
在一些优选的实施方式中，所述护肤品包括精华水、乳叶、精华液、乳霜、面膜中的任意一种。
在一些优选的实施方式中，所述护肤品为乳霜时，按重量百分比计，其制备原料包括：含有蜗牛发酵滤液的组合物5-30％、乳化剂2-8％、肌肤调理剂1-7％、柔润剂0.5-5％、增稠剂0.5-3％、抗菌剂0.1-1％、甘油3-8％、水添加至100％。
在一些优选的实施方式中，所述乳化剂选自聚甘油-10肉豆蔻酸酯、PEG-100硬脂酸酯、肉豆蔻基葡糖苷、失水山梨醇聚氧乙烯醚脂肪酸、鲸蜡硬脂醇聚醚-33、聚甘油酯、硬脂酸甘油酯中的至少一种；优选为PEG-100硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-33。
在一些优选的实施方式中，所述PEG-100硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-33的重量比为(1.5-2.8：(2.5-4)；优选为2：3。
在一些优选的实施方式中，所述肌肤调理剂选自霍霍巴籽油、牛油果树果脂、油橄榄果油、椰子油、角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯、芒果籽脂、向日葵籽油、椰油酸癸酯、甜扁桃油中的至少一种；优选为牛油果树果脂和椰子油。
在一些优选的实施方式中，所述牛油果树果脂和椰子油的重量比为(3-5)：1；优选为4：1。
在一些优选的实施方式中，所述柔润剂选自聚二甲基硅氧烷、环聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇、油菜甾醇类、碳酸二辛酯、己二酸二丁酯、环己硅氧烷、鲸蜡硬酸酯醇中的至少一种；优选为聚二甲基硅氧烷和油菜甾醇类。
在一些优选的实施方式中，所述聚二甲基硅氧烷和油菜甾醇类的重量比为(1.5-2.5)：(0.5-1)；优选为2：0.5。
在一些优选的实施方式中，所述增稠剂选自聚丙烯酰胺、卡波姆、黄原胶、阿拉伯胶、季戊四醇二硬脂酸酯、羟乙基纤维素、桂醇聚醚-7、二甲基硅油、C13-14异链烷烃中的至少一种；优选为聚丙烯酰胺和黄原胶。
在一些优选的实施方式中，所述聚丙烯酰胺和黄原胶的重量比为(13.5-16.5)：1；优选为15：1。
在一些优选的实施方式中，所述抗菌剂选自苯氧乙醇、氯苯甘醚、苯甲醇、羟苯丙酯、乙基己基甘油、丙二醇、辛甘醇、辛酰羟肟酸、对羟基苯乙酮；优选为苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇。
在一些优选的实施方式中，所述苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇的重量比为(2.5-3.6)：(0.7-1.5)：1；优选为3：1：1。
在一些优选的实施方式中，所述护肤品的制备方法，包括：
(1)将乳化剂、肌肤调理剂、柔润剂混合后加热至80-90℃，得到混合物A；将水和甘油混合加热至80-90℃，得到混合物B；
(2)将增稠剂进行低温溶胀后加热至80-90℃，转移至配置锅中与混合物A和混合物B混合，预乳化8-15min，然后降温至70-75℃均质乳化3-5min，真空降温至50-60℃，搅拌2-3min，随后再次真空降温至45-50℃，均质2-3min，得到混合物C；
(3)于混合物C中加入抗菌剂和含有蜗牛发酵滤液的组合物，脱气并冷却，降温到35-40℃，放置陈化24h以上，灌装。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中通过将植物乳杆菌发酵滤液与蜗牛黏液按比例混合后在一定的温度、时间下进行酶解反应，获得蜗牛发酵分泌滤液，能够最大程度的保留了蜗牛黏液中的活性成分，有效避免了有机溶剂的引入，安全环保，不需要添加酶等外来物质，直接应用微生物发酵滤液中的酶对蜗牛黏液进行酶解，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现人量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。
(2)本发明中得到的蜗牛发酵分泌滤液与未发酵的蜗牛黏液相比，能够大大提高蜗牛黏液的生物活性，具有抑制酪氨酸酶、抗敏舒缓等效果，扩大其应用范围。
(3)本发明中通过将多元醇与得到的蜗牛发酵分泌滤液按比例混合，所得的混合物稳定性好，活性强，对敏感性肌肤具有优异的抑制舒缓刺激功效，同时具有美白、抗氧化作用，能够广泛用于化妆品领域，突破了蜗牛发酵分泌滤液在化妆品领域的限制。
附图说明
图1蜗牛黏液接种植物乳杆菌不同发酵时间后所得的发酵滤液
图2蜗牛发酵滤液组合物的制备工艺流程图
图3 1号、2号、3号蜗牛黏液使用前后的皮肤表皮失水量变化(舒缓刺激)
图4 1号、2号、3号蜗牛黏液使用前后的皮肤红值变化(舒缓刺激)
图5实施例所得产品使用前后皮肤表皮失水量变化(舒缓刺激)
图6实施例所得产品使用前后皮肤红值变化(舒缓刺激)
图7 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品舒缓刺激皮肤图像
图8 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品使用前后皮肤表皮失水量变化(抑制刺激)
图9 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品使用前后皮肤红值变化(抑制刺激)
图10 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品抑制刺激皮肤图像
具体实施方式
实施例1
1、一种蜗牛发酵滤液的制备方法，包括：
S1.发酵滤液的制备：将高活性菌种的菌悬液加入到培养基中，在37℃，150rpm条件下培养22h制备得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在37℃，150rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。
S2.蜗牛黏液的制备：将收集到的蜗牛黏液经在4200rpm下离心10min并收集上清液，在冰箱中-4℃储存备用。
S3.蜗牛发酵滤液的制备：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液进行混合，调节混合液体的pH，并进行酶解反应，随后在4200rpm下离心10min，收集上清液，即得。
S1中
所述高活性菌种为传代培养2代后的菌种。
所述菌种为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum RD-02，KCTC-SD1323，来至韩国瑞帝安生物科技有限公司)。
所述菌悬液的浓度采用分光光度法测定，具体值为OD600nm＝5.1。
所述培养基为MRS肉汤培养基，具体配制方法为：将肉汤培养基的混合固体粉末取52.5g溶于1000mL去离子水中，调节pH至5.5-5.9，然后在121℃灭菌锅中灭菌15min，并在-4℃冰箱储存备用。
所述发酵液为MRS肉汤培养基，与培养基的营养物质相同，具体实施方式同培养基。
所述菌悬液与培养基的体积比为200μL：30mL。
所述种子液的浓度通过紫外吸收光度法测定得到。
所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.20。
所述种子液在接种到发酵液中时接种量为200μL/30mL。
所述发酵时间为24h。
所述离心的转速为4200rpm，时间为10min。
S2中
所述蜗牛黏液的收集方法为水煮收集收集(1号蜗牛黏液)。
所述水煮收集的具体操作为：将蜗牛清洗后放入到100℃的沸水中煮30min，收集水煮液即得，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为1号蜗牛黏液。
S3中
所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为1：1。
所述混合液体的pH为5.48。
所得进行酶解反应的温度为55℃，时间为4h。
所示蜗牛发酵滤液的制备方法具体如图2所示。
2、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，还包括多元醇和去离子水。
按重量百分比计，所述含有由上述制备方法得到的蜗牛发酵滤液的组合物，包括：蜗牛发酵滤液20％、多元醇8.05％，去离子水添加至100％。
所述多元醇为1,2-己二醇、乙基己基甘油和1,3-丁二醇。
所述1,2-己二醇、乙基己基甘油和1,3-丁二醇的重量比为100：60：1。
实施例2
1、一种蜗牛发酵滤液的制备方法，与实施例1的不同之处在于：
S1.制备发酵滤液：将传代至第二代的菌种的菌悬液加入到培养基中，在37℃，150rpm条件下培养20h得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在37℃，200rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。
所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.0。
所述发酵时间为48h。
S2中
所述蜗牛黏液的收集方法为水洗收集(3号蜗牛黏液)。
所述水洗收集的具体操作为：采用本司发明的多功能化妆品生产仪器，控制温度处于20-30℃，湿度为65-90％RH，每天喷洒温水两到三次，每次喷洒的时间为30min，收集最终的蜗牛水洗液，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为3号蜗牛黏液。
S3中
所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为1：1。
所述混合液体的pH为5.59。
2、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，与实施例1的不同之处在于：
所述蜗牛发酵滤液为由实施例2所述制备方法得到。
实施例3
1、一种蜗牛发酵滤液的制备方法，与实施例1的不同之处在于：
S1.制备发酵滤液：将传代至第二代的菌种的菌悬液加入到培养基中，在37℃，150rpm条件下培养20h得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在37℃，200rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。
所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.00。
所述发酵时间为48h。
S3中
所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为3：1。
所述混合液体的pH为5.19。
2、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，与实施例1的不同之处在于：
所述蜗牛发酵滤液为由实施例3所述制备方法得到。
实施例4
1、一种蜗牛发酵滤液的制备方法，与实施例1的不同之处在于：
所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.20。
所述发酵时间为72h。
S2中
所述蜗牛黏液的收集方法为自然滴落收集(2号蜗牛黏液)。
所述自然滴落收集的具体操作为：将蜗牛放入到清洗干净的容器中，使其自由爬行，然后收集器滴落的液体，即得，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为2号蜗牛黏液。
S3中
所述混合液体的pH为5.54。
2、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，与实施例1的不同之处在于：
所述蜗牛发酵滤液为由实施例4所述制备方法得到。
实施例5
1、一种蜗牛发酵滤液的制备方法，同实施例2。
2、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，与实施例2的不同之处在于：
按重量百分比计，所述含有由上述制备方法得到的蜗牛发酵滤液的组合物，包括：蜗牛发酵滤液10％、多元醇2.05％，去离子水添加余量至100％。
所述多元醇为1,2-己二醇和乙基己基甘油。
所述1,2-己二醇和乙基己基甘油的重量比为40：1。
实施例6
1、一种蜗牛发酵滤液的制备方法，同实施例3。
2、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，与实施例3的不同之处在于：
按重量百分比计，所述含有由上述制备方法得到的蜗牛发酵滤液的组合物，包括：蜗牛发酵滤液10％、多元醇2.05％，去离子水添加余量至100％。
所述多元醇为1,2-己二醇和乙基己基甘油。
所述1,2-己二醇和乙基己基甘油的重量比为40：1。
实施例7
1、一种含有蜗牛黏液的组合物，与实施例3的不同之处在于：
所述蜗牛发酵滤液替换为蜗牛黏液(1号蜗牛黏液)。
实施例8
1、一种含有蜗牛黏液的组合物，与实施例2的不同之处在于：
所述蜗牛发酵滤液替换为蜗牛黏液(3号蜗牛黏液)。
实施例9
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用。
所述护肤品为乳霜，按重量百分比计，其制备原料包括：含有蜗牛发酵滤液的组合物20％、乳化剂5.0％、肌肤调理剂5.0％、柔润剂2.5％、增稠剂1.6％、抗菌剂0.5％、甘油5.0％、水添加至100％。
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例1中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
所述乳化剂为PEG-100硬脂酸酯(CAS号：9004-99-3)和鲸蜡硬脂醇聚醚-33(CAS号：68439-49-6)。
所述PEG-100硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-33的重量比为2：3。
所述肌肤调理剂为牛油果树果脂和椰子油(阿胡斯卡尔斯油脂(上海)有限公司，AAK)。
所述牛油果树果脂和椰子油的重量比为4：1。
所述柔润剂为聚二甲基硅氧烷(CAS号：9006-65-9)和油菜甾醇类(CAS号：474-60-2)。
所述聚二甲基硅氧烷和油菜甾醇类的重量比为2：0.5。
所述增稠剂为聚丙烯酰胺(CAS号：9003-05-8)和黄原胶(CAS号：11138-66-2)。
所述聚丙烯酰胺和黄原胶的重量比为15：1。
所述抗菌剂为苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇。
所述苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇的重量为3：1：1。
(1)将乳化剂、肌肤调理剂、柔润剂混合后加热至85℃，得到混合物A；将水和甘油混合加热至85℃，得到混合物B；
(2)将增稠剂进行低温溶胀后加热至85℃，转移至配置锅中与混合物A和混合物B混合，预乳化10min，然后降温至75℃均质乳化3min，真空降温至60℃，搅拌3min，随后再次真空降温至45℃，均质3min，得到混合物C；
(3)于混合物C中加入抗菌剂和含有蜗牛发酵滤液的组合物，脱气并冷却，降温到3538℃，放置陈化24h以上，灌装。
实施例10
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例2中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
实施例11
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例3中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
实施例12
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例4中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
实施例13
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例5中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
实施例14
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例6中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
实施例15
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例7中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
实施例16
一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：
所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例8中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。
性能测试
1、理化性能：通过对1号蜗牛黏液、2号蜗牛黏液、3号蜗牛黏液极性理化分析，具体结果见表1。
表1 1号、2号、3号蜗牛黏液的理化性能测试结果
注：+++较厚重；++厚重；+溶液较稀
由表可知，三种方式制备的蜗牛黏液其理化特性存在显著差异，其中经过水煮的光亮大蜗牛所制备的蜗牛黏液物质干重及其粘度最大。
2、酪氨酸酶抑制率测定：对1号、2号、3号蜗牛黏液、实施例1-4所得组合物、实施例10-11、实施例15-16进行测试。
用开水将待测样品按照1/50(w/v)混合搅拌3min，然后，超声处理10min并置于冰浴上5min。将悬浮液在4000×g下，离心20min，收集上清液用于检测。并按照表2样品添加进行检测，以0.2mg/mL曲酸作为阳性对照，在475nm处测定吸光度，并按照下式计算酪氨酸酶抑制率。
具体结果见表3。
表2样品加液要求
表3 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品酪氨酸抑制率测试结果。
样品 酪氨酸酶抑制率(％)
1号蜗牛黏液 3.3±0.61
2号蜗牛黏液 5.5±0.17
3号号蜗牛黏液 8.0±1.12
实施例1 40.0±0
实施例2 66.7±0
实施例3 55.0±7.07
实施例4 45.0±7.07
实施例10 25.3±0.0
实施例11 22.0±0.1
实施例15 4.2±0.0
实施例16 8.8±0.5
由表3可知，经过发酵后所制备的蜗牛黏液，其酪氨酸酶抑制率显著提升，不同实施例所制备得到的蜗牛发酵滤液均具有良好的酪氨酸酶抑制活性。
3、抑制舒缓刺激评价：对1号、2号、3号蜗牛黏液、实施例2-3、实施例9-11、实施例15-16进行测试。
(1)皮肤刺激损伤
为确保达到相同损伤效果，针对男女皮肤的差异性，前期对不同浓度的十二烷基硫酸钠(SLS)进行男性/女性刺激，最后女性受试者选择采用1％浓度的SLS，男性受试者选择5％浓度作为研究刺激性接触性皮炎的经典模型。
(2)斑贴实验
刺激前，测试手前臂内侧划定区域内皮肤酸碱度pH值，经表皮失水量，皮肤红色素含量以及皮肤图像拍摄。对手前臂内侧划定区域用质量分数1％，5％的SLS溶液做封闭型斑贴实验24h诱导红斑。24h后去除手臂上的斑试器，6h后测量前臂斑贴位的皮肤参数。
(3)产品使用
A、舒缓刺激：在试验规定时间内，受试者在前臂刺激部位，早晚使用测试产品。分别在使用测试产品后不同时间段测试手前臂斑贴部位皮肤参数，包括皮肤经表皮失水量，皮肤红色素含量以及皮肤图像拍摄。
B、抑制刺激：将检测样品与一定浓度的(SLS)按照1：1的比例混匀，对受试者进行24h封闭型斑贴实验，测试揭掉斑贴器6h，48h后的皮肤参数。分别在使用测试产品后在规定时间测试手前臂斑贴部位皮肤参数，包括皮肤经表皮失水量，皮肤红色素含量以及皮肤图像拍摄。
(4)功效测试
分别在使用测试产品后在规定时间测试手前臂斑贴部位皮肤参数，包括皮肤经表皮失水量，皮肤红色素含量以及皮肤图像拍摄。
(5)结果分析
由图3和4结果分析可知，在经过SLS刺激损伤后，皮肤表皮失水量显著升高，皮肤红色值显著升高。在47h时，3号蜗牛黏液作用的皮肤表皮失水量和红值开始改善，其中蜗牛黏液1号和2号开始起效时间为55h，说明与其他两种方式相比，水煮所制备的蜗牛黏液舒缓修复效果较好。
由图5和6可知，与未发酵蜗牛黏液相比，蜗牛发酵滤液组合物及产品对人体皮肤已经产生的刺激具备显著的舒缓修复效果，如图7所示，在摘掉斑贴器后6h，皮肤出现红斑并伴有红肿出现，用药23h后，皮肤逐渐退红，皮肤颜色加深，红肿减弱，47h后皮肤的红斑现象显著改善，皮肤有结痂现象，与未发酵的蜗牛黏液对比发现，使用蜗牛发酵滤液产品，由于其较好的修复效果，皮肤颜色变黄，皮肤变亮，逐渐恢复为正常肤色状态，119h后皮肤状态与正常皮肤状态接近，改善效果最为显著。
由图8和9可知，与未发酵蜗牛黏液对比，蜗牛发酵滤液产品，在抑制刺激方面，在受到刺激时可有效降低刺激带来的皮肤红值提升和经皮失水率升高的问题。如图10所示，揭掉斑贴器6h、48h后的表皮失水量以及红值进行分析比较，由图结果显示，样品6h时，红值达到最大值，但是经过48h后，红值显著降低，皮肤肤色变浅，与正常肤色相近，所以，蜗牛发酵滤液产品具有一定的抑制刺激的作用。

Claims (5)

1.一种蜗牛发酵滤液的制备方法，其特征在于，包括：
S1.发酵滤液的制备：将高活性菌种的菌悬液加入到培养基中，在30-37℃，120-230rpm条件下培养19-23h制备得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在30-37℃，100-230rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用；
S2.蜗牛黏液的制备：将收集到的蜗牛黏液经在4000rpm-5000rpm下离心8-15min并收集上清液，在冰箱中储存备用；
S3.蜗牛发酵滤液的制备：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液进行混合，调节混合液体的pH，并进行酶解反应，随后在4000rpm-5000rpm下离心5-15min，收集上清液，即得；
所述菌悬液的浓度采用分光光度法测定，具体值为OD600nm＝4.5-5.5；
所述菌种为植物乳杆菌，所述培养基为MRS肉汤培养基，具体配制方法为：将肉汤培养基的混合固体粉末取52 .5g溶于1000mL去离子水中，调节pH至5.0-6.0，然后在121℃灭菌锅中灭菌15min，并在-4℃冰箱储存备用；
所述蜗牛黏液的收集方法选自水煮收集、自然滴落收集、水洗收集中的任意一种；所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为(1-4)：1。
2.根据权利要求1所述的一种蜗牛发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述种子液在接种到发酵液中的接种量为180-240μL/30mL；所述发酵时间为24-72h。
3.一种含有由根据权利要求1-2任一项所述的蜗牛发酵滤液的制备方法得到的蜗牛发酵滤液的组合物，其特征在于，还包括多元醇和去离子水；所述多元醇选自1,2-己二醇、1,3-丁二醇、乙基己基甘油中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，其特征在于，所述多元醇至少包括1,2-己二醇和乙基己基甘油；所述1,2-己二醇和乙基己基甘油的重量比为(35-60)：1。
5.一种根据权利要求3或4所述的含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，其特征在于，所述护肤品包括精华水、乳液、精华液、乳霜、面膜中的任意一种。
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