CN114480549A - 一种由蜗牛制备生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种由蜗牛制备生物活性肽及其制备方法和应用，属于活性肽技术领域。包括：S1.蜗牛的处理；S2.蜗牛酶的制备；S3.蜗牛肉碎的制备；S4.蜗牛酶酶解；S5.护色处理；S6.复合酶酶解；S7.培养基的制备；S8.菌种的活化；S9.发酵；S10.络合。本发明制得的生物活性肽能促进体内环境平衡、提高机体免疫功能、提高氧化应激和提高抗衰老活性，抑制炎症因子产生，还能明显起到抗肿瘤的效果，具有极好的生理活性，有广阔的应用前景。

Description

一种由蜗牛制备生物活性肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及活性肽技术领域，具体涉及一种由蜗牛制备生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
蜗牛属腹足纲陆生软体动物，具有很高的食用和药用价值。中国普遍养殖的品种有白玉蜗牛，其黏液中主要含有胶原蛋白、尿囊素、硫酸软骨素、维生素、天然抗菌肽等活性成分。其中尿囊素可以使皮肤再生；蛋白质和维生素可以增加皮肤的营养，使肌肤更加细腻和光滑。目前，对蜗牛产品的应用开发多数集中在食品和化妆品领域，对其研究主要是多糖、蜗牛酶、分泌物的提取方面，但未见有化妆品级蜗牛黏液提取物的研究报道。
《热带病与寄生虫学》2005年第3卷第3期公开发表的“江西巴蜗牛活性成分提取方法的比较研究”报道了天螺多糖提取方法。《中国生化药物杂志》1993年第2期公开发表的“蜗牛酶的研制及应用”报道了从蜗牛消化腺提取蜗牛酶的方法。中国发明专利CN201210292779.X公开了一种蜗牛粘液的提取方法，采用瞬间电击蜗牛足部，收集蜗牛足腺分泌的粘液，然后通过冷冻干燥得到蜗牛分泌物。目前对蜗牛研究报道多数集中在多糖、蜗牛酶、蜗牛粘液等方面的提取，未见含有胶原蛋白、小分子多肽等成分的化妆品级蜗牛黏液提取物的制备工艺方面的研究报道，而蜗牛蛋白制备的生物活性肽具有安全性、生物相容性以及极好的生理活性，将具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明提出一种由蜗牛制备生物活性肽及其制备方法和应用，制得的生物活性肽能促进体内环境平衡、提高机体免疫功能、提高氧化应激和提高抗衰老活性，抑制炎症因子产生，还能明显起到抗肿瘤的效果，具有极好的生理活性。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种由蜗牛蛋白制备生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入缓冲液，粉碎，离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入水和步骤S2制得的蜗牛酶，酶解，加入乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入柠檬酸、白藜芦醇和半胱氨酸，调节产物pH值，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向步骤S5制得的混合物中加入复合酶，酶解，得到复合酶酶解产物；
S7.培养基的制备：将氮源、碳源、维生素、矿物质和水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，第一次培养，分别培养成菌种种子液，分别接种于步骤S7制得的培养基中，第二次培养，将三个培养基等体积混合并稀释得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入步骤S8制得的复合发酵菌液，发酵，离心，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成水溶液，加入锌盐，反应，冷冻干燥，得到生物活性肽。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述缓冲液为pH值为5.5-6的磷酸缓冲液；所述内脏和缓冲液的质量体积比为1：(3-5)g/mL；所述浓缩采用孔径为1000-2000D的超滤膜浓缩至相对水的密度为2-4；步骤S4中所述蜗牛肉碎、水和蜗牛酶的质量比为50：(75-100)：(2-5)；所述酶解条件为35-45℃酶解1-2h。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述蜗牛酶酶解产物、柠檬酸、白藜芦醇和半胱氨酸的质量比为100：(3-12)：(1-3)：(1-4)；所述pH值调节为5-5.5；步骤S6中所述复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为(5-10)：(3-7)：(1-2)；所述混合物和复合酶的质量比为100：(2-5)；所述酶解条件为40-60℃，酶解1-3h。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述氮源选自蛋白胨、鱼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母粉、氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸中的一种或几种混合；所述碳源选自糖蜜、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的一种或几种混合；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E、维生素K中的一种或几种混合；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种或几种混合；所述氮源、碳源、维生素、无机盐和无菌水的质量比为(4-10)：(7-20)：(0.15-0.3)：(0.5-1.5)：100；所述调节培养基pH值为6.5-7.2。
作为本发明的进一步改进，步骤S8中所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为(3-5)：(2-4)：(1-3)；所述第一次培养条件为35-40℃，湿度为60-70％，培养时间为12-24h；所述第二次培养条件为35-40℃，湿度为70-80％，培养时间为24-36h；所述菌种种子液的含菌量为107-108cfu/mL；所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为2-4％、1-3％、0.7-1.2％；所述稀释倍数为100-200倍。
作为本发明的进一步改进，步骤S9中所述复合酶酶解产物和复合发酵菌液的质量比为(5-12)：50；所述发酵条件为35-40℃，培养时间为24-48h。
作为本发明的进一步改进，步骤S10中所述锌盐为硫酸锌、氯化锌、硝酸锌和醋酸锌中的至少一种；所述水溶液中发酵冻干粉的质量百分比为7-12％；所述水溶液和锌盐的质量比为100：(2-5)；所述反应条件为pH值为6.2-6.7，时间为1-2h，温度为45-55℃。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.5-6的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：(3-5)g/mL，粉碎，离心，取上清液，采用孔径为1000-2000D的超滤膜浓缩至相对水的密度为2-4，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入75-100重量份水和2-5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，35-45℃酶解1-2h，采用1000-2000W的微波辐照20-30min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入3-12重量份柠檬酸、1-3重量份白藜芦醇和1-4重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5-5.5，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入2-5重量份复合酶，40-60℃酶解1-3h，采用1000-2000W的微波辐照20-30min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为(5-10)：(3-7)：(1-2)；
S7.培养基的制备：将氮源、碳源、维生素、矿物质和水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.5-7.2，紫外线灭菌，得到培养基；所述氮源、碳源、维生素、无机盐和无菌水的质量比为(4-10)：(7-20)：(0.15-0.3)：(0.5-1.5)：100；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为(3-5)：(2-4)：(1-3)，温度为35-40℃，湿度为60-70％，培养12-24h，分别培养成菌种种子液，含菌量为107-108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为2-4％、1-3％、0.7-1.2％，温度为35-40℃，湿度为70-80％，培养24-36h，将三个培养基等体积混合并稀释100-200倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向5-12重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，35-40℃发酵24-48h，离心，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成7-12％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：(2-5)，pH值为6.2-6.7，温度为45-55℃，搅拌时间为1-2h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的生物活性肽。
本发明进一步保护一种上述的生物活性肽在制备抗氧化、抗肿瘤产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：本发明通过直接将蜗牛的内脏处理得到蜗牛酶，其含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等二十多种混合酶，直接将其酶解蜗牛肉，得到的蜗牛酶酶解产物将蜗牛蛋白中复杂的三级结构酶解成二级结构蛋白、寡肽甚至是短肽、氨基酸结构，以及多糖类物质，经过乙醇沉淀过滤后，去除大部分多糖物质，得到的蜗牛酶酶解产物含有大量的二级结构蛋白、寡肽甚至是短肽以及氨基酸；
本发明通过添加柠檬酸、白芦藜醇和半胱氨酸，能有效控制蛋白质后续发生美拉德反应，减缓反应带来的不必要的颜色变化，避免褐变，从而起到很好的护色效果，还能改善蜗牛酶酶解产物的口感和香气，最终得到色泽浅、风味好的生物活性肽。三者通过调节pH值、抗氧化反应以及络合反应等方法控制美拉德反应，从而得到更好的效果，三者的添加具有协同增效的作用；
进一步，本发明通过Flavourzyme风味酶酶解后，进一步能水解多肽芳香侧链或长链烷基侧链末端的疏水氨基酸从而消除苦味、腥味；通过胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶进一步混合物中的把蛋白质酶切成小分子多肽或者是氨基酸，得到分子量更小的蛋白质、寡肽、短肽等活性蛋白，胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶的添加具有协同增效的作用；
接着，将复合酶酶解产品经过动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌三种复合菌发酵后，能够产生大量的具有几个氨基酸组成的活性短肽物质，该类短肽物质不仅具有很好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤的活性，还极易被人体吸收，避免进入人体后被降解，从而起到更高效的生物活性；
将制得的发酵冻干粉与Zn离子络合后，得到一种短肽与金属离子络合的复合物，进一步提高了该活性肽的生理活性，进入人体后能在适当的生理环境中释放微量元素Zn离子，促进体内环境平衡、提高机体免疫功能、提高氧化应激和提高抗衰老活性，抑制炎症因子产生，还能明显起到抗肿瘤的效果，因此，本发明制得的生物活性肽具有极好的生理活性，有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例3中各组羟基自由基清除率对比图；
图2为本发明测试例3中各组超氧阴离子清除率对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
蜗牛，为白玉蜗牛，购自北京市海淀区四道口水产批发市场；胃蛋白酶，CAS号9001-75-6，购于默克中国公司，来源于猪胃黏膜，400-800units/mg protein，35kDa；protamex复合蛋白酶，活力1.5Au/g，购于诺维信(中国)生物技术有限公司；Flavourzyme风味酶，20-40u/mg，购于上海艾研生物科技有限公司；动物双歧杆菌，大于100亿cfu/g，购于西安天广源生物科技有限公司；嗜酸乳杆菌，大于100亿cfu/g，购于山东萍聚生物科技有限公司；青春双歧杆菌，大于1000亿cfu/g，购于西安冰禾生物科技有限责任公司。
实施例1
本实施例提供一种由蜗牛蛋白制备生物活性肽的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.5的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：3g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1000D的超滤膜浓缩至相对水的密度为2，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入75重量份水和2重量份步骤S2制得的蜗牛酶，35℃酶解1h，采用1000W的微波辐照20min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入5重量份柠檬酸、1重量份白藜芦醇和1重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.5，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入2重量份复合酶，40℃酶解1h，采用1000W的微波辐照20min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为5：3：1；
S7.培养基的制备：将2重量份玉米浆、2重量份硝酸铵、5重量份果糖、2重量份淀粉、0.05重量份维生素A、0.05重量份维生素K、0.05重量份维生素B12、0.3重量份氯化钠、0.1重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.5，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为3：2：1，温度为35℃，湿度为60％，培养12h，分别培养成菌种种子液，含菌量为107cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为2％、1％、0.7％，温度为35℃，湿度为70％，培养24h，将三个培养基等体积混合并稀释100倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向5重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，35℃发酵24h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成7％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：2，pH值为6.2，温度为45℃，500r/min搅拌1h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
实施例2
本实施例提供一种由蜗牛蛋白制备生物活性肽的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为6的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：5g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为2000D的超滤膜浓缩至相对水的密度为4，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入100重量份水和5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，45℃酶解2h，采用2000W的微波辐照30min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入12重量份柠檬酸、3重量份白藜芦醇和4重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入5重量份复合酶，60℃酶解3h，采用2000W的微波辐照30min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为10：7：2；
S7.培养基的制备：将5重量份鱼粉、5重量份尿素、12重量份葡萄糖、8重量份乳糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素A、0.1重量份维生素D、1重量份氯化钾、0.2重量份氯化铜、0.2重量份氯化锰、0.1重量份硫酸锌和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为7.2，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为5：4：3，温度为40℃，湿度为70％，培养24h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为4％、3％、1.2％，温度为40℃，湿度为80％，培养36h，将三个培养基等体积混合并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向12重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，40℃发酵48h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成12％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：5，pH值为6.7，温度为55℃，500r/min搅拌2h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
实施例3
本实施例提供一种由蜗牛蛋白制备生物活性肽的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸、2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向7重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
实施例4
与实施例3相比，复合酶为胃蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为12：1.5，其他条件均不改变。
实施例5
与实施例3相比，复合酶为protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为12：1.5，其他条件均不改变。
对比例1
与实施例3相比，未进行步骤S2、S4，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S3.护色处理：向100重量份步骤S2制得的蜗牛肉碎中加入7重量份柠檬酸、2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S4.复合酶酶解：向100重量份步骤S3制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S5.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S6.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S5制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S7.发酵：向7重量份步骤S4得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S6制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S8.络合：将步骤S7制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例2
与实施例3相比，步骤S5中未添加白藜芦醇，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸和5重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向7重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例3
与实施例3相比，步骤S5中未添加半胱氨酸，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸、5重量份白藜芦醇，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向7重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例4
与实施例3相比，步骤S5中未添加柠檬酸，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向7重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例5
与实施例3相比，未进行步骤S5，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.复合酶酶解：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S6.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S7.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S6制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S8.发酵：向7重量份步骤S5得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S7制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S9.络合：将步骤S8制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例6
与实施例3相比，未进行步骤S6，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸、2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S7.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S6制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S8.发酵：向7重量份步骤S5得到的混合物中加入50重量份步骤S7制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S9.络合：将步骤S8制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例7
与实施例3相比，步骤S8中菌种活化仅包括嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸、2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为7：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为5％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将二个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向7重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例8
与实施例3相比，步骤S8中菌种活化仅包括动物双歧杆菌和青春双歧杆菌，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸、2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌和青春双歧杆菌的质量比为7：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为5％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将二个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向7重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例9
与实施例3相比，未进行步骤S7、S8、S9，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸、2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.络合：将步骤S6制得的复合酶酶解产物配制成10％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：3.5，pH值为6.5，温度为50℃，500r/min搅拌1.5h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
对比例10
与实施例3相比，未进行步骤S10，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.7的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：4g/mL，采用绞肉机粉碎，3000r/min离心15min，取上清液，采用孔径为1500D的超滤膜浓缩至相对水的密度为3，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉采用绞肉机粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入85重量份水和3.5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，40℃酶解1.5h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入7重量份柠檬酸、2重量份白藜芦醇和3重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5.2，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入3.5重量份复合酶，50℃酶解2h，采用1500W的微波辐照25min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为7：5：1.5；
S7.培养基的制备：将1重量份尿素、4重量份蛋白胨、1重量份甘氨酸、1重量份丝氨酸、6重量份葡萄糖、6重量份麦芽糖、0.1重量份维生素C、0.1重量份维生素B1、0.5重量份重量份氯化钠、0.2重量份硫酸铜、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌、0.1重量份氯化铁和100重量份水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.9，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为4：3：2，温度为37℃，湿度为65％，培养18h，分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为3％、2％、1％，温度为37℃，湿度为75％，培养30h，将三个培养基等体积混合并稀释150倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向7重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，37℃发酵36h，3000r/min离心15min，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉。
测试例1
将本发明实施例1-5和对比例1-8、10中制得的发酵冻干粉，对比例9制得的复合酶酶解产物进行可溶性蛋白、多肽以及氨基酸含量测定，结果见表1。
可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法(Bradford)测定；小于10kDa多肽含量采用OPA法测定；氨基酸参照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》测定，算出其总含量。具体测试方法参考文献：吴寒，芮昕，李春阳，等.多菌种固态发酵法提高燕麦全谷物的蛋白质营养品质[J].食品科学，2018，39(16)：168-175.
表1
组别 可溶性蛋白含量(mg/g) 小于10kDa的多肽含量(mg/g) 氨基酸含量(mg/g)
实施例1组 325 302 135
实施例2组 357 325 152
实施例3组 372 355 170
实施例4组 298 275 102
实施例5组 300 271 105
对比例1组 275 210 87
对比例2组 310 292 127
对比例3组 312 290 125
对比例4组 314 294 124
对比例5组 307 287 121
对比例6组 220 187 75
对比例7组 290 245 89
对比例8组 287 237 81
对比例9组 279 202 70
对比例10组 318 295 130
由上表可知，本发明实施例1-3制得的发酵冻干粉中可溶性蛋白、多肽以及氨基酸含量高。
测试例2
将本发明实施例1-5和对比例1-8、10中制得的发酵冻干粉，对比例9制得的复合酶酶解产物进行护色效果、去腥效果、去苦效果测试，结果见表2。
表2
组别 护色效果 去腥效果 去苦效果
实施例1组 ++ + +
实施例2组 + + +
实施例3组 + + +
实施例4组 ++ + ++
实施例5组 + ++ +
对比例1组 ++ ++ +++
对比例2组 +++++ ++ +++
对比例3组 ++ ++ ++++++
对比例4组 +++ ++++++ ++++++
对比例5组 +++++ ++++++ ++++++
对比例6组 ++ ++ ++
对比例7组 + +++ +++
对比例8组 ++ +++ +++
对比例9组 +++ +++ +++
对比例10组 + + +
其中，+越多，表述颜色越深，或腥味越重，或苦味越重。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的发酵冻干粉的制备方法能起到良好的护色、去腥、去苦的效果。
测试例3抗氧化能力考察
1、清除羟基自由基能力测定：
采用Fenton体系，进行清除羟基自由基能力测定的实验。
在25℃下，按照表3向具塞试管中加入FeSO4溶液、EDTA溶液；然后加入a-脱氧核糖溶液DR，然后加入实施例1-5或对比例1-10中制得的生物活性肽，并用PBS补充至1.8mL，最后加入过氧化氢溶液，37℃水浴1h，以苯甲酸和抗坏血酸为对照；加入三氯乙酸终止反应，在加入硫代巴比妥酸，混匀后沸水浴中加热10min，冷却后取上清，于532nm处测定吸光度。见表3。
表3羟基自由基清除实验体系(单位：mL)
对照组 样品组 苯甲酸组 抗坏血酸组
FeSO<sub>4</sub>(10mM) 0.1 0.1 0.1 0.1
EDTA(10mM) 0.1 0.1 0.1 0.1
DR(20mM) 0.2 0.2 0.2 0.2
受试样品(0.5mg/mL) 0 0.2 0 0
苯甲酸(1mg/mL) 0 0 0.2 0
抗坏血酸(1mg/mL) 0 0 0 0.2
PBS 1.4 1.2 1.2 1.2
过氧化氢(10mM) 0.2 0.2 0.2 0.2
10％的三氯乙酸 1 1 1 1
1％的硫代巴比妥酸 1 1 1 1
羟基自由基的清除率％＝(A对照-A样品)/A对照*100％；
测试结果见图1。
2、清除超氧阴离子自由基能力测定
采用邻苯三酚自氧化的方法进行清除超氧阴离子自由基能力的测定。
在25℃下，按照表4中从上到下的顺序和用量加入试剂，迅速混匀后，离心后取上清，于420nm处测定吸光度。
受试样品为：实施例1-5或对比例1-10中制得的生物活性肽(0.5mg/mL)或者抗坏血酸(0.5mg/mL)
表4超氧阴离子清除率实验体系(单位mL)
试剂 空白组 自氧化 样品管
Tris-HCI-EDTA缓冲液(pH8.2) 1.5 1.5 1.5
受试样品 0 0 0.1
水 0 1.4 1.3
邻苯三酚(30mM) 0 0.1 0.1
10mM盐酸 1.5 0 0
超氧阴离子清除率％＝ΔOD420/min(自氧化)-ΔOD420/min(样品管)/ΔOD420/min(自氧化)*100％。
测试结果见图2。
由上图可知，本发明实施例1-3制得的生物活性肽具有良好的抗氧化活性。
测试例4抗肿瘤小鼠试验
将170只ICR小鼠随机分为17组，分别为模型组、阳性药组、实施例1-5组和对比例1-10组，每组10只。将小鼠S180细胞用PBS稀释至1×107个/ml的细胞悬液后接种到小鼠右上肢腋下皮下，每只ICR小鼠接种0.2ml，整个操作在30min内完成。实施例1-5组和对比例1-10组灌胃实施例1-5和对比例1-10制得的生物活性肽，给药量为2mg/kg，给药体积为0.2mL/20g。空白对照组与模型组灌胃等体积饮用水。阳性药组为顺铂2mg/kg，给药体积为0.2mL/20g，隔日一次，共给药6次。接种第十二天，处死小鼠，测量小鼠瘤重，并计算抑瘤率(％)。
抑瘤率(％)＝[模型组小鼠瘤重(g)-该组小鼠瘤重(g)]/模型组小鼠瘤重(g)*100％。
结果见表5。
表5
Figure BDA0003563427390000281
Figure BDA0003563427390000291
注释：*表示，与模型组比较，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的生物活性肽具有良好的抗肿瘤活性。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为胃蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为12：1.5；或者复合酶为protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为12：1.5；对比例6与实施例3相比，未进行步骤S6复合酶酶解步骤；各组的可溶性蛋白、小于10kDa肽以及氨基酸含量下降，且制得的蛋白-锌复合物的抗氧化、抗肿瘤效果下降。本发明通过Flavourzyme风味酶酶解后，进一步能水解多肽芳香侧链或长链烷基侧链末端的疏水氨基酸从而消除苦味、腥味；通过胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶进一步混合物中的把蛋白质酶切成小分子多肽或者是氨基酸，得到分子量更小的蛋白质、寡肽、短肽等活性蛋白，胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶的添加具有协同增效的作用。
对比例1与实施例3相比，未进行步骤S2、S4，表明没有进行蜗牛酶酶解处理，其可溶性蛋白、小于10kDa肽以及氨基酸含量下降，且制得的蛋白-锌复合物的抗氧化、抗肿瘤效果下降。本发明通过直接将蜗牛的内脏处理得到蜗牛酶，其含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等二十多种混合酶，直接将其酶解蜗牛肉，得到的蜗牛酶酶解产物将蜗牛蛋白中复杂的三级结构酶解成二级结构蛋白、寡肽甚至是短肽、氨基酸结构，以及多糖类物质，经过乙醇沉淀过滤后，去除大部分多糖物质，得到的蜗牛酶酶解产物含有大量的二级结构蛋白、寡肽甚至是短肽以及氨基酸。
对比例2、3、4与实施例3相比，步骤S5中未添加白藜芦醇、半胱氨酸或柠檬酸，对比例2中护色效果明显下降；对比例3中去苦效果明显下降；对比例4中去苦、去腥效果明显下降；对比例5与实施例3相比，未进行步骤S5护色处理步骤，其护色、去苦、去腥效果明显下降；本发明通过添加柠檬酸、白芦藜醇和半胱氨酸，能有效控制蛋白质后续发生美拉德反应，减缓反应带来的不必要的颜色变化，避免褐变，从而起到很好的护色效果，还能改善蜗牛酶酶解产物的口感和香气，最终得到色泽浅、风味好的生物活性肽。三者通过调节pH值、抗氧化反应以及络合反应等方法控制美拉德反应，从而得到更好的效果，三者的添加具有协同增效的作用。
对比例7、8与实施例3相比，步骤S8中菌种活化仅包括嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌或者动物双歧杆菌和青春双歧杆菌；两组小于10kDa肽以及氨基酸含量下降，且制得的蛋白-锌复合物的抗氧化、抗肿瘤效果下降；对比例9与实施例3相比，未进行步骤S7、S8、S9，表明没有经过发酵步骤，小于10kDa肽以及氨基酸含量明显下降，且制得的蛋白-锌复合物的抗氧化、抗肿瘤效果也明显下降；本发明将复合酶酶解产品经过动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌三种复合菌发酵后，能够产生大量的具有几个氨基酸组成的活性短肽物质，该类短肽物质不仅具有很好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤的活性，还极易被人体吸收，避免进入人体后被降解，从而起到更高效的生物活性。
实施例10与实施例3相比，未进行步骤S10，表明制得的发酵冻干粉主要为蛋白质物质，没有经过与Zn离子复合形成蛋白-锌复合物。其抗氧化、抗肿瘤效果明显下降，本发明将制得的发酵冻干粉与Zn离子络合后，得到的短肽与金属离子络合的复合物，进一步提高了该活性肽的生理活性，进入人体后能在适当的生理环境中释放微量元素Zn离子，促进体内环境平衡、提高机体免疫功能、提高氧化应激和提高抗衰老活性，抑制炎症因子产生，还能明显起到抗肿瘤的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种由蜗牛蛋白制备生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入缓冲液，粉碎，离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入水和步骤S2制得的蜗牛酶，酶解，加入乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入柠檬酸、白藜芦醇和半胱氨酸，调节产物pH值，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向步骤S5制得的混合物中加入复合酶，酶解，得到复合酶酶解产物；
S7.培养基的制备：将氮源、碳源、维生素、矿物质和水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值，紫外线灭菌，得到培养基；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，第一次培养，分别培养成菌种种子液，分别接种于步骤S7制得的培养基中，第二次培养，将三个培养基等体积混合并稀释得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入步骤S8制得的复合发酵菌液，发酵，离心，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成水溶液，加入锌盐，反应，冷冻干燥，得到生物活性肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述缓冲液为pH值为5.5-6的磷酸缓冲液；所述内脏和缓冲液的质量体积比为1：(3-5)g/mL；所述浓缩采用孔径为1000-2000D的超滤膜浓缩至相对水的密度为2-4；步骤S4中所述蜗牛肉碎、水和蜗牛酶的质量比为50：(75-100)：(2-5)；所述酶解条件为35-45℃酶解1-2h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述蜗牛酶酶解产物、柠檬酸、白藜芦醇和半胱氨酸的质量比为100：(3-12)：(1-3)：(1-4)；所述pH值调节为5-5.5；步骤S6中所述复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为(5-10)：(3-7)：(1-2)；所述混合物和复合酶的质量比为100：(2-5)；所述酶解条件为40-60℃，酶解1-3h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述氮源选自蛋白胨、鱼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母粉、氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸中的一种或几种混合；所述碳源选自糖蜜、阿拉伯糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的一种或几种混合；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E、维生素K中的一种或几种混合；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种或几种混合；所述氮源、碳源、维生素、无机盐和无菌水的质量比为(4-10)：(7-20)：(0.15-0.3)：(0.5-1.5)：100；所述调节培养基pH值为6.5-7.2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S8中所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为(3-5)：(2-4)：(1-3)；所述第一次培养条件为35-40℃，湿度为60-70％，培养时间为12-24h；所述第二次培养条件为35-40℃，湿度为70-80％，培养时间为24-36h；所述菌种种子液的含菌量为107-108cfu/mL；所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为2-4％、1-3％、0.7-1.2％；所述稀释倍数为100-200倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S9中所述复合酶酶解产物和复合发酵菌液的质量比为(5-12)：50；所述发酵条件为35-40℃，培养时间为24-48h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S10中所述锌盐为硫酸锌、氯化锌、硝酸锌和醋酸锌中的至少一种；所述水溶液中发酵冻干粉的质量百分比为7-12％；所述水溶液和锌盐的质量比为100：(2-5)；所述反应条件为pH值为6.2-6.7，时间为1-2h，温度为45-55℃。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛的处理：将蜗牛洗净，去壳，分离内脏和蜗牛肉；
S2.蜗牛酶的制备：向步骤S1得到的内脏中加入pH值为5.5-6的磷酸缓冲液，内脏和缓冲液的质量体积比为1：(3-5)g/mL，粉碎，离心，取上清液，采用孔径为1000-2000D的超滤膜浓缩至相对水的密度为2-4，冷冻干燥，得到蜗牛酶；
S3.蜗牛肉碎的制备：将蜗牛肉粉碎，得到蜗牛肉碎；
S4.蜗牛酶酶解：向50重量份步骤S3得到的蜗牛肉碎中加入75-100重量份水和2-5重量份步骤S2制得的蜗牛酶，35-45℃酶解1-2h，采用1000-2000W的微波辐照20-30min灭酶，加入等体积乙醇沉淀，过滤，得到蜗牛酶酶解产物；
S5.护色处理：向100重量份步骤S4制得的蜗牛酶酶解产物中加入3-12重量份柠檬酸、1-3重量份白藜芦醇和1-4重量份半胱氨酸，调节产物pH值为5-5.5，得到混合物；
S6.复合酶酶解：向100重量份步骤S5制得的混合物中加入2-5重量份复合酶，40-60℃酶解1-3h，采用1000-2000W的微波辐照20-30min灭酶，得到复合酶酶解产物；复合酶为胃蛋白酶、protamex复合蛋白酶和Flavourzyme风味酶，质量比为(5-10)：(3-7)：(1-2)；
S7.培养基的制备：将氮源、碳源、维生素、矿物质和水混合溶解，用PBS溶液调节培养基pH值为6.5-7.2，紫外线灭菌，得到培养基；所述氮源、碳源、维生素、无机盐和无菌水的质量比为(4-10)：(7-20)：(0.15-0.3)：(0.5-1.5)：100；
S8.菌种的活化：将动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌分别接种于高氏培养基中，所述动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的质量比为(3-5)：(2-4)：(1-3)，温度为35-40℃，湿度为60-70％，培养12-24h，分别培养成菌种种子液，含菌量为107-108cfu/mL，分别接种于步骤S7制得的培养基中，动物双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌的接种量分别为2-4％、1-3％、0.7-1.2％，温度为35-40℃，湿度为70-80％，培养24-36h，将三个培养基等体积混合并稀释100-200倍得到复合发酵菌液；
S9.发酵：向5-12重量份步骤S6得到的复合酶酶解产物中加入50重量份步骤S8制得的复合发酵菌液，35-40℃发酵24-48h，离心，取上清液，冷冻干燥，得到发酵冻干粉；
S10.络合：将步骤S9制得的发酵冻干粉配制成7-12％的水溶液，加入锌盐，水溶液和锌盐的质量比为100：(2-5)，pH值为6.2-6.7，温度为45-55℃，搅拌时间为1-2h，冷冻干燥，得到生物活性肽。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的生物活性肽。
10.一种如权利要求9所述的生物活性肽在制备抗氧化、抗肿瘤产品中的应用。
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