CN111778305B - 一种用于提高免疫力的脾多肽组合物及口服液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及脾多肽制品技术领域，具体公开一种用于提高免疫力的脾多肽组合物以及其制备的口服液。所述脾多肽组合物由动物脾脏经细胞破碎、酶解、脱脂和过滤等工序制得，有效成分含量高，脂肪含量低，具有提高免疫力功效，且使用安全，无健康隐患。由所述脾多肽组合物和酪蛋白或其盐制成的脾多肽口服液，提高免疫力、抗肿瘤及抗肺炎等功效得到了进一步的提高，并且具有良好的贮存稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及脾多肽制品技术领域，具体涉及一种用于提高免疫力的脾多肽组合物及口服液。
背景技术
脾又称沙肝，是动物体的重要脏器，猪、牛、羊等家畜的脾脏中含有多种营养物质，自古以来就作为药食同源食品，具有极高的食疗价值。现代工艺中多将脾脏进行提取得到脾多肽，脾多肽是一种多肽组合物，包含多种小分子肽以及氨基酸和核苷酸，对人体的免疫系统有积极的作用。
脾脏中虽然具有丰富的营养物质，但也含有大量的脂肪和胆固醇，例如每100g猪脾中脂肪和胆固醇的含量就分别达到2.6g和363mg。胆固醇的大量摄取易导致血液胆固醇含量升高，从而引起动脉粥样硬化、心肌梗塞和冠心病等疾病的发生；短期内密集食用高脂肪食物可能影响脑力，长期摄入高脂肪膳食不仅会堵塞动脉血管，还会损害大脑的功能，更容易造成听觉损害而导致听力减退。因此，从脾脏中提取脾多肽时如何高效脱除脂肪和胆固醇对于脾多肽产品的质量和功效具有重要的意义。
发明内容
针对以上技术现状，本发明提供一种用于提高免疫力的脾多肽组合物，并提供由该脾多肽组合物制成的口服液。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种用于提高免疫力的脾多肽组合物，采用以下方法制备得到：取哺乳动物脾脏，进行细胞破碎后得细胞破碎液，然后加入蛋白酶进行水解，水解结束后在水解液中加入脱脂剂以脱除脂肪和胆固醇，最后去除脱脂剂，得所述脾多肽组合物溶液；所述细胞破碎是先将所述哺乳动物脾脏机械粉碎至粒径500μm以下，然后采用冻融法进行冷冻处理，反复粉碎、冻融过程，完成细胞破碎，所述冻融法的冷冻温度-80~-40℃，融化温度0~20℃，反复粉碎、冻融次数0～3次；所述脱脂剂为高岭土、硅藻土或β-环状糊精，其用量为所述水解液质量的1-9%。
本发明制备得到的脾多肽组合物具有免疫调节功效，以特定的方式刺激免疫细胞，增强免疫应答功能，维持正常、适度的免疫反应，具有显著的提高免疫力的功效，且对于儿童呼吸道疾病、肺炎以及癌症等均具有明显的效果，可用于制备相关功能的食品、保健食品或药品。采用特定条件进行细胞破碎，再选择特定的脱脂剂，可最大程度地脱除脂肪和胆固醇，并提高多肽含量。该脾多肽组合物溶液中，多肽的质量含量大于85%（以干基计），总脂肪含量低于0.5g/100ml，胆固醇含量低于5mg/100ml，可安全食用，无健康隐患。
作为本发明的一种具体实施方案，所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或木瓜蛋白酶，其用量为所述细胞破碎液质量的0.01~10%，酶解温度20~80 ℃，酶解时间0.5~40 h。
本发明还提供一种脾多肽口服液，包括上述脾多肽组合物和酪蛋白或其盐，二者的质量比为1：0.1~25。所述的脾多肽组合物的质量由氮质量乘以6.25计算得到，下同。
将上述脾多肽组合物制成口服液，服用方便，满足人们日常作为食品、保健品或药品服用的需求。脾多肽口服后在消化液的作用下容易降解而失去活性，这也是目前脾多肽产品多为注射剂药品的主要原因，本发明发现在脾多肽组合物中加入酪蛋白或其盐，能显著提高其口服效果。酪蛋白盐可选钾、钠、镁或钙盐，其与酪蛋白均是安全的食品原料，加入本发明的脾多肽口服液中无任何副作用，并且酪蛋白或其盐本身也具有提高免疫力以及促进钙吸收等作用，与脾多肽二者相辅相成，可进一步提高产品的功效。此外，脾多肽口服液中加入酪蛋白或其盐，还能有效抑制多肽分子的聚合，有利于提高产品的贮存稳定性，延长产品的保质期。
作为本发明的一种具体实施方案，所述脾多肽口服液中脾多肽组合物的质量浓度为5~100 g/L。
作为本发明的一种具体实施方案，所述脾多肽口服液还包括食品工业和/或药品制剂中允许的辅料，如营养强化剂、抗氧化剂、增稠剂、酸度调节剂、甜味剂、防腐剂、色素、香精等，以及其他不影响脾多肽和酪蛋白性能的原料。
作为本发明的一种具体实施方案，所述脾多肽口服液的制备方法为：取所述脾多肽组合物溶液，加入所述酪蛋白或其盐和所述辅料，调整浓度后，配制成溶液，将所述溶液填充进饮料容器后灭菌，得所述脾多肽口服液。
作为本发明的一种具体实施方案，所述灭菌是在110~135℃下灭菌1~40min。在该条件下保证灭菌效果的同时最大程度降低对有效成分的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
（1）取新鲜的猪脾，其外观色泽鲜明，无臭味或异味，检测挥发性盐基氮0.1 g/kg。
（2）将所述猪脾切碎成块，同时去除脾脏中筋膜、血管、脂肪等异物，用水洗净；称取上述猪脾100kg，粉碎至2mm以下，然后采用冷冻-粉碎-融化的方法进行细胞破碎，其中冷冻温度-40℃，融化温度20℃，冷冻-粉碎-融化3次使物料粒径为500μm以下得细胞破碎液。
（3）在上述细胞破碎液中加入其质量1%的胰蛋白酶，40℃水解1小时。
（4）水解结束后在水解液中加入其质量3%的高岭土，充分搅拌进行脱脂；
（5）板框过滤，115℃下灭菌30min，即得脾多肽组合物溶液。
对比例1
将实施例1中的步骤（4）删除，其余与实施例1相同。
对比例2
步骤（4）中加入水解液质量3%的胆固醇氧化酶进行脱脂，其余与实施例1相同。
对比例3
步骤（2）中冷冻温度为-20℃，其余与实施例1相同。
对比例4
步骤（2）中冷冻温度为-90℃，其余与实施例1相同。
实施例2
步骤（1）-（4）与实施例1相同。
（5）板框过滤，加水调整脾多肽浓度为6g/L，加入酪蛋白使其浓度为6g/L，然后加入料液质量0.01%的白砂糖和0.01%的食用香精，配制成原料液，充填进饮料容器中，115℃下灭菌30min，即得脾多肽口服液。
对比例5
步骤（1）-（4）与实施例1相同。
（5）板框过滤，加水调整脾多肽浓度为6g/L，然后加入料液质量0.01%的白砂糖和0.01%的食用香精，配制成原料液，充填进饮料容器中，115℃下灭菌30min，即得脾多肽口服液。
实施例3
步骤（1）-（4）与实施例1相同。
（5）板框过滤，滤液中加入酪蛋白酸钠，调整脾多肽浓度为6g/L，酪蛋白酸钠浓度为150g/L，然后加入料液质量0.01%的三氯蔗糖和0.01%的食用香精，配制成原料液，充填进饮料容器中，115℃下灭菌30min，即得脾多肽口服液。
实施例4
步骤（1）-（4）与实施例1相同。
（5）板框过滤，滤液中加入酪蛋白酸钾，调整脾多肽浓度为20g/L，酪蛋白酸钾浓度为50g/L，然后加入料液质量0.01%的白砂糖和0.01%的食用香精，配制成原料液，充填进饮料容器中，115℃下灭菌30min，即得脾多肽口服液。
实施例5
步骤（1）-（4）与实施例1相同。
（5）板框过滤，滤液中加入酪蛋白钙，调整脾多肽浓度为50g/L，酪蛋白钙浓度为10g/L，然后加入料液质量0.01%的白砂糖和0.01%的食用香精，配制成原料液，充填进饮料容器中，115℃下灭菌30min，即得脾多肽口服液。
实施例6
步骤（1）-（4）与实施例1相同。
（5）板框过滤，滤液中加入酪蛋白镁，调整脾多肽浓度为100g/L，酪蛋白镁浓度为10g/L，然后加入料液质量0.01%的白砂糖和0.01%的食用香精，配制成原料液，充填进饮料容器中，115℃下灭菌30min，即得脾多肽口服液。
试验例1
将实施例1-6以及对比例1-5得到的脾多肽组合物溶液进行多肽、脂肪和胆固醇含量检测，检测方法如下：（1）多肽：采用凯氏定氮仪（生产厂家：山东海能科学仪器有限公司）检测总氮含量，再乘以折算系数6.25即得多肽含量；（2）总脂肪：采用脂肪测定仪（生产厂家：山东海能科学仪器有限公司）检测脾多肽组合物溶液中的总脂肪；（3）胆固醇：将样品经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化，石油醚和无水乙醚混合提取，提取液浓缩至干，无水乙醇溶解定容后，采用高效液相色谱仪定量检测胆固醇含量。检测结果如表1所示。
表1 脾多肽组合物溶液检测结果
实施例2-6和对比例5的脾多肽口服液中，脂肪含量未检出，每100ml口服液中胆固醇含量在0.7mg以下。
试验例2
取清洁级昆明小鼠，体重18-22g，每组10只，分别以10ml/kg体重灌胃实施例1-6以及对比例4-5的脾多肽产品，对照组灌胃等量去离子水，连续喂养30天，参照《保健食品检验与评价技术规范》中的相应方法检测小鼠淋巴细胞转化能力、血清半数溶血值及碳廓清能力，结果如表2-4所示。
表2 脾多肽组合物对小鼠淋巴细胞转化能力的影响
表3脾多肽组合物对小鼠血清半数溶血值（HC50）的影响
表4脾多肽组合物对小鼠碳廓清能力的影响
由试验例1和试验例2可见，与未经脱脂处理的对比例1相比，实施例1的脾多肽组合物中脂肪含量和胆固醇含量均显著降低，对比例2采用胆固醇氧化酶进行脱脂，虽然胆固醇含量与实施例1相当，但脂肪含量仍较高。对比例3的脂肪和胆固醇含量虽然较低，但多肽含量也较实施例显著降低，可能是此冻融条件下细胞破碎不够彻底，有效物质未充分溶出。对比例4的多肽以及脂肪和胆固醇含量与实施例相当，但增强免疫力的效果较实施例1稍差，可能是在较低的冷冻温度下进行冻融时多肽活性发生了变化。实施例2中加入酪蛋白后，尽管脾多肽含量较实施例1进行了稀释，但提高免疫力的效果基本与实施例1相当，说明酪蛋白的加入可能有利于减少脾多肽在消化液中的降解，促进脾多肽的吸收，提高了生物利用度，相较于未加入酪蛋白的对比例5，实施例2增强免疫力的效果有明显优势。实施例3-6增加酪蛋白含量或增加脾多肽组合物浓度均使产品提高免疫力的效果有一定程度的改善。另外，灌胃实施例2-6产品的小鼠在实验过程中表现更加活跃，尤其是实施例3的小鼠，通过对其骨密度和骨钙含量进行检测，发现明显高于其他组，说明酪蛋白的加入还增加了脾多肽产品维持骨骼健康的功效，特别适合中老年人使用。
试验例3
将S180肿瘤细胞悬液（8×107/mL）接种于昆明雄性小鼠（18-22g）右侧腋下皮下，每只接种0.2ml，接种24h后小鼠随机分组，每组10只，实验组每日分别以10ml/kg体重灌胃实施例1-2和对比例4-5的产品，另取10只小鼠接种等量蒸馏水作为阴性对照，10只每日灌胃等量蒸馏水作为模型对照，10只隔天腹腔注射0.03g/kg体重环磷酰胺作为阳性对照，10天后处死小鼠，分离肿瘤病称重，计算抑瘤率，结果如表5所示。
表5 脾多肽组合物对肿瘤的抑制效果
由表5可见，本发明脾多肽组合物和口服液在提高免疫力的效果之外，还具有抗肿瘤的效果，且加入酪蛋白后抑制肿瘤的效果较单用脾多肽组合物有显著提高，在试验范围内抗肿瘤效果亦随着脾多肽浓度的增加而提高。
试验例4
取Wistar大鼠（150-180g）每日1次皮下注射醋酸考的松50mg/kg, 连续注射7 d，制成免疫功能低下大鼠模型。造模成功大鼠气管内接种肺炎球菌0.2ml（左右侧各0.1ml，108个/ml），接种后大鼠随机分组，每组15只，分别每日灌胃10ml/kg体重实施例1-2和对比例4-5的脾多肽产品，对照组灌胃等量蒸馏水，10天后统计各组大鼠的死亡率，结果如表6所示。
表6 脾多肽组合物对肺炎球菌的效果
由表6可见，本发明脾多肽组合物和口服液对细菌性肺炎也有显著的效果，且酪蛋白的加入能够进一步提高其疗效。
试验例5
将实施例2及对比例5的脾多肽口服液在常温下自然放置24个月，检测其中相对分子质量10kDa以下的多肽含量。另取实施例2和对比例5的脾多肽口服液样品于50℃下放置10天，检测其中相对分子质量10kDa以下的多肽含量。以结果如表7所示。
表7 稳定性试验结果
可见，加入酪蛋白能够减少脾多肽口服液中小分子肽的聚合，提高口服液的稳定性。这为本发明产品的长期有效性提供了基础。实施例3-6的脾多肽口服液的稳定性也较好，实验条件下相对分子质量10kDa以下的多肽含量变化不超过20%。
实施例7
（1）取-10℃以下冷冻储存的猪脾，解冻，观察其外观色泽鲜明，无臭味或异味，检测挥发性盐基氮0.08 g/kg。
（2）将所述猪脾切碎成块，同时去除脾脏中筋膜、血管、脂肪等异物，用水洗净；称取上述猪脾100kg，粉碎至2mm以下，然后采用冷冻-粉碎-融化的方法进行细胞破碎，其中冷冻温度-60℃，融化温度10℃，冷冻-粉碎-融化进行3次，物料粒径达到500料粒以下，得细胞破碎液。
（3）在上述细胞破碎液中加入其质量5%的胰蛋白酶，30℃水解2小时。
（4）水解结束后在水解液中加入其质量3%的硅藻土，充分搅拌进行脱脂；
（5）板框过滤，115℃下灭菌30min，即得脾多肽组合物溶液。
实施例8
（1）取新鲜的猪脾，其外观色泽鲜明，无臭味或异味，检测挥发性盐基氮0.1 g/kg。
（2）将所述猪脾切碎成块，同时去除脾脏中筋膜、血管、脂肪等异物，用水洗净；称取上述猪脾100kg，粉碎至2mm以下，然后采用冷冻-粉碎-融化的方法进行细胞破碎，其中冷冻温度-50℃，融化温度20℃，冷冻-粉碎-融化进行2次，物料粒径达到500μm以下，得细胞破碎液。
（3）在上述细胞破碎液中加入其质量0.2%的胃蛋白酶，20℃水解10小时。
（4）水解结束后在水解液中加入其质量3%的β-环糊精，充分搅拌进行脱脂；
（5）板框过滤，135℃下灭菌5min，即得脾多肽组合物溶液。
实施例9
（1）取-10℃以下冷冻储存的猪脾，解冻，观察其外观色泽鲜明，无臭味或异味，检测挥发性盐基氮0.08 g/kg。
（2）将所述猪脾切碎成块，同时去除脾脏中筋膜、血管、脂肪等异物，用水洗净；称取上述猪脾100kg，粉碎至2mm以下，然后采用冷冻-粉碎-融化的方法进行细胞破碎，其中冷冻温度-80℃，融化温度5℃，上述冷冻-粉碎-融化进行1次，物料粒径达到500μm以下，得细胞破碎液。
（3）在上述细胞破碎液中加入其质量0.05%的胰蛋白酶，30℃水解40小时。
（4）水解结束后在水解液中加入其质量6%的硅藻土，充分搅拌进行脱脂；
（5）板框过滤，121℃下灭菌15min，即得脾多肽组合物溶液。
实施例10
（1）取-10℃以下冷冻储存的猪脾，解冻，观察其外观色泽鲜明，无臭味或异味，检测挥发性盐基氮0.08 g/kg。
（2）将所述猪脾切碎成块，同时去除脾脏中筋膜、血管、脂肪等异物，用水洗净；称取上述猪脾100kg，粉碎至2mm以下，然后采用冷冻-粉碎-融化进行细胞破碎，其中冷冻温度-60℃，融化温度15℃，上述冷冻-粉碎-融化进行1次，物料粒径达到500μm以下得细胞破碎液。
（3）在上述细胞破碎液中加入其质量10%的木瓜蛋白酶，30℃水解2小时。
（4）水解结束后在水解液中加入其质量9%的硅藻土，充分搅拌进行脱脂；
（5）板框过滤，115℃下灭菌30min，即得脾多肽组合物溶液。
实施例7-10产品的性能与实施例1相当，在此不再赘述。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于提高免疫力的脾多肽口服液，其特征在于，包括脾多肽组合物和酪蛋白或其盐，二者的质量比为1：0 .1 ~ 25；其中，所述脾多肽组合物采用以下方法制备得到：取哺乳动物脾脏，进行细胞破碎后得细胞破碎液，然后加入蛋白酶进行水解，水解结束后在水解液中加入脱脂剂以脱除脂肪和胆固醇，最后固液分离，得所述脾多肽组合物溶液；所述细胞破碎是先将所述哺乳动物脾脏机械粉碎至粒径2mm以下，然后采用冷冻-粉碎-融化的方法进行细胞破碎，所述冷冻温度-80 ~ -40℃，融化温度0 ~ 20℃，所述冷冻-粉碎-融化进行次数1～ 3次，并使物料粒径为500μm以下；所述脱脂剂为高岭土、硅藻土或β-环状糊精，其用量为所述水解液质量的1-9%。
2.如权利要求1所述的脾多肽口服液，其特征在于，所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或木瓜蛋白酶，其用量为所述细胞破碎液质量的0.05 ~ 10%，酶解温度20 ~ 40℃，酶解时间1 ~ 40 h。
3.如权利要求1所述的脾多肽口服液，其特征在于，其中所述脾多肽组合物的浓度为5~ 100 g/L。
4.如权利要求1所述的脾多肽口服液，其特征在于，还包括食品工业和/或药品制剂中允许的原辅料。
5.如权利要求4所述的脾多肽口服液，其特征在于，其制备方法为：取所述脾多肽组合物溶液，加入所述酪蛋白或其盐和所述辅料，调整浓度后，配制成溶液，将所述溶液填充进饮料容器后灭菌，得所述脾多肽口服液。
6.如权利要求5所述的脾多肽口服液，其特征在于，所述灭菌是在110 ~ 135℃下灭菌5~ 30min。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 猪脾多肽的制备工艺研究;袁霖;《肉类工业》;20020225;第29页1.6、1.7 * |
| 生物活性肽制备工艺的研究进展;陈丽娜等;《农产品加工》;20180915;全文 * |
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| CN111778305A (zh) | 2020-10-16 |
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