CN107475342A - 一种蜗牛活性肽的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜗牛活性肽的提取方法,包括以下步骤:(1)采用活体蜗牛静养一周,清除杂物,挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状,经过液氮研磨法粉碎,得到蜗牛组织,待用;(2)脱脂;(3)浸提;(4)酶解;(5)将酶解产物进行一次透析、盐析、纯化,然后进行再次透析、干燥,即得。本发明的蜗牛活性肽能迅速被胃肠壁细胞直接吸收,促进消化酶的分泌;能清除低密度脂蛋白,降低血粘,增强心肌和血管的弹性;能激活肺部细胞、修正气血屏障,清除肺部毒素;可抑制破骨细胞,调理骨质疏松、关节炎和钙缺乏导致的疾病;在免疫系统方面具有刺激胸腺再生、加快淋巴T细胞、B细胞和NK细胞的生成、预防肿瘤病变等功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程领域,具体是一种蜗牛活性肽的提取方法。
背景技术
蜗牛蛋白活性肽是原肉体组织含量最多的蛋白质,是细胞外基质中的主要成分,占蛋白质总量的95%,相当于肉体体重的95%左右;蜗牛蛋白活性肽可为人体所需补充能量,对人体的技能起到修复调整。利用生物酶技术将蜗牛蛋白活性肽转化为小分子多肽,小分子量相容性良好,并能提高生物利用度,因而被作为生物制药、化妆品及保健品的原料或中间体。蜗牛活性肽含有18种氨基酸,还包括含多种干细胞活性分泌因子,因此具有较大的生物学利用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜗牛活性肽的提取方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种蜗牛活性肽的提取方法,包括以下步骤:
(1)采用活体蜗牛静养一周,清除杂物,挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状,经过液氮研磨法粉碎至100-200目,得到蜗牛组织,待用;
(2)脱脂:采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂,得到脱脂物料,其粗蛋白含量达60%左右;
(3)浸提:采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提,得到浸出液;
(4)酶解:用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解,酶解后高温灭酶10-20分钟,得到酶解产物;
(5)将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化,然后进行再次透析、干燥,即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽,该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上。
作为本发明进一步的方案:步骤(2)中,所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液;所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为(0.05-0.15):1;每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为5-10g;步骤(3)中,每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1-2L;步骤(4)中,每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为5-20L。
作为本发明进一步的方案:步骤(2)脱脂的条件为:脱脂温度为0-25℃,脱脂的时间为每6-10小时更换脱脂溶剂一次,共更换2-8次;步骤(3)浸提的条件为:浸提温度为0-25℃,浸提时间为10-60小时;步骤(4)酶解的条件为:酶解的温度为10-40℃,酶解的时间为10-40小时。
作为本发明进一步的方案:步骤(5)中一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液,相对于1体积的酶解产物,所述透析介质的用量为10-30倍体积,透析的时间为每6-18小时更换透析介质一次,共更换2-8次;透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到透析纯化产物。
作为本发明进一步的方案:然后将透析纯化产物与NaCl固体混合,使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L,然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析,混合溶液pH值为7.2-7.7,其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L,Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L;将盐析所得沉淀复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到盐析纯化产物。
作为本发明进一步的方案:将盐析纯化产物进行再次透析纯化,所用的再次透析介质为去离子水,且相对于1体积的盐析纯化产物,再次透析所用去离子水的用量为10-30倍体积,再次透析的时间为每6-18小时更换去离子水一次,共更换2-8次;并且,将再次透析所得的透析液于-18℃到-22℃的温度下预冷冻8-20小时,再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。
作为本发明进一步的方案:所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式:分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%,且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。
作为本发明进一步的方案:所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式:分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%;分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%;分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%;分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%,且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明的蜗牛活性肽能够被人体所吸收,且能迅速被胃肠壁细胞直接吸收,促进消化酶的分泌;能清除低密度脂蛋白,降低血粘,增强心肌和血管的弹性;能激活肺部细胞、修正气血屏障,清除肺部毒素;可抑制破骨细胞,调理骨质疏松、关节炎和钙缺乏导致的疾病;在免疫系统方面具有刺激胸腺再生、加快淋巴T细胞、B细胞和NK细胞的生成、预防肿瘤病变等功能。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种蜗牛活性肽的提取方法,包括以下步骤:
(1)采用活体蜗牛静养一周,清除杂物,挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状,经过液氮研磨法粉碎至100目,得到蜗牛组织,待用;
(2)脱脂:采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂,得到脱脂物料,其粗蛋白含量达60%左右;所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液;所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为0.05:1;每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为5g;脱脂的条件为:脱脂温度为0℃,脱脂的时间为每6小时更换脱脂溶剂一次,共更换2次;
(3)浸提:采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提,得到浸出液;每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1L;所述酸性提取液为浓度为0.5-1.5mo1/L的酸溶液;所述酸采用醋酸;浸提的条件为:浸提温度为0℃,浸提时间为10小时;
(4)酶解:用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解,酶解后高温灭酶10分钟,得到酶解产物;每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为5L;所述胃蛋白酶溶液包括胃蛋白酶和醋酸溶液;其中胃蛋白酶质量含量为5-10%,醋酸溶液浓度为5-1.5mo1/L;酶解的条件为:酶解的温度为10℃,酶解的时间为10小时;
(5)将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化,然后进行再次透析、干燥,即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽,该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上;其中,一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液,相对于1体积的酶解产物,所述透析介质的用量为10倍体积,透析的时间为每6小时更换透析介质一次,共更换2次;透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于5倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到透析纯化产物;然后将透析纯化产物与NaCl固体混合,使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L,然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析,混合溶液pH值为7.2-7.7,其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L,Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L;将盐析所得沉淀复溶于5倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到盐析纯化产物;然后将盐析纯化产物进行再次透析纯化,所用的再次透析介质为去离子水,且相对于1体积的盐析纯化产物,再次透析所用去离子水的用量为10倍体积,再次透析的时间为每6小时更换去离子水一次,共更换2次;并且,将再次透析所得的透析液于-18℃的温度下预冷冻8小时,再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式:分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%,且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。优选的,所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式:分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%;分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%;分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%;分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%,且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
实施例2
一种蜗牛活性肽的提取方法,包括以下步骤:
(1)采用活体蜗牛静养一周,清除杂物,挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状,经过液氮研磨法粉碎至200目,得到蜗牛组织,待用;
(2)脱脂:采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂,得到脱脂物料,其粗蛋白含量达60%左右;所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液;所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为0.15:1;每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为10g;脱脂的条件为:脱脂温度为25℃,脱脂的时间为每10小时更换脱脂溶剂一次,共更换8次;
(3)浸提:采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提,得到浸出液;每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为2L;所述酸性提取液为浓度为0.5-1.5mo1/L的酸溶液;所述酸采用醋酸;浸提的条件为:浸提温度为25℃,浸提时间为60小时;
(4)酶解:用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解,酶解后高温灭酶20分钟,得到酶解产物;每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为20L;所述胃蛋白酶溶液包括胃蛋白酶和醋酸溶液;其中胃蛋白酶质量含量为5-10%,醋酸溶液浓度为5-1.5mo1/L;酶解的条件为:酶解的温度为40℃,酶解的时间为40小时;
(5)将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化,然后进行再次透析、干燥,即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽,该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上;其中,一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液,相对于1体积的酶解产物,所述透析介质的用量为30倍体积,透析的时间为每18小时更换透析介质一次,共更换8次;透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到透析纯化产物;然后将透析纯化产物与NaCl固体混合,使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L,然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析,混合溶液pH值为7.2-7.7,其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L,Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L;将盐析所得沉淀复溶于20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到盐析纯化产物;然后将盐析纯化产物进行再次透析纯化,所用的再次透析介质为去离子水,且相对于1体积的盐析纯化产物,再次透析所用去离子水的用量为30倍体积,再次透析的时间为每18小时更换去离子水一次,共更换8次;并且,将再次透析所得的透析液于-22℃的温度下预冷冻20小时,再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式:分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%,且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。优选的,所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式:分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%;分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%;分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%;分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%,且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
实施例3
一种蜗牛活性肽的提取方法,包括以下步骤:
(1)采用活体蜗牛静养一周,清除杂物,挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状,经过液氮研磨法粉碎至160目,得到蜗牛组织,待用;
(2)脱脂:采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂,得到脱脂物料,其粗蛋白含量达60%左右;所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液;所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为0.1:1;每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为8g;脱脂的条件为:脱脂温度为12℃,脱脂的时间为每8小时更换脱脂溶剂一次,共更换5次;
(3)浸提:采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提,得到浸出液;每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1.5L;所述酸性提取液为浓度为0.5-1.5mo1/L的酸溶液;所述酸采用醋酸;浸提的条件为:浸提温度为4℃,浸提时间24小时;
(4)酶解:用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解,酶解后高温灭酶15分钟,得到酶解产物;每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为12L;所述胃蛋白酶溶液包括胃蛋白酶和醋酸溶液;其中胃蛋白酶质量含量为5-10%,醋酸溶液浓度为5-1.5mo1/L;酶解的条件为:酶解的温度为20℃,酶解的时间为12小时;
(5)将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化,然后进行再次透析、干燥,即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽,该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上;其中,一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液,相对于1体积的酶解产物,所述透析介质的用量为15倍体积,透析的时间为每10小时更换透析介质一次,共更换5次;透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于10倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到透析纯化产物;然后将透析纯化产物与NaCl固体混合,使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L,然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析,混合溶液pH值为7.2-7.7,其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L,Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L;将盐析所得沉淀复溶于10倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到盐析纯化产物;然后将盐析纯化产物进行再次透析纯化,所用的再次透析介质为去离子水,且相对于1体积的盐析纯化产物,再次透析所用去离子水的用量为20倍体积,再次透析的时间为每12小时更换去离子水一次,共更换4次;并且,将再次透析所得的透析液于-20℃的温度下预冷冻11小时,再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式:分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%,且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。优选的,所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式:分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%;分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%;分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%;分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%,且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
实施例4
与实施例3不同的是,步骤(3)中浸提的条件为:浸提温度10℃,浸提时间为48小时;步骤(4)中酶解的条件为:酶解的温度为38℃,酶解的时间为24小时。
本发明的蜗牛活性肽能够被人体所吸收,且能迅速被胃肠壁细胞直接吸收,促进消化酶的分泌;能清除低密度脂蛋白,降低血粘,增强心肌和血管的弹性;能激活肺部细胞、修正气血屏障,清除肺部毒素;可抑制破骨细胞,调理骨质疏松、关节炎和钙缺乏导致的疾病;在免疫系统方面具有刺激胸腺再生、加快淋巴T细胞、B细胞和NK细胞的生成、预防肿瘤病变等功能。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明,但是本专利并不限于上述实施方式,在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (9)
1.一种蜗牛活性肽的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采用活体蜗牛静养一周,清除杂物,挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状,经过液氮研磨法粉碎至100-200目,得到蜗牛组织,待用;
(2)脱脂:采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂,得到脱脂物料,其粗蛋白含量达60%左右;
(3)浸提:采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提,得到浸出液;
(4)酶解:用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解,酶解后高温灭酶10-20分钟,得到酶解产物;
(5)将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化,然后进行再次透析、干燥,即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽,该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上。
2.根据权利要求1所述的蜗牛活性肽的提取方法,其特征在于,步骤(2)中,所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液;所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为(0.05-0.15):1;每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为5-10g;步骤(3)中,每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1-2L;步骤(4)中,每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为5-20L。
3.根据权利要求1所述的蜗牛活性肽的提取方法,其特征在于,步骤(2)脱脂的条件为:脱脂温度为0-25℃,脱脂的时间为每6-10小时更换脱脂溶剂一次,共更换2-8次;步骤(3)浸提的条件为:浸提温度为0-25℃,浸提时间为10-60小时;步骤(4)酶解的条件为:酶解的温度为10-40℃,酶解的时间为10-40小时。
4.根据权利要求1所述的蜗牛活性肽的提取方法,其特征在于,步骤(5)中一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液,相对于1体积的酶解产物,所述透析介质的用量为10-30倍体积,透析的时间为每6-18小时更换透析介质一次,共更换2-8次;透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到透析纯化产物。
5.根据权利要求4所述的蜗牛活性肽的提取方法,其特征在于,然后将透析纯化产物与NaCl固体混合,使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L,然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析,混合溶液pH值为7.2-7.7,其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L,Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L;将盐析所得沉淀复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中,得到盐析纯化产物。
6.根据权利要求5所述的蜗牛活性肽的提取方法,其特征在于,将盐析纯化产物进行再次透析纯化,所用的再次透析介质为去离子水,且相对于1体积的盐析纯化产物,再次透析所用去离子水的用量为10-30倍体积,再次透析的时间为每6-18小时更换去离子水一次,共更换2-8次;并且,将再次透析所得的透析液于-18℃到-22℃的温度下预冷冻8-20小时,再进行真空冷冻干燥。
7.一种利用权利要求1-6中任一所述的蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。
8.根据权利要求7所述的蜗牛活性肽,其特征在于,所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式:分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%,且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。
9.根据权利要求7所述的蜗牛活性肽,其特征在于,所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式:分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%;分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%;分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%;分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%;分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%,且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
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