CN107475342A - 一种蜗牛活性肽的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜗牛活性肽的提取方法，包括以下步骤：（1）采用活体蜗牛静养一周，清除杂物，挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状，经过液氮研磨法粉碎，得到蜗牛组织，待用；（2）脱脂；（3）浸提；（4）酶解；（5）将酶解产物进行一次透析、盐析、纯化，然后进行再次透析、干燥，即得。本发明的蜗牛活性肽能迅速被胃肠壁细胞直接吸收，促进消化酶的分泌；能清除低密度脂蛋白，降低血粘，增强心肌和血管的弹性；能激活肺部细胞、修正气血屏障，清除肺部毒素；可抑制破骨细胞，调理骨质疏松、关节炎和钙缺乏导致的疾病；在免疫系统方面具有刺激胸腺再生、加快淋巴T细胞、B细胞和NK细胞的生成、预防肿瘤病变等功能。

Description

一种蜗牛活性肽的提取方法
技术领域
本发明涉及一种生物工程领域，具体是一种蜗牛活性肽的提取方法。
背景技术
蜗牛蛋白活性肽是原肉体组织含量最多的蛋白质，是细胞外基质中的主要成分，占蛋白质总量的95%，相当于肉体体重的95%左右；蜗牛蛋白活性肽可为人体所需补充能量，对人体的技能起到修复调整。利用生物酶技术将蜗牛蛋白活性肽转化为小分子多肽，小分子量相容性良好，并能提高生物利用度，因而被作为生物制药、化妆品及保健品的原料或中间体。蜗牛活性肽含有18种氨基酸，还包括含多种干细胞活性分泌因子，因此具有较大的生物学利用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜗牛活性肽的提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种蜗牛活性肽的提取方法，包括以下步骤：
（1）采用活体蜗牛静养一周，清除杂物，挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状，经过液氮研磨法粉碎至100-200目，得到蜗牛组织，待用；
（2）脱脂：采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂，得到脱脂物料，其粗蛋白含量达60%左右；
（3）浸提：采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提，得到浸出液；
（4）酶解：用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解，酶解后高温灭酶10-20分钟，得到酶解产物；
（5）将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化，然后进行再次透析、干燥，即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽，该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上。
作为本发明进一步的方案：步骤（2）中，所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液；所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为（0.05-0.15）：1；每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为5-10g；步骤（3）中，每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1-2L；步骤（4）中，每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为5-20L。
作为本发明进一步的方案：步骤（2）脱脂的条件为：脱脂温度为0-25℃，脱脂的时间为每6-10小时更换脱脂溶剂一次，共更换2-8次；步骤（3）浸提的条件为：浸提温度为0-25℃，浸提时间为10-60小时；步骤（4）酶解的条件为：酶解的温度为10-40℃，酶解的时间为10-40小时。
作为本发明进一步的方案：步骤（5）中一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液，相对于1体积的酶解产物，所述透析介质的用量为10-30倍体积，透析的时间为每6-18小时更换透析介质一次，共更换2-8次；透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到透析纯化产物。
作为本发明进一步的方案：然后将透析纯化产物与NaCl固体混合，使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L，然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析，混合溶液pH值为7.2-7.7，其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L，Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L；将盐析所得沉淀复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到盐析纯化产物。
作为本发明进一步的方案：将盐析纯化产物进行再次透析纯化，所用的再次透析介质为去离子水，且相对于1体积的盐析纯化产物，再次透析所用去离子水的用量为10-30倍体积，再次透析的时间为每6-18小时更换去离子水一次，共更换2-8次；并且，将再次透析所得的透析液于-18℃到-22℃的温度下预冷冻8-20小时，再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。
作为本发明进一步的方案：所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式：分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%，且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。
作为本发明进一步的方案：所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%；分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%；分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%；分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%，且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的蜗牛活性肽能够被人体所吸收，且能迅速被胃肠壁细胞直接吸收，促进消化酶的分泌；能清除低密度脂蛋白，降低血粘，增强心肌和血管的弹性；能激活肺部细胞、修正气血屏障，清除肺部毒素；可抑制破骨细胞，调理骨质疏松、关节炎和钙缺乏导致的疾病；在免疫系统方面具有刺激胸腺再生、加快淋巴T细胞、B细胞和NK细胞的生成、预防肿瘤病变等功能。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种蜗牛活性肽的提取方法，包括以下步骤：
（1）采用活体蜗牛静养一周，清除杂物，挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状，经过液氮研磨法粉碎至100目，得到蜗牛组织，待用；
（2）脱脂：采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂，得到脱脂物料，其粗蛋白含量达60%左右；所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液；所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为0.05：1；每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为5g；脱脂的条件为：脱脂温度为0℃，脱脂的时间为每6小时更换脱脂溶剂一次，共更换2次；
（3）浸提：采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提，得到浸出液；每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1L；所述酸性提取液为浓度为0.5-1.5mo1/L的酸溶液；所述酸采用醋酸；浸提的条件为：浸提温度为0℃，浸提时间为10小时；
（4）酶解：用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解，酶解后高温灭酶10分钟，得到酶解产物；每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为5L；所述胃蛋白酶溶液包括胃蛋白酶和醋酸溶液；其中胃蛋白酶质量含量为5-10%，醋酸溶液浓度为5-1.5mo1/L；酶解的条件为：酶解的温度为10℃，酶解的时间为10小时；
（5）将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化，然后进行再次透析、干燥，即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽，该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上；其中，一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液，相对于1体积的酶解产物，所述透析介质的用量为10倍体积，透析的时间为每6小时更换透析介质一次，共更换2次；透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于5倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到透析纯化产物；然后将透析纯化产物与NaCl固体混合，使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L，然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析，混合溶液pH值为7.2-7.7，其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L，Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L；将盐析所得沉淀复溶于5倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到盐析纯化产物；然后将盐析纯化产物进行再次透析纯化，所用的再次透析介质为去离子水，且相对于1体积的盐析纯化产物，再次透析所用去离子水的用量为10倍体积，再次透析的时间为每6小时更换去离子水一次，共更换2次；并且，将再次透析所得的透析液于-18℃的温度下预冷冻8小时，再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式：分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%，且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。优选的，所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%；分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%；分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%；分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%，且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
实施例2
一种蜗牛活性肽的提取方法，包括以下步骤：
（1）采用活体蜗牛静养一周，清除杂物，挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状，经过液氮研磨法粉碎至200目，得到蜗牛组织，待用；
（2）脱脂：采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂，得到脱脂物料，其粗蛋白含量达60%左右；所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液；所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为0.15：1；每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为10g；脱脂的条件为：脱脂温度为25℃，脱脂的时间为每10小时更换脱脂溶剂一次，共更换8次；
（3）浸提：采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提，得到浸出液；每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为2L；所述酸性提取液为浓度为0.5-1.5mo1/L的酸溶液；所述酸采用醋酸；浸提的条件为：浸提温度为25℃，浸提时间为60小时；
（4）酶解：用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解，酶解后高温灭酶20分钟，得到酶解产物；每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为20L；所述胃蛋白酶溶液包括胃蛋白酶和醋酸溶液；其中胃蛋白酶质量含量为5-10%，醋酸溶液浓度为5-1.5mo1/L；酶解的条件为：酶解的温度为40℃，酶解的时间为40小时；
（5）将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化，然后进行再次透析、干燥，即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽，该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上；其中，一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液，相对于1体积的酶解产物，所述透析介质的用量为30倍体积，透析的时间为每18小时更换透析介质一次，共更换8次；透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到透析纯化产物；然后将透析纯化产物与NaCl固体混合，使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L，然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析，混合溶液pH值为7.2-7.7，其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L，Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L；将盐析所得沉淀复溶于20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到盐析纯化产物；然后将盐析纯化产物进行再次透析纯化，所用的再次透析介质为去离子水，且相对于1体积的盐析纯化产物，再次透析所用去离子水的用量为30倍体积，再次透析的时间为每18小时更换去离子水一次，共更换8次；并且，将再次透析所得的透析液于-22℃的温度下预冷冻20小时，再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式：分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%，且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。优选的，所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%；分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%；分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%；分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%，且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
实施例3
一种蜗牛活性肽的提取方法，包括以下步骤：
（1）采用活体蜗牛静养一周，清除杂物，挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状，经过液氮研磨法粉碎至160目，得到蜗牛组织，待用；
（2）脱脂：采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂，得到脱脂物料，其粗蛋白含量达60%左右；所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液；所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为0.1：1；每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为8g；脱脂的条件为：脱脂温度为12℃，脱脂的时间为每8小时更换脱脂溶剂一次，共更换5次；
（3）浸提：采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提，得到浸出液；每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1.5L；所述酸性提取液为浓度为0.5-1.5mo1/L的酸溶液；所述酸采用醋酸；浸提的条件为：浸提温度为4℃，浸提时间24小时；
（4）酶解：用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解，酶解后高温灭酶15分钟，得到酶解产物；每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为12L；所述胃蛋白酶溶液包括胃蛋白酶和醋酸溶液；其中胃蛋白酶质量含量为5-10%，醋酸溶液浓度为5-1.5mo1/L；酶解的条件为：酶解的温度为20℃，酶解的时间为12小时；
（5）将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化，然后进行再次透析、干燥，即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽，该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上；其中，一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液，相对于1体积的酶解产物，所述透析介质的用量为15倍体积，透析的时间为每10小时更换透析介质一次，共更换5次；透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于10倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到透析纯化产物；然后将透析纯化产物与NaCl固体混合，使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L，然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析，混合溶液pH值为7.2-7.7，其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L，Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L；将盐析所得沉淀复溶于10倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到盐析纯化产物；然后将盐析纯化产物进行再次透析纯化，所用的再次透析介质为去离子水，且相对于1体积的盐析纯化产物，再次透析所用去离子水的用量为20倍体积，再次透析的时间为每12小时更换去离子水一次，共更换4次；并且，将再次透析所得的透析液于-20℃的温度下预冷冻11小时，再进行真空冷冻干燥。
一种利用蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式：分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%，且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。优选的，所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%；分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%；分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%；分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%，且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
实施例4
与实施例3不同的是，步骤（3）中浸提的条件为：浸提温度10℃，浸提时间为48小时；步骤（4）中酶解的条件为：酶解的温度为38℃，酶解的时间为24小时。
本发明的蜗牛活性肽能够被人体所吸收，且能迅速被胃肠壁细胞直接吸收，促进消化酶的分泌；能清除低密度脂蛋白，降低血粘，增强心肌和血管的弹性；能激活肺部细胞、修正气血屏障，清除肺部毒素；可抑制破骨细胞，调理骨质疏松、关节炎和钙缺乏导致的疾病；在免疫系统方面具有刺激胸腺再生、加快淋巴T细胞、B细胞和NK细胞的生成、预防肿瘤病变等功能。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (9)

1.一种蜗牛活性肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用活体蜗牛静养一周，清除杂物，挑出足部肉体进行粉碎搅拌为泥状，经过液氮研磨法粉碎至100-200目，得到蜗牛组织，待用；
（2）脱脂：采用脱脂溶剂对上述蜗牛组织进行脱脂，得到脱脂物料，其粗蛋白含量达60%左右；
（3）浸提：采用酸性提取液对上述脱脂物料进行浸提，得到浸出液；
（4）酶解：用胃蛋白酶溶液对上述浸出液进行酶解，酶解后高温灭酶10-20分钟，得到酶解产物；
（5）将上述酶解产物进行一次透析、盐析、纯化，然后进行再次透析、干燥，即得具有特定的小分子肽并且具有一定的生物活性的蜗牛活性肽，该蜗牛活性肽总蛋白含量95%以上。
2.根据权利要求1所述的蜗牛活性肽的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述脱脂剂包括正丁醇和乙醇溶液；所述正丁醇与乙醇溶液的体积比为（0.05-0.15）：1；每100g蜗牛组织所用的脱脂剂用量为5-10g；步骤（3）中，每100g脱脂物料所用的酸性提取液的用量为1-2L；步骤（4）中，每升浸出液所用的胃蛋白酶溶液的用量为5-20L。
3.根据权利要求1所述的蜗牛活性肽的提取方法，其特征在于，步骤（2）脱脂的条件为：脱脂温度为0-25℃，脱脂的时间为每6-10小时更换脱脂溶剂一次，共更换2-8次；步骤（3）浸提的条件为：浸提温度为0-25℃，浸提时间为10-60小时；步骤（4）酶解的条件为：酶解的温度为10-40℃，酶解的时间为10-40小时。
4.根据权利要求1所述的蜗牛活性肽的提取方法，其特征在于，步骤（5）中一次透析所用的透析介质为0.01-0.03mol/L、且pH值7.0-7.4的Na2HPO4溶液，相对于1体积的酶解产物，所述透析介质的用量为10-30倍体积，透析的时间为每6-18小时更换透析介质一次，共更换2-8次；透析所得的透析液离心取沉淀后复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到透析纯化产物。
5.根据权利要求4所述的蜗牛活性肽的提取方法，其特征在于，然后将透析纯化产物与NaCl固体混合，使得NaCl的终浓度为0.5-1.5mol/L，然后进一步加入NaCl溶液和Tris-HCl溶液的混合溶液中进行盐析，混合溶液pH值为7.2-7.7，其中NaCl溶液浓度为2-3mol/L，Tris-HCl溶液浓度为0.03-0.08mol/L；将盐析所得沉淀复溶于5-20倍体积的0.5-1.5mol/L醋酸溶液中，得到盐析纯化产物。
6.根据权利要求5所述的蜗牛活性肽的提取方法，其特征在于，将盐析纯化产物进行再次透析纯化，所用的再次透析介质为去离子水，且相对于1体积的盐析纯化产物，再次透析所用去离子水的用量为10-30倍体积，再次透析的时间为每6-18小时更换去离子水一次，共更换2-8次；并且，将再次透析所得的透析液于-18℃到-22℃的温度下预冷冻8-20小时，再进行真空冷冻干燥。
7.一种利用权利要求1-6中任一所述的蜗牛活性肽的提取方法得到的蜗牛活性肽。
8.根据权利要求7所述的蜗牛活性肽，其特征在于，所述蜗牛活性肽具有以下肽分子量高斯分布模式：分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为26-30%，且分子量在1000-10000道尔顿的多肽高斯分布面积为40-46%。
9.根据权利要求7所述的蜗牛活性肽，其特征在于，所述蜗牛活性肽具有如下所示的肽分子量高斯分布模式：分子量大于10000道尔顿的肽高斯分布面积为20-21%；分子量为5000-10000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为3000-5000道尔顿的肽高斯分布面积为9-10%；分子量为2000-3000道尔顿的肽高斯分布面积为14-15%；分子量为1000-2000道尔顿的肽高斯分布面积为10-11%；分子量为100-1000道尔顿的肽高斯分布面积为28-29%，且分子量小于100道尔顿的肽高斯分布面积为7-8%。
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