CN117398339B - 一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽及制备方法和应用，属于医药技术领域。将螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕反复冻融后，加入蜗牛提取物和复合酶酶解，然后加入蜂毒肽、氯毒素、葡萄糖混合发酵，透析，产物与铁离子和锌离子螯合，制得硒化蛋白肽金属复合物，与人参皂苷Rh2、三七总皂苷混合均匀包埋于叶酸脂质体中，加入含有FOVVVEF多肽的溶液中，调节为碱性形成凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。本发明制备的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽具有高度亲和力、非免疫原性、安全有效，能够实现靶向缓释释放，具有较好的抗肿瘤以及辅助化疗后提高机体免疫力以及提高抗肿瘤效果的特点，成本低，效果好，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽及制备方法和应用。
背景技术
目前治疗癌症主要有手术治疗、化疗、放疗等。其中传统的化学药物治疗存在许多的问题和不足，如代谢速度快、生物利用度差、药物吸收和分布不理想，选择性差、毒副作用大等，一直是癌症联合治疗的局限性。为了克服上述缺点，越来越多的新型载药材料被研发出来。多肽水凝胶作为一种特殊的药物载体，由于其优异的生物相容性、可控的降解性和缓控性，引起了人们的极大关注。可注射多肽水凝胶可以通过注射器或导管直接注射进入体内，作为局部和持续给药的载体，具有良好的注射性和延缓药物释放，提高治疗效果的作用。
水凝胶作为一种特殊的药物载体，具有优异的理化性质、可控的降解性和缓控性，受到了广泛关注。随着研究探索的不断深入，智能响应型多肽水凝胶收到人们极大青睐。智能响应型多肽水凝胶是指在受到外界物理或化学刺激(如PH、温度、溶剂、压力、光照和离子强度)下，能够发生溶胶-凝胶转变。因此，根据肿瘤微环境特性(例如PH较低，谷胱甘肽含量较高)，设计能够在肿瘤微环境中智能响应的多肽水凝胶载体，在抗癌化学药物控制释放方面有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提出一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽及制备方法和应用，具有高度亲和力、非免疫原性、安全有效，能够实现靶向缓释释放，具有较好的抗肿瘤以及辅助化疗后提高机体免疫力以及提高抗肿瘤效果的特点，成本低，效果好，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备方法，将螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕反复冻融后，加入蜗牛提取物和复合酶酶解，然后加入蜂毒肽、氯毒素、葡萄糖混合发酵，透析，产物与铁离子和锌离子螯合，制得硒化蛋白肽金属复合物，与人参皂苷Rh2、三七总皂苷混合均匀包埋于叶酸脂质体中，加入含有FOVVVEF多肽的溶液中，调节为碱性形成凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，置于液氮中冷冻，室温融解，超声波搅拌提取，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，置于液氮中冷冻，室温融解，重复2-3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热搅拌酶解，得到酶解混合物；
S3.混合蛋白的发酵：将蜂毒肽、氯毒素、步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，酶助发酵培养，过滤，滤液透析，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于水中，加入铁盐和锌盐，搅拌反应，透析，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将人参皂苷Rh2、三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、步骤S5制得的活性组合物、叶酸加入水中，加入脂质膜中，超声处理后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将FOVVVEF多肽溶于水中，加入步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为碱性，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述蜗牛干粉和水的固液比为1:3-5g/mL，所述液氮中冷冻的时间为15-20min，所述超声波搅拌提取的功率为1000-1500W，时间为0.5-1h。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕的质量比为12-15:7-10:5-7，所述混合粉和水的固液比为1:7-10g/mL，所述液氮中冷冻的时间15-30min，所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的2-4wt%和1-2wt%，所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为5-7:10-12，所述加热搅拌酶解的温度为45-50℃，时间为2-4h。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述蜂毒肽、氯毒素、酶解混合物、葡萄糖的质量比为5-7:3-5:50-70：12-15，所述富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL，接种量分别为2-4v/v%和1-1.6v/v%，所述酶助发酵培养的条件为37-42℃，100-200r/min，酶助发酵培养48-56h，所述透析用的透析袋孔径为2-5kDa，时间为5-7h。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述硒化蛋白肽、铁盐和锌盐的质量比为100:5-7:7-10，所述铁盐选自氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的至少一种，所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌中的至少一种，所述搅拌反应的时间为20-30min，所述透析用的透析袋孔径为2-5kDa，时间为2-4h；步骤S5中所述人参皂苷Rh2、三七总皂苷的质量比为12-15:7-10。
作为本发明的进一步改进，步骤S6中所述胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000、硒化蛋白肽金属复合物、步骤S5制得的活性组合物、叶酸的质量比为4-6:5-7:7-10:7-10:2-4:3-5，所述超声处理的功率为500-700W，时间为15-20min；步骤S7中所述FOVVVEF多肽、叶酸包埋脂质体的质量比为15-20:3-5，所述调节溶液pH值为7.3-7.7。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:3-5g/mL，置于液氮中冷冻15-20min，室温融解，1000-1500W超声波搅拌提取0.5-1h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将12-15重量份螺旋藻、7-10重量份葛仙米藻、5-7重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:7-10g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复2-3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热至45-50℃，搅拌酶解2-4h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的2-4wt%和1-2wt%，所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为5-7:10-12；
S3.混合蛋白的发酵：将5-7重量份蜂毒肽、3-5重量份氯毒素、50-70重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入12-15重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，37-42℃，100-200r/min，酶助发酵培养48-56h，过滤，滤液用2-5kDa的透析袋透析5-7h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
所述富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL，接种量分别为2-4v/v%和1-1.6v/v%；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入5-7重量份铁盐和7-10重量份锌盐，搅拌反应20-30min，用2-5kDa的透析袋透析2-4h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将12-15重量份人参皂苷Rh2、7-10重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将4-6重量份胆固醇、5-7重量份大豆卵磷脂、7-10重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将7-10重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、2-4重量份步骤S5制得的活性组合物、3-5重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，500-700W超声处理15-20min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将15-20重量份FOVVVEF多肽溶于100重量份水中，加入3-5重量份步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为7.3-7.7，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
本发明进一步保护一种上述用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽在制备治疗或辅助治疗的药品中的应用。
本发明具有如下有益效果：
蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中提取的一种含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等20多种酶的高效混合酶，具有很强的生物转化能力，专一性强、反应条件温和、转化效率高、绿色环保，与复合酶协同作用下，能够大大提高对植物细胞壁的破壁作用以及对难溶性蛋白质如糖蛋白等的降解效果，从而大大提高了螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕中活性蛋白质的提取效率。
螺旋藻、葛仙米藻中富含活性蛋白质，包括藻胆蛋白等，能抑制肿瘤细胞组装成微管，影响增殖，对多种移植瘤抑制作用显著，菜籽饼粕是菜籽油生产中的副产物，含有丰富的蛋白质，包括菜籽球蛋白以及菜籽白蛋白等，菜籽球蛋白富含赖氨酸和甲硫氨酸，菜籽白蛋白富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸，能降低癌细胞线粒体膜电位，促进细胞色素C从线粒体到胞浆的释放，进而激活Caspase蛋白，诱导癌细胞的凋亡，具有较好的抗肿瘤活性。但是，植物细胞壁较厚，通常难以完全破裂使得活性蛋白质的提取率较低。
氯毒素是一种蝎毒肽，能靶向作用于离子通道，具有修饰、调节或阻断Na+、K+、Cl-、Ca2+通道的功能，抑制多种癌细胞系的增殖，抑制新血管形成的生长因子、血管内皮生长因子的表达，从而发挥抗肿瘤作用。同时，对免疫细胞的多种促炎症标志物具有调节作用，减少炎症反应，提高机体免疫力。蜂毒肽作为一种来源于蜂毒的天然毒素提取物，不仅可以通过破坏细胞膜磷脂双层直接杀伤肿瘤细胞，还能通过抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、参与免疫调节、抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移的能力干扰肿瘤组织生物学行为发挥抗肿瘤作用，两者具有协同增效的作用。
在本发明发酵菌（富硒酵母菌和植物乳杆菌）的协同酶促发酵作用下，一方面能够促进硒化蛋白肽的产生，另一方面，能够将氯毒素以及蜂毒肽中人体抗性物质（对人体不利的物质）发酵降解，从而提高了产物的安全性和有效性，同时，发酵产生的副产物包括活性蛋白肽也提高了其抗肿瘤、提高免疫力等的效果。
本发明经过富硒酵母菌发酵后，获得的硒化蛋白肽含有丰富的微量元素硒，能够清除自由基，保护细胞膜、核酸、蛋白质的正常结构与功能，拮抗重金属的毒性，通过多种途径调节与肿瘤生物学特性相关的基因表达、蛋白质合成，促进“抗肿瘤新生血管抑制因子”的生长，从而抑制肿瘤新生血管的形成，抑制肿瘤细胞的增殖，切断肿瘤细胞的营养供应渠道，极大的提高肿瘤治疗的效果。
进一步将制得的硒化蛋白肽与金属离子铁和锌螯合，含有的锌离子能参与多种人体酶的合成，增强抵抗力，促进性机能，改善化疗后机体的不适，促进机体正常细胞的恢复和生长。铁离子可以消灭肿瘤细胞，切断肿瘤的血液供应，激发免疫系统的攻击，提高肿瘤细胞对化疗的反应，降低肿瘤细胞的免疫易感性，增加肿瘤细胞的死亡率，两种金属离子的添加也具有协同增效的作用。
三七总皂苷能提高身体的免疫力,并且还能够抑制癌细胞的增长,能够起到抗癌的作用，人参皂苷Rh2能够提升病人的免疫功能，促进免疫调节因子白蛋白的合成，能减小化疗遗留毒性，逆转肿瘤异常分化，在两种组分的协同作用下，能很好的改善化疗后机体免疫力低下，同时起到辅助化疗药物提高抗肿瘤效果的作用。
本发明制备的硒化蛋白肽金属复合物和活性组合物在脂质体包埋后，在脂质体表面叶酸改性，能够使得其在肿瘤微环境部位释放后，与肿瘤靶向受体叶酸受体特异性结合，实现药物的主动靶向输送，降低了药物的添加量，大大提高了药物的疗效，降低了成本，提高了患者的顺从性。
本发明制备的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽是一种由多肽FOVVVEF在碱性环境下形成的水凝胶，具有高度亲和力、非免疫原性、可生物降解、可注射、可局部给药等优点，同时，具有pH响应性，通过自身结构的可逆膨胀或收缩，发生溶胶-凝胶相转变，控制药物的释放，其中，两端的苯丙氨酸（F）能够提供π-π作用力以及疏水作用力，从而便于多肽形成β折叠构象，碱性氨基酸鸟氨酸（O）在pH降低，肿瘤微酸环境中，质子化程度增强，多肽之间的静电斥力增大，促进多肽水凝胶向溶液转变，使得药物得以局部缓释释放，提高疗效的同时又减少了药物毒副作用。
本发明制备的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽具有高度亲和力、非免疫原性、安全有效，能够实现靶向缓释释放，具有较好的抗肿瘤以及辅助化疗后提高机体免疫力以及提高抗肿瘤效果的特点，成本低，效果好，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
富硒酵母菌（购于安琪酵母股份有限公司）和植入乳杆菌（购于中科嘉亿生物工程技术有限公司）菌种种子液的制备方法：将菌种接种至高氏培养基中，40℃，100r/min，活化培养24h，制得菌种种子液，含菌量为108-109cfu/mL。
纤维素酶，2万U/g，中性蛋白酶，5万U/g，购于夏盛酶生物技术有限公司。
磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000，购于美国Avanti公司。
FOVVVEF多肽购于南京杰肽生物科技有限公司，使用用固相多肽合成法制备得到。
蜂毒肽购于范德（北京）生物科技有限责任公司；氯毒素购于杭州肽佳生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:3g/mL，置于液氮中冷冻15min，室温融解，1000W超声波搅拌提取0.5h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将12重量份螺旋藻、7重量份葛仙米藻、5重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:7g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复2次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热至45℃，搅拌酶解2h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的2wt%和1wt%；
所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为5:10；
S3.混合蛋白的发酵：将5重量份蜂毒肽、3重量份氯毒素、50重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入12重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为2v/v%和1v/v%，37℃，100r/min，酶助发酵培养48h，过滤，滤液用2kDa的透析袋透析5h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入5重量份硫酸铁和7重量份硫酸锌，搅拌反应20min，用2kDa的透析袋透析2h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将12重量份人参皂苷Rh2、7重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将4重量份胆固醇、5重量份大豆卵磷脂、7重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将7重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、2重量份步骤S5制得的活性组合物、3重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，500W超声处理15min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将15重量份FOVVVEF多肽溶于100重量份水中，加入3重量份步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为7.3，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
实施例2
本实施例提供一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:5g/mL，置于液氮中冷冻20min，室温融解，1500W超声波搅拌提取1h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将15重量份螺旋藻、10重量份葛仙米藻、7重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:10g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热至50℃，搅拌酶解4h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的4wt%和2wt%；
所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为7:12；
S3.混合蛋白的发酵：将7重量份蜂毒肽、5重量份氯毒素、70重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入15重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为4v/v%和1.6v/v%，42℃，200r/min，酶助发酵培养56h，过滤，滤液用5kDa的透析袋透析7h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入7重量份硝酸铁和10重量份硝酸锌，搅拌反应30min，用5kDa的透析袋透析4h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将15重量份人参皂苷Rh2、10重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将6重量份胆固醇、7重量份大豆卵磷脂、10重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将10重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、4重量份步骤S5制得的活性组合物、5重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，700W超声处理20min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将20重量份FOVVVEF多肽溶于100重量份水中，加入5重量份步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为7.7，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
实施例3
本实施例提供一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:4g/mL，置于液氮中冷冻20min，室温融解，1200W超声波搅拌提取1h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将13重量份螺旋藻、8重量份葛仙米藻、6重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:8g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热至47℃，搅拌酶解3h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的3wt%和1.5wt%；
所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为6:11；
S3.混合蛋白的发酵：将6重量份蜂毒肽、4重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为3v/v%和1.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入6重量份氯化铁和8重量份氯化锌，搅拌反应25min，用3.5kDa的透析袋透析3h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将13重量份人参皂苷Rh2、8重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将5重量份胆固醇、6重量份大豆卵磷脂、8重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将8重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、3重量份步骤S5制得的活性组合物、4重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，600W超声处理17min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将17重量份FOVVVEF多肽溶于100重量份水中，加入4重量份步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为7.5，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的纤维素酶。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的中性蛋白酶。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加蜗牛提取物。
具体如下：
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将13重量份螺旋藻、8重量份葛仙米藻、6重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:8g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复3次，向融解后的体系加入复合酶，加热至47℃，搅拌酶解3h，得到酶解混合物；
所述复合酶的添加量为体系总质量的4.5wt%；
所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为6:11。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加复合酶。
具体如下：
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将13重量份螺旋藻、8重量份葛仙米藻、6重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:8g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物，加热至47℃，搅拌酶解3h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物的添加量为体系总质量的4.5wt%。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2酶解。
具体如下：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:4g/mL，置于液氮中冷冻20min，室温融解，1200W超声波搅拌提取1h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将13重量份螺旋藻、8重量份葛仙米藻、6重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，得到混合物；
S3.混合蛋白的发酵：将6重量份蜂毒肽、4重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为3v/v%和1.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入6重量份氯化铁和8重量份氯化锌，搅拌反应25min，用3.5kDa的透析袋透析3h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将13重量份人参皂苷Rh2、8重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将5重量份胆固醇、6重量份大豆卵磷脂、8重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将8重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、3重量份步骤S5制得的活性组合物、4重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，600W超声处理17min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将17重量份FOVVVEF多肽溶于100重量份水中，加入4重量份步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为7.5，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加蜂毒肽。
具体如下：
S3.混合蛋白的发酵：将10重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为3v/v%和1.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加氯毒素。
具体如下：
S3.混合蛋白的发酵：将10重量份蜂毒肽、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为3v/v%和1.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未接种植入乳杆菌菌种种子液。
具体如下：
S3.混合蛋白的发酵：将6重量份蜂毒肽、4重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌菌种种子液，接种量为4.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未接种富硒酵母菌菌种种子液。
具体如下：
S3.混合蛋白的发酵：将6重量份蜂毒肽、4重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种植入乳杆菌菌种种子液，接种量为4.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未进行发酵。
具体如下：
S3.混合蛋白的酶解：将6重量份蜂毒肽、4重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，40℃，酶解52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得蛋白肽。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未添加氯化铁。
具体如下：
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入14重量份氯化锌，搅拌反应25min，用3.5kDa的透析袋透析3h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未添加氯化锌。
具体如下：
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入14重量份氯化铁，搅拌反应25min，用3.5kDa的透析袋透析3h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物。
对比例11
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4。
具体如下：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:4g/mL，置于液氮中冷冻20min，室温融解，1200W超声波搅拌提取1h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将13重量份螺旋藻、8重量份葛仙米藻、6重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:8g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热至47℃，搅拌酶解3h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的3wt%和1.5wt%；
所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为6:11；
S3.混合蛋白的发酵：将6重量份蜂毒肽、4重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为3v/v%和1.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
S4.活性组合物的制备：将13重量份人参皂苷Rh2、8重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S5.叶酸脂质体包埋：将5重量份胆固醇、6重量份大豆卵磷脂、8重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将8重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽、3重量份步骤S4制得的活性组合物、4重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，600W超声处理17min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S6.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将17重量份FOVVVEF多肽溶于100重量份水中，加入4重量份步骤S5制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为7.5，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
对比例12
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加硒化蛋白肽金属复合物。
具体如下：
S6.叶酸脂质体包埋：将5重量份胆固醇、6重量份大豆卵磷脂、8重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将11重量份步骤S5制得的活性组合物、4重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，600W超声处理17min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体。
对比例13
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加活性组合物。
具体如下：
S6.叶酸脂质体包埋：将5重量份胆固醇、6重量份大豆卵磷脂、8重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将11重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、4重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，600W超声处理17min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体。
对比例14
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加叶酸。
具体如下：
S6.脂质体包埋：将5重量份胆固醇、6重量份大豆卵磷脂、8重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将8重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、3重量份步骤S5制得的活性组合物加入100重量份水中，加入脂质膜中，600W超声处理17min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得包埋脂质体。
对比例15
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S7。
具体如下：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:4g/mL，置于液氮中冷冻20min，室温融解，1200W超声波搅拌提取1h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将13重量份螺旋藻、8重量份葛仙米藻、6重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:8g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热至47℃，搅拌酶解3h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的3wt%和1.5wt%；
所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为6:11；
S3.混合蛋白的发酵：将6重量份蜂毒肽、4重量份氯毒素、60重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入13重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，接种量分别为3v/v%和1.3v/v%，40℃，150r/min，酶助发酵培养52h，过滤，滤液用3.5kDa的透析袋透析6h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入6重量份氯化铁和8重量份氯化锌，搅拌反应25min，用3.5kDa的透析袋透析3h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将13重量份人参皂苷Rh2、8重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将5重量份胆固醇、6重量份大豆卵磷脂、8重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将8重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、3重量份步骤S5制得的活性组合物、4重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，600W超声处理17min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体，即为用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
测试例1
将本发明实施例1-3和对比例15制得的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽，稳定一夜，于第二天在管中加入200μL PBS缓冲液（pH=7.5以及pH=6）作为凝胶释放液并记为0h，在24、48、120h分别收集释放液并加入等体积的新鲜释放液，测试释放液中人参皂苷Rh2的含量，计算释放液中人参皂苷Rh2对应质量并计算累计释放百分比。
结果见表1。
表1 各组累计释放百分比（%）
由上表可知，本发明实施例1-3中，经过FOVVVEF多肽水凝胶负载后的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽具有很好的pH响应性，在pH较低时，能很好释放药物。
测试例2 小鼠抗肿瘤及免疫调节实验
细胞培养与动物造模：
将鼠源结肠癌CT26.WT细胞在37℃、5%CO2恒温恒湿CO2培养箱中培养，选择处于对数生长的细胞，用PBS缓冲液调整为2×107个/mL的细胞悬液。取200μL细胞悬液接种于SPF级6-8周龄BALB/c小鼠（体质量18-22g）右前肢皮下，若1周左右肿瘤体积长至90-110mm3，造模成功；空白组小鼠于右前肢皮下注射200μL生理盐水。
分组与给药：
将未造模的小鼠设为空白组，造模成功的小鼠随机分为模型组、阳性药组、实施例1-5组、对比例1-15组，空白组和模型组每日灌胃给与0.5mL蒸馏水，阳性药组每2日注释1次，25μg/mL的5氟尿嘧啶生理盐水溶液，0.1mL/只，实施例1-5和对比例1-15组每日灌胃给与0.5g相应组制备的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽，每组6只，连续给药2周。
对肿瘤生长的影响：
末次干预结束后，摘眼球采血后，颈椎脱臼处死小鼠，将肿瘤取出称重并计算抑瘤率：
抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-实验组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%
结果见表2。
表2
注释：*为与阳性药组相比，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽能很好地抑制肿瘤生长，具有很好的抗肿瘤效果。
小鼠免疫器官指数计算：
从处死的小鼠中，取出完整的小鼠脾脏和胸腺，并称取其质量，计算小鼠脾脏指数和胸腺指数。
脏器指数=脏器质量（mg）/小鼠体质量（g）
结果见表3。
表3
注释：*为与模型组相比，P<0.05；#为与阳性药组相比，P<0.05。
免疫抑制是化疗药物的主要不良反应，通常化疗后机体免疫力会受到重创，免疫器官的脏器指数降低，胸腺和脾脏是重要的免疫器官，可以直接反映机体的免疫功能。由上表可知，本发明实施例1-3制得的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽能很好地改善小鼠的脏器指数，提高小鼠的免疫力。
小鼠血清中细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量对比：
摘眼球采血，静置2h后，离心取血清。按ELISA试剂盒说明书的方法对血清中白细胞介素-2（IL-2）、可溶性二聚体细胞因子（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量进行测试。
结果见表4。
表4
注释：*为与空白组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。
TNF-α是一种强大的免疫介质，可直接诱导肿瘤细胞凋亡。IL-2能够提高免疫力，促进自体肿瘤的杀伤。IFN-γ具有很强的抗肿瘤和抗血管生成活性，能够抑制癌细胞的生长。由上表可知，本发明实施例1-3制得的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽能很好地提高小鼠血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达，提高免疫力和抗肿瘤效果。由于化疗药会降低免疫水平，因此，本发明实验组在参与免疫调节的细胞因子水平上明显显著高于阳性药组。
螺旋藻、葛仙米藻中富含活性蛋白质，包括藻胆蛋白等，能抑制肿瘤细胞组装成微管，影响增殖，对多种移植瘤抑制作用显著，菜籽饼粕是菜籽油生产中的副产物，含有丰富的蛋白质，包括菜籽球蛋白以及菜籽白蛋白等，菜籽球蛋白富含赖氨酸和甲硫氨酸，菜籽白蛋白富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸，能降低癌细胞线粒体膜电位，促进细胞色素C从线粒体到胞浆的释放，进而激活Caspase蛋白，诱导癌细胞的凋亡，具有较好的抗肿瘤活性。但是，植物细胞壁较厚，通常难以完全破裂使得活性蛋白质的提取率较低。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为单一的纤维素酶或中性蛋白酶。对比例2与实施例3相比，步骤S2中未添加复合酶。本发明与复合酶协同作用下，能够大大提高对植物细胞壁的破壁作用以及对难溶性蛋白质如糖蛋白等的降解效果，从而大大提高了螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕中活性蛋白质的提取效率。
对比例1与实施例3相比，步骤S2中未添加蜗牛提取物。对比例3与实施例3相比，未进行步骤S2酶解。抑瘤率下降，脏器指数下降，细胞因子含量下降。蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中提取的一种含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等20多种酶的高效混合酶，具有很强的生物转化能力，专一性强、反应条件温和、转化效率高、绿色环保，能够大大提高对植物细胞壁的破壁作用以及对难溶性蛋白质如糖蛋白等的降解效果，从而大大提高了螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕中活性蛋白质的提取效率。
对比例4、5与实施例3相比，步骤S3中未添加蜂毒肽或氯毒素。抑瘤率下降，脏器指数下降，细胞因子含量下降。氯毒素是一种蝎毒肽，能靶向作用于离子通道，具有修饰、调节或阻断Na+、K+、Cl-、Ca2+通道的功能，抑制多种癌细胞系的增殖，抑制新血管形成的生长因子、血管内皮生长因子的表达，从而发挥抗肿瘤作用。同时，对免疫细胞的多种促炎症标志物具有调节作用，减少炎症反应，提高机体免疫力。蜂毒肽作为一种来源于蜂毒的天然毒素提取物，不仅可以通过破坏细胞膜磷脂双层直接杀伤肿瘤细胞，还能通过抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、参与免疫调节、抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移的能力干扰肿瘤组织生物学行为发挥抗肿瘤作用，两者具有协同增效的作用。
对比例6、7与实施例3相比，步骤S3中未接种植入乳杆菌菌种种子液或富硒酵母菌菌种种子液。对比例8与实施例3相比，步骤S3中未进行发酵。抑瘤率下降，脏器指数下降，细胞因子含量下降。在本发明发酵菌，包括富硒酵母菌和植物乳杆菌，协同酶促发酵作用下，一方面能够促进硒化蛋白肽的产生，另一方面，能够将蝎毒肽以及蜂毒肽中人体抗性物质（对人体不利的物质）发酵降解，从而提高了产物的安全性和有效性，同时，发酵产生的副产物包括活性蛋白肽也提高了其抗肿瘤、提高免疫力等的效果。本发明经过富硒酵母菌发酵后，获得的硒化蛋白肽含有丰富的微量元素硒，能够清除自由基，保护细胞膜、核酸、蛋白质的正常结构与功能，拮抗重金属的毒性，通过多种途径调节与肿瘤生物学特性相关的基因表达、蛋白质合成，促进“抗肿瘤新生血管抑制因子”的生长，从而抑制肿瘤新生血管的形成，抑制肿瘤细胞的增殖，切断肿瘤细胞的营养供应渠道，极大的提高肿瘤治疗的效果。
对比例9、10与实施例3相比，步骤S4中未添加氯化铁或氯化锌。对比例11与实施例3相比，未进行步骤S4。抑瘤率下降，脏器指数下降，细胞因子含量下降。对比例12与实施例3相比，步骤S6中未添加硒化蛋白肽金属复合物。本发明将制得的硒化蛋白肽与金属离子铁和锌螯合，含有的锌离子能参与多种人体酶的合成，增强抵抗力，促进性机能，改善化疗后机体的不适，促进机体正常细胞的恢复和生长。铁离子可以消灭肿瘤细胞，切断肿瘤的血液供应，激发免疫系统的攻击，提高肿瘤细胞对化疗的反应，降低肿瘤细胞的免疫易感性，增加肿瘤细胞的死亡率，两种金属离子的添加也具有协同增效的作用。
对比例13与实施例3相比，步骤S6中未添加活性组合物。抑瘤率下降，脏器指数下降，细胞因子含量下降。三七总皂苷能提高身体的免疫力,并且还能够抑制癌细胞的增长,能够起到抗癌的作用，人参皂苷Rh2能够提升病人的免疫功能，促进免疫调节因子白蛋白的合成，能减小化疗遗留毒性，逆转肿瘤异常分化，在两种组分的协同作用下，能很好的改善化疗后机体免疫力低下，同时起到辅助化疗药物提高抗肿瘤效果的作用。
对比例14与实施例3相比，步骤S6中未添加叶酸。抑瘤率下降。本发明制备的硒化蛋白肽金属复合物和活性组合物在脂质体包埋后，在脂质体表面叶酸改性，能够使得其在肿瘤微环境部位释放后，与肿瘤靶向受体叶酸受体特异性结合，实现药物的主动靶向输送，降低了药物的添加量，大大提高了药物的疗效，降低了成本，提高了患者的顺从性。
对比例15与实施例3相比，未进行步骤S7。抑瘤率下降，同时制得的产品不具有pH响应性。本发明制备的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽是一种由多肽FOVVVEF在碱性环境下形成的水凝胶，具有高度亲和力、非免疫原性、可生物降解、可注射、可局部给药等优点，同时，具有pH响应性，通过自身结构的可逆膨胀或收缩，发生溶胶-凝胶相转变，控制药物的释放，其中，两端的苯丙氨酸（F）能够提供π-π作用力以及疏水作用力，从而便于多肽形成β折叠构象，碱性氨基酸鸟氨酸（O）在pH降低，肿瘤微酸环境中，质子化程度增强，多肽之间的静电斥力增大，促进多肽水凝胶向溶液转变，使得药物得以局部缓释释放，提高疗效的同时又减少了药物毒副作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备方法，其特征在于，将螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕反复冻融后，加入蜗牛提取物和复合酶酶解，然后加入蜂毒肽、氯毒素、葡萄糖混合发酵，透析，产物与铁离子和锌离子螯合，制得硒化蛋白肽金属复合物，与人参皂苷Rh2、三七总皂苷混合均匀包埋于叶酸脂质体中，加入含有FOVVVEF多肽的溶液中，调节为碱性形成凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽；
包括以下步骤：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，置于液氮中冷冻，室温融解，超声波搅拌提取，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，置于液氮中冷冻，室温融解，重复2-3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热搅拌酶解，得到酶解混合物；所述螺旋藻、葛仙米藻、菜籽饼粕的质量比为12-15:7-10:5-7，所述混合粉和水的固液比为1:7-10g/mL，所述液氮中冷冻的时间15-30min，所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的2-4wt％和1-2wt％，所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为5-7:10-12，所述加热搅拌酶解的温度为45-50℃，时间为2-4h；
S3.混合蛋白的发酵：将蜂毒肽、氯毒素、步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，酶助发酵培养，过滤，滤液透析，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；所述蜂毒肽、氯毒素、酶解混合物、葡萄糖的质量比为5-7:3-5:50-70：12-15，所述富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL，接种量分别为2-4v/v％和1-1.6v/v％，所述酶助发酵培养的条件为37-42℃，100-200r/min，酶助发酵培养48-56h，所述透析用的透析袋孔径为2-5kDa，时间为5-7h；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于水中，加入铁盐和锌盐，搅拌反应，透析，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将人参皂苷Rh2、三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；所述人参皂苷Rh2、三七总皂苷的质量比为12-15:7-10；
S6.叶酸脂质体包埋：将胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、步骤S5制得的活性组合物、叶酸加入水中，加入脂质膜中，超声处理后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；所述胆固醇、大豆卵磷脂、磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000、硒化蛋白肽金属复合物、步骤S5制得的活性组合物、叶酸的质量比为4-6:5-7:7-10:7-10:2-4:3-5；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将FOVVVEF多肽溶于水中，加入步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为碱性，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述蜗牛干粉和水的固液比为1:3-5g/mL，所述液氮中冷冻的时间为15-20min，所述超声波搅拌提取的功率为1000-1500W，时间为0.5-1h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述硒化蛋白肽、铁盐和锌盐的质量比为100:5-7:7-10，所述铁盐选自氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的至少一种，所述锌盐选自氯化锌、硫酸锌、硝酸锌中的至少一种，所述搅拌反应的时间为20-30min，所述透析用的透析袋孔径为2-5kDa，时间为2-4h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述超声处理的功率为500-700W，时间为15-20min；步骤S7中所述FOVVVEF多肽、叶酸包埋脂质体的质量比为15-20:3-5，所述调节溶液pH值为7.3-7.7。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.蜗牛提取物的制备：将蜗牛去壳，冷冻干燥，粉碎，得到蜗牛干粉，加入水中，所述蜗牛干粉和水的固液比为1:3-5g/mL，置于液氮中冷冻15-20min，室温融解，1000-1500W超声波搅拌提取0.5-1h，过滤，滤液冷冻干燥，制得蜗牛提取物；
S2.抗肿瘤植物蛋白的酶解：将12-15重量份螺旋藻、7-10重量份葛仙米藻、5-7重量份菜籽饼粕洗净，干燥，粉碎混合均匀，得到混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:7-10g/mL，置于液氮中冷冻，室温融解，重复2-3次，向融解后的体系加入步骤S1制得的蜗牛提取物、复合酶，加热至45-50℃，搅拌酶解2-4h，得到酶解混合物；
所述蜗牛提取物、复合酶的添加量分别为体系总质量的2-4wt％和1-2wt％，所述复合酶包括纤维素酶和中性蛋白酶，质量比为5-7:10-12；
S3.混合蛋白的发酵：将5-7重量份蜂毒肽、3-5重量份氯毒素、50-70重量份步骤S2制得的酶解混合物混合均匀，加入12-15重量份葡萄糖，灭菌，接种富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液，37-42℃，100-200r/min，酶助发酵培养48-56h，过滤，滤液用2-5kDa的透析袋透析5-7h，收集透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽；
所述富硒酵母菌和植入乳杆菌菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL，接种量分别为2-4v/v％和1-1.6v/v％；
S4.硒化蛋白肽金属复合物的制备：将100重量份步骤S3制得的硒化蛋白肽溶于300重量份水中，加入5-7重量份铁盐和7-10重量份锌盐，搅拌反应20-30min，用2-5kDa的透析袋透析2-4h，透析液冷冻干燥，制得硒化蛋白肽金属复合物；
S5.活性组合物的制备：将12-15重量份人参皂苷Rh2、7-10重量份三七总皂苷混合均匀，制得活性组合物；
S6.叶酸脂质体包埋：将4-6重量份胆固醇、5-7重量份大豆卵磷脂、7-10重量份磷脂聚乙二醇2000衍生物DSPE-PEG2000溶于50重量份二氯甲烷中，减压除去溶剂，形成脂质膜；将7-10重量份步骤S4制得的硒化蛋白肽金属复合物、2-4重量份步骤S5制得的活性组合物、3-5重量份叶酸加入100重量份水中，加入脂质膜中，500-700W超声处理15-20min后，形成乳浊液，冷冻干燥，制得叶酸包埋脂质体；
S7.用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽的制备：将15-20重量份FOVVVEF多肽溶于100重量份水中，加入3-5重量份步骤S6制得的叶酸包埋脂质体，调节溶液pH值为7.3-7.7，获得凝胶，制得用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽。
7.一种如权利要求6所述用于肿瘤患者化疗后的缓释多肽在制备治疗结肠癌的药品中的应用。
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WO2018067604A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-12 Houn Simon Hsia Compositions and methods for enhancing cancer radiotherapy
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