CN116144724A - 一种肿瘤患者康复用复合肽、喷雾剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种肿瘤患者康复用复合肽、喷雾剂及其制备方法，属于药品技术领域，从大豆中提取得到大豆卵磷脂，滤渣留用，经过二酸酐改性得到改性大豆卵磷脂，滤渣和碳源、维生素、无机盐加入水中，配制成发酵培养基，接种活化的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌，发酵培养后，杀菌，复合酶酶解，加入三氯醋酸溶液，加热沸腾提取，离心，消化酶酶解，制得活性菌肽，与蜂毒肽、防御素、乳铁蛋白混合制得活性组合物，包埋于改性大豆卵磷脂制得的脂质体中，得到肿瘤患者康复用复合肽。本发明制得的一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂明显提高肿瘤患者的免疫力，导致癌细胞坏死或凋亡，从而有助于肿瘤患者的康复，具有广阔的应用前景。

Description

一种肿瘤患者康复用复合肽、喷雾剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及药品技术领域，具体涉及一种肿瘤患者康复用复合肽、喷雾剂及其制备方法。
背景技术
癌症，又称恶性肿瘤，是由于多因素引发、多基因突变、多阶段发展的多发病，传统化疗药物在临床使用过程中产生的严重毒副作用和肿瘤细胞的多重耐药性等问题严重限制了它们在肿瘤治疗中的应用。一般癌症发现大都到了中晚期，迫不得已需要采取手术治疗方法，手术治疗是一个非常痛苦的过程，术后常常出现痰多咳嗽、腹胀反酸、腹泻便秘、食少不化，体乏无力、忧虑失眠等的等症状。
多肽是由少量氨基酸(10-100个)组成的小“蛋白”，具有分子量小、易改造修饰、结构清楚、作用机制明确、活性接近蛋白等优点，集化学药和蛋白药优势于一身，对于肿瘤术后以及化疗/放疗后有很好的促进机体恢复，提高免疫力的效果。
现有的针对肿瘤康复的产品品类繁多，包括中国专利申请CN101112615A公开了一种抗肿瘤保健食品的产品配方，采用乌梢蛇原粉为主要原料，配以各种辅料营养增强剂，研制而成的一种抗肿瘤保健食品。具体配方为乌梢蛇原粉、辅酶Q10，白蛋白多肽，谷胱甘肽，金属硫蛋白，维生素B12，维生素E，维生素C，硒蛋白，灵芝孢子破壁粉。另一件中国专利申请CN104473144A公开了具有抗肿瘤功效的保健食品及其制备工艺，它由灰树花多糖、云芝多糖、香菇多糖、树舌多糖、鸡腿菇多糖组成，其重量百分比为：灰树花多糖10-65％、云芝多糖10-50％、香菇多糖5-40％、树舌多糖10-30％、鸡腿菇多糖5-10％，通过培养、过滤、提纯、干燥、粉碎、复配、灌装制得。这些产品营养较为全面，能够增强人体的免疫力，但是上述食品均为保健食品，无法作为医用食品使用；上述保健食品营养配比还不够合理，无需医嘱，只是盲目地进行营养摄入，却并不能使肿瘤患者增强对肿瘤的预防和抑制作用，因此无法有效地辅助肿瘤患者进行康复。
因此，目前市场上缺少有效的肿瘤康复型的复合蛋白肽类产品。
发明内容
本发明的目的在于提出一种肿瘤患者康复用复合肽、喷雾剂及其制备方法，能够明显提高皮肤对肿瘤患者康复用复合肽的吸收效率，无刺激性和过敏性反应，毒性极小，明显提高肿瘤患者的免疫力，导致癌细胞坏死或凋亡，对肿瘤细胞具有更高的选择性，帮助肿瘤患者进一步清除体内癌细胞，从而有助于肿瘤患者的康复，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种肿瘤患者康复用复合肽的制备方法，从大豆中提取得到大豆卵磷脂，滤渣留用，经过二酸酐改性得到改性大豆卵磷脂，滤渣和碳源、维生素、无机盐加入水中，配制成发酵培养基，接种活化的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌，发酵培养后，杀菌，复合酶酶解，加入三氯醋酸溶液，加热沸腾提取，离心，消化酶酶解，制得活性菌肽，与蜂毒肽、防御素、乳铁蛋白混合制得活性组合物，包埋于改性大豆卵磷脂制得的脂质体中，得到肿瘤患者康复用复合肽。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入乙醇水溶液中，在高压条件下保压提取，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入丙酮中，超声，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.改性：将步骤S1制得的大豆卵磷脂和二酸酐混合均匀，惰性气体保护下，升温反应，离心，洗涤，干燥，制得改性大豆卵磷脂；
S3.发酵培养基的制备：将步骤S1中的滤渣、碳源、维生素、无机盐加入去离子水中，搅拌混合均匀，灭菌，制得发酵培养基；
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，发酵培养，制得发酵液；
S5.活性菌肽的提取：将步骤S4制得的发酵液进行杀菌，加入复合酶，第一次酶解，灭酶，加入三氯醋酸溶液，加热沸腾提取，冷却，第一次离心，弃除沉淀，加入消化酶，第二次酶解，第二次离心，弃除沉淀，溶液第三次离心，收集沉淀，洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
S6.活性组合物的制备：将步骤S5制得的活性菌肽、蜂毒肽、防御素、乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S7.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将步骤S2制得的改性大豆卵磷脂、胆固醇溶于乙醇水溶液中，然后将步骤S6制得的活性组合物溶于缓冲溶液中，加热至35-40℃，合并溶液，均质，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
优选地，所述惰性气体选自氩气、氦气、氮气、氖气中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述乙醇水溶液的浓度为55-65wt%，所述高压条件的压力为400-600MPa，保压提取的时间为20-40min，所述超声的功率为1200-1500W，时间为10-15min；步骤S2中所述二酸酐选自丁二酸酐、丙二酸酐、乙二酸酐、戊二酸酐中的至少一种，所述大豆卵磷脂和二酸酐的质量比为（2-5）:10，所述升温反应的温度为50-70℃，时间为1-2h。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述滤渣、碳源、维生素、无机盐、去离子水的质量比为（10-20）:（15-22）:（0.5-1）:（0.7-1.5）:200；步骤S4中所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，36-38℃，50-70r/min，活化培养12-18h，制得含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为1-3%、2-3%、1-2.5%，所述发酵培养的条件为36-38℃，50-70r/min，发酵培养36-48h。
优选地，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、糖蜜中的至少一种；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E、叶酸中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述杀菌的方法为100-110℃杀菌20-30min，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为（5-7）:2，所述第一次酶解的温度为40-50℃，时间为1-2h，所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为（3-5）:2，所述第二次酶解的温度为35-40℃，时间为1-2h，所述三氯醋酸溶液的浓度为20-40wt%，所述加热沸腾提取的时间为20-30min，所述第一次离心的条件为9000-10000r/min，时间为10-15min，所述第二次离心的条件为3000-5000r/min，时间为3-5min，所述第三次离心的条件为9000-10000r/min，时间为20-30min；步骤S6中所述活性菌肽、蜂毒肽、防御素、乳铁蛋白的质量比为10:（2-3）:（1-3）:（1-3）；步骤S7中所述乙醇水溶液的浓度为40-50wt%，所述改性大豆卵磷脂、胆固醇、活性组合物的质量比为20:（1-3）:（3-5），所述均质的条件为10000-12000r/min，时间为3-5min，所述缓冲溶液为pH为6.8-7.2的PBS缓冲溶液。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的肿瘤患者康复用复合肽。
本发明进一步保护一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，由以下原料按重量百分比制备而成：防腐剂0.0001-0.001%、透皮吸收促进组合物1-2%、表面活性剂0.1-0.7%、上述肿瘤患者康复用复合肽10-15%、生理盐水余量。
优选地，所述防腐剂选自双乙酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾中的至少一种；所述表面活性剂选自甜菊醇糖苷、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、大豆磷脂、乙酸一甘油酯、酒石酸一甘油酯、乙酸二甘油酯、酒石酸二甘油酯、二乙酰酒石酸一甘油酯、二乙酰酒石酸二甘油酯、柠檬酸酯、聚甘油酯肪酸及蓖麻酸脂、硬脂酰柠檬酸及酒石酸酯、硬脂酰乳酸钙、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰富马酸钠、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯20、聚氧乙烯40、硬脂酸酯中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，所述透皮吸收促进组合物包括薄荷脑和透皮吸收促进剂，质量比为2:5-7；所述透皮吸收促进剂的结构式如式I所示：
Figure SMS_1
式I。
作为本发明的进一步改进，所述透皮吸收促进剂的合成方法如下：
T1.将二水合糖精钠、碱和3-溴-1丙醇混合反应，制得中间体，结构如下：
Figure SMS_2
；
T2.将中间体、碱和2-（2-溴乙基）-1,3-二氧戊环混合反应，制得透皮吸收促进剂。
优选地，所述二水合糖精钠、碱和3-溴-1丙醇的摩尔比为1:（3-5）:（1-1.1）；所述碱选自三乙胺、二乙胺、三甲胺、三正丁胺、三丙胺中的至少一种。
优选地，所述中间体、碱和2-（2-溴乙基）-1,3-二氧戊环的摩尔比为1:（3-5）:（1-1.1）；所述碱选自三乙胺、二乙胺、三甲胺、三正丁胺、三丙胺、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
本发明进一步保护一种上述肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将透皮吸收促进组合物加入水中，加入肿瘤患者康复用复合肽和防腐剂，搅拌混合20-30min，加入表面活性剂，搅拌混合15-30min，过滤，灌封，制得肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂。
本发明具有如下有益效果：活性肽特点为分子质量小，极易穿透瘤细胞，具有较强的稳定性，可以通过提高免疫应答、抑制肿瘤血管形成等作用抑制肿瘤的生长和转移。活性菌肽含有丰富的胞壁酰二肽、脂多糖、肽聚糖等活性物质，可与细胞内肽结合形成HSP-肽复合物，激发机体产生抗原肽非依赖的固有免疫应答和抗原肽依赖的适应免疫应答，并且通过促进淋巴细胞增殖、增加白介素或细胞因子释放及提高自然杀伤细胞的活性等途径起到抗细胞增殖的作用。另外，还可以通过增强免疫细胞应答及肝脏网状内皮细胞的功能，提高机体对肿瘤的免疫力，提高机体的免疫能力，促进肿瘤患者康复。
在活性菌肽的制备过程中，首先为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌提供氮含量丰富的发酵培养基（通过添加足量的大豆滤渣），从而促进发酵菌的发酵产生丰富的蛋白质类物质，然后首先通过复合酶酶解发酵菌的细胞壁，促进胞内、胞外蛋白、糖的溶出，进一步采用三氯乙酸去除磷酸壁，采用消化酶将蛋白质酶解成小分子短肽、多肽等活性物质，使得本发明活性菌肽的制备方法简单，条件温和，制备周期缩短。
蜂毒肽、防御素是具有很好肿瘤细胞杀伤功能的抗菌肽，能够抗炎、镇痛、免疫增强、药物增敏等作用，由于癌细胞膜外带负电荷的磷脂酰丝氨酸和氧糖基化粘液素的过度表达意味着与正常的真核细胞相比，它们携带更多的净负电荷。蜂毒肽、防御素带有丰富的正电中心，且序列较短，在非极性溶剂中会形成两性分子结构。当诱导坏死的肽与细胞膜结合后，肽会通过膜溶解或膜穿孔机制使细胞膜被破坏，导致癌细胞坏死或凋亡，对肿瘤细胞具有更高的选择性，能够通过膜溶解方式杀死对化疗产生抗性的癌细胞，帮助肿瘤患者进一步清除体内癌细胞，从而对于肿瘤患者的康复有明显的促进作用。
但是，由于蜂毒肽分子结构中没有羧基，且含有3个赖氨酸和2个精氨酸残基，使其成为一种强碱性肽，具有较强的溶血副作用，因此，限制了其直接应用。另外，乳铁蛋白化学不稳定，在温湿的环境中容易降解失活，因此，需要将这些活性组合物采用包埋的方法包埋以提高其稳定性，还可以起到缓控释的效果，增强药效，延长药品的使用时间。脂质体作为药物载体可以提高药物的治疗指数，延长疗效，并可达到缓控释和靶向给药目的。但是，普通的脂质体稳定性较差，易破裂或者聚集成团，且磷脂材料易氧化，为了改善脂质体的稳定性，本发明对大豆卵磷脂进行二酸酐改性处理，大大提高了脂质体的稳定性，另外，本发明制备了一种乙醇脂质体，与普通脂质体相比，透皮速率及皮肤滞留药量显著提高，从而大大增强了药效。而且，大豆卵磷脂也可以起到很好的帮助肿瘤患者康复，软化血管、降低血压和胆固醇的功能，提高机体免疫力。
本发明制备了一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，不仅可以避免因口服给药而产生的肠胃内消化酶对药物的分解、破坏作用和肝脏的首过效应，还可以避免因静脉注射而引起的痛楚和感染，最重要的是可以通过控制药剂输送的速率，产生持续恒定的血药浓度，降低药物的毒副作用。
该肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂中含有肿瘤患者康复用复合肽，并添加了制备的透皮吸收促进组合物，该组合物包括透皮吸收促进剂和薄荷醇，薄荷醇对亲水性和亲脂性化合物的透皮吸收均有显著促进作用。本发明透皮吸收促进剂是一种高效皮肤渗透促进剂，结构中的双氧五环易于插入到磷脂双分子层结构中去，从而扰乱磷脂双分子层，促进药物的透皮吸收。另外一部分为类似噻酮结构，对皮肤无刺激性和过敏性反应，毒性极小，促渗效果明显优于氮酮。两者之间具有明显的协同增效的作用。
因此，本发明制得的一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂能够明显提高皮肤对肿瘤患者康复用复合肽的吸收效率，无刺激性和过敏性反应，毒性极小，明显提高肿瘤患者的免疫力，导致癌细胞坏死或凋亡，对肿瘤细胞具有更高的选择性，帮助肿瘤患者进一步清除体内癌细胞，从而有助于肿瘤患者的康复，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明透皮吸收促进剂的合成路线图；
图2为本发明测试例4中体外透皮试验对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
嗜酸乳杆菌，为嗜酸乳杆菌JYLA-191，100亿cfu/mL，植物乳杆菌，为植物乳杆菌JYLP-326，100亿cfu/mL，保加利亚乳杆菌，为保加利亚乳杆菌LB-Z16，100亿cfu/mL，购于山东中科嘉亿生物工程有限公司。
纤维素酶，SDG-2425，为纤维素酶H型，1万U/g，果胶酶，SDG-2408，为果胶酶H型，2.5万U/g，胰蛋白酶，GDG-2016，4万U/g，购于夏盛（北京）生物科技开发有限公司；ɑ-糜蛋白酶，CHY5S-10VL，购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。
蜂毒肽，纯度>99%，防御素，纯度>99%，购于绍兴市均宇生物科技有限公司。
乳铁蛋白，纯度>95%，购于陕西帕尼尔生物科技有限公司。
制备例1 透皮吸收促进剂的合成
如图1，方法如下：
T1.将1mol二水合糖精钠、3mol三丙胺和1mol 3-溴-1丙醇加入200mL 70wt%乙醇水溶液中，加热至75℃，搅拌混合反应4h，冷却至室温，过滤，洗涤，干燥，制得中间体；
T2.将1mol中间体、3mol三丙胺和1mol 2-（2-溴乙基）-1,3-二氧戊环溶于200mL二氯甲烷中，加热回流，搅拌反应2h，冷却至室温，过滤，洗涤，重结晶，制得透皮吸收促进剂。ESI-MS计算值：C15H20NO6S (M+H)+ 342.09，实测值：342.1，收率为94.5%。
透皮吸收促进剂的核磁结果：1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 8.23（d，J=7.2Hz，1H），8.12（d，6.5Hz，1H），7.81（dd，J=5.9Hz，6.6Hz，1H），7.42（dd，J=6.0Hz，7.2Hz，1H），4.89（t，1H），3.92（m，4H），3.41-3.39（m，4H），3.15（t，2H），1.77-1.75（m，4H）。
制备例2 透皮吸收促进剂的合成
如图1，方法如下：
T1.将1mol二水合糖精钠、5mol三正丁胺和1.1mol 3-溴-1丙醇加入200mL 70wt%乙醇水溶液中，加热至77℃，搅拌混合反应5h，冷却至室温，过滤，洗涤，干燥，制得中间体；
T2.将1mol中间体、5mol三正丁胺和1.1mol 2-（2-溴乙基）-1,3-二氧戊环溶于200mL二氯甲烷中，加热回流，搅拌反应3h，冷却至室温，过滤，洗涤，重结晶，制得透皮吸收促进剂。ESI-MS计算值：C15H20NO6S (M+H)+ 342.09，实测值：342.1，收率为95.2%。
制备例3 透皮吸收促进剂的合成
如图1，方法如下：
T1.将1mol二水合糖精钠、4mol三乙胺和1.05mol 3-溴-1丙醇加入200mL 70wt%乙醇水溶液中，加热至75℃，搅拌混合反应5h，冷却至室温，过滤，洗涤，干燥，制得中间体；
T2.将1mol中间体、4mol三乙胺和1.05mol 2-（2-溴乙基）-1,3-二氧戊环溶于200mL二氯甲烷中，加热回流，搅拌反应3h，冷却至室温，过滤，洗涤，重结晶，制得透皮吸收促进剂。ESI-MS计算值：C15H20NO6S (M+H)+ 342.09，实测值：342.1，收率为95.7%。
实施例1
本实施例提供一种肿瘤患者康复用复合肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将10重量份大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入50重量份55wt%乙醇水溶液中，在400MPa保压提取20min，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入50重量份丙酮中，1200W超声10min，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.改性：将2重量份步骤S1制得的大豆卵磷脂和10重量份戊二酸酐混合均匀，氩气保护下，升温至50℃，搅拌反应1h，3000r/min离心15min，清水洗涤，干燥，制得改性大豆卵磷脂；
S3.发酵培养基的制备：将10重量份步骤S1中的滤渣、10重量份蔗糖、5重量份果糖、0.3重量份维生素E、0.2重量份维生素B2、0.5重量份氯化钠、0.1重量份硫酸锰、0.1重量份氯化锌加入200重量份去离子水中，搅拌混合均匀，紫外线灭菌，制得发酵培养基；
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为1%、2%、1%，36℃，50r/min，发酵培养36h，制得发酵液；
所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，36℃，50r/min，活化培养12h，制得含菌量为108cfu/mL的菌种种子液；
S5.活性菌肽的提取：将50重量份步骤S4制得的发酵液在100℃杀菌20min，加入复合酶，添加量为2g/L，40℃酶解1h，105℃灭酶15min，加入100重量份20wt%三氯醋酸溶液，加热沸腾提取20min，冷却，9000r/min离心10min，弃除沉淀，加入消化酶，添加量为2g/L，35℃酶解1h，3000r/min离心3min，弃除沉淀，溶液9000r/min离心20min，收集沉淀，清水洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为5:2；
所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为3:2；
S6.活性组合物的制备：将10重量份步骤S5制得的活性菌肽、2重量份蜂毒肽、1重量份防御素、1重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S7.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将20重量份步骤S2制得的改性大豆卵磷脂、1重量份胆固醇溶于50重量份40wt%乙醇水溶液中，然后将3重量份步骤S6制得的活性组合物溶于30重量份pH=6.8的PBS缓冲溶液中，加热至35℃，合并溶液，10000r/min均质3min，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
实施例2
本实施例提供一种肿瘤患者康复用复合肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将10重量份大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入50重量份65wt%乙醇水溶液中，在600MPa保压提取40min，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入50重量份丙酮中，1500W超声15min，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.改性：将5重量份步骤S1制得的大豆卵磷脂和10重量份丁二酸酐混合均匀，氦气保护下，升温至70℃，搅拌反应2h，3000r/min离心15min，清水洗涤，干燥，制得改性大豆卵磷脂；
S3.发酵培养基的制备：将20重量份步骤S1中的滤渣、22重量份葡萄糖、0.5重量份维生素B12、0.5重量份维生素D、0.5重量份氯化钾、0.2重量份氯化钙、0.2重量份硫酸镁、0.2重量份氯化铁、0.2重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜加入200重量份去离子水中，搅拌混合均匀，紫外线灭菌，制得发酵培养基；
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为3%、3%、2.5%，38℃，70r/min，发酵培养48h，制得发酵液；
所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，38℃，70r/min，活化培养18h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；
S5.活性菌肽的提取：将50重量份步骤S4制得的发酵液在110℃杀菌30min，加入复合酶，添加量为2g/L，50℃酶解2h，105℃灭酶15min，加入100重量份40wt%三氯醋酸溶液，加热沸腾提取30min，冷却，10000r/min离心15min，弃除沉淀，加入消化酶，添加量为2g/L，40℃酶解2h，5000r/min离心5min，弃除沉淀，溶液10000r/min离心30min，收集沉淀，清水洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为7:2；
所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为5:2；
S6.活性组合物的制备：将10重量份步骤S5制得的活性菌肽、3重量份蜂毒肽、3重量份防御素、3重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S7.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将20重量份步骤S2制得的改性大豆卵磷脂、3重量份胆固醇溶于50重量份50wt%乙醇水溶液中，然后将5重量份步骤S6制得的活性组合物溶于30重量份pH=7.2的PBS缓冲溶液中，加热至40℃，合并溶液，12000r/min均质5min，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
实施例3
本实施例提供一种肿瘤患者康复用复合肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将10重量份大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入50重量份60wt%乙醇水溶液中，在500MPa保压提取30min，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入50重量份丙酮中，1350W超声12min，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.改性：将3.5重量份步骤S1制得的大豆卵磷脂和10重量份乙二酸酐混合均匀，氮气保护下，升温至60℃，搅拌反应1.5h，3000r/min离心15min，清水洗涤，干燥，制得改性大豆卵磷脂；
S3.发酵培养基的制备：将15重量份步骤S1中的滤渣、10重量份葡萄糖、9重量份麦芽糖、0.5重量份维生素C、0.2重量份维生素B2、0.5重量份氯化钠、0.1重量份硫酸镁、0.1重量份氯化铁、0.1重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜加入200重量份去离子水中，搅拌混合均匀，紫外线灭菌，制得发酵培养基；
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为2%、2.5%、1.5%，37℃，60r/min，发酵培养42h，制得发酵液；
所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，37℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；
S5.活性菌肽的提取：将50重量份步骤S4制得的发酵液在105℃杀菌25min，加入复合酶，添加量为2g/L，45℃酶解1.5h，105℃灭酶15min，加入100重量份30wt%三氯醋酸溶液，加热沸腾提取25min，冷却，9500r/min离心10min，弃除沉淀，加入消化酶，添加量为2g/L，37℃酶解1.5h，4000r/min离心4min，弃除沉淀，溶液9500r/min离心25min，收集沉淀，清水洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为6:2；
所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为4:2；
S6.活性组合物的制备：将10重量份步骤S5制得的活性菌肽、2.5重量份蜂毒肽、2重量份防御素、2重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S7.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将20重量份步骤S2制得的改性大豆卵磷脂、2重量份胆固醇溶于50重量份45wt%乙醇水溶液中，然后将4重量份步骤S6制得的活性组合物溶于30重量份pH=7的PBS缓冲溶液中，加热至37℃，合并溶液，11000r/min均质4min，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的纤维素酶。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的果胶酶。
实施例6
与实施例3相比，不同之处在于，消化酶为单一的胰蛋白酶。
实施例7
与实施例3相比，不同之处在于，消化酶为单一的ɑ-糜蛋白酶。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2。
包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将10重量份大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入50重量份60wt%乙醇水溶液中，在500MPa保压提取30min，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入50重量份丙酮中，1350W超声12min，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.发酵培养基的制备：将15重量份步骤S1中的滤渣、10重量份葡萄糖、9重量份麦芽糖、0.5重量份维生素C、0.2重量份维生素B2、0.5重量份氯化钠、0.1重量份硫酸镁、0.1重量份氯化铁、0.1重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜加入200重量份去离子水中，搅拌混合均匀，紫外线灭菌，制得发酵培养基；
S3.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S2制得的发酵培养基中，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为2%、2.5%、1.5%，37℃，60r/min，发酵培养42h，制得发酵液；
所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，37℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；
S4.活性菌肽的提取：将50重量份步骤S3制得的发酵液在105℃杀菌25min，加入复合酶，添加量为2g/L，45℃酶解1.5h，105℃灭酶15min，加入100重量份30wt%三氯醋酸溶液，加热沸腾提取25min，冷却，9500r/min离心10min，弃除沉淀，加入消化酶，添加量为2g/L，37℃酶解1.5h，4000r/min离心4min，弃除沉淀，溶液9500r/min离心25min，收集沉淀，清水洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为6:2；
所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为4:2；
S5.活性组合物的制备：将10重量份步骤S4制得的活性菌肽、2.5重量份蜂毒肽、2重量份防御素、2重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S6.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将20重量份步骤S1制得的大豆卵磷脂、2重量份胆固醇溶于50重量份45wt%乙醇水溶液中，然后将4重量份步骤S5制得的活性组合物溶于30重量份pH=7的PBS缓冲溶液中，加热至37℃，合并溶液，11000r/min均质4min，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中滤渣由蛋白胨替代。
具体如下：
S3.发酵培养基的制备：将15重量份蛋白胨、10重量份葡萄糖、9重量份麦芽糖、0.5重量份维生素C、0.2重量份维生素B2、0.5重量份氯化钠、0.1重量份硫酸镁、0.1重量份氯化铁、0.1重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜加入200重量份去离子水中，搅拌混合均匀，紫外线灭菌，制得发酵培养基。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未接种嗜酸乳杆菌。
具体如下：
S4.发酵：将植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，所述植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为2.5%、1.5%，37℃，60r/min，发酵培养42h，制得发酵液；
所述植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，37℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未接种植物乳杆菌。
具体如下：
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，所述嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为2%、1.5%，37℃，60r/min，发酵培养42h，制得发酵液；
所述嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，37℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未接种保加利亚乳杆菌。
具体如下：
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌菌种种子液的接种量为2%、2.5%，37℃，60r/min，发酵培养42h，制得发酵液；
所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，37℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S3、S4、S5。
包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将10重量份大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入50重量份60wt%乙醇水溶液中，在500MPa保压提取30min，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入50重量份丙酮中，1350W超声12min，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.改性：将3.5重量份步骤S1制得的大豆卵磷脂和10重量份乙二酸酐混合均匀，氮气保护下，升温至60℃，搅拌反应1.5h，3000r/min离心15min，清水洗涤，干燥，制得改性大豆卵磷脂；
S3.活性组合物的制备：将2.5重量份蜂毒肽、2重量份防御素、2重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S4.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将20重量份步骤S2制得的改性大豆卵磷脂、2重量份胆固醇溶于50重量份45wt%乙醇水溶液中，然后将4重量份步骤S6制得的活性组合物溶于30重量份pH=7的PBS缓冲溶液中，加热至37℃，合并溶液，11000r/min均质4min，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未进行复合酶酶解。
具体如下：
S5.活性菌肽的提取：将50重量份步骤S4制得的发酵液在105℃杀菌25min，加入100重量份30wt%三氯醋酸溶液，加热沸腾提取25min，冷却，9500r/min离心10min，弃除沉淀，加入消化酶，添加量为2g/L，37℃酶解1.5h，4000r/min离心4min，弃除沉淀，溶液9500r/min离心25min，收集沉淀，清水洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为4:2。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未进行消化酶酶解。
具体如下：
S5.活性菌肽的提取：将50重量份步骤S4制得的发酵液在105℃杀菌25min，加入复合酶，添加量为2g/L，45℃酶解1.5h，105℃灭酶15min，加入100重量份30wt%三氯醋酸溶液，加热沸腾提取25min，冷却，4000r/min离心4min，弃除沉淀，溶液9500r/min离心25min，收集沉淀，清水洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为6:2。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未进行三氯醋酸溶液加热沸腾提取。
具体如下：
S5.活性菌肽的提取：将50重量份步骤S4制得的发酵液在105℃杀菌25min，加入复合酶，添加量为2g/L，45℃酶解1.5h，105℃灭酶15min，9500r/min离心12min，弃除沉淀，加入消化酶，添加量为2g/L，37℃酶解1.5h，4000r/min离心4min，弃除沉淀，溶液9500r/min离心25min，收集沉淀，清水洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为6:2；
所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为4:2。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S5。
包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将10重量份大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入50重量份60wt%乙醇水溶液中，在500MPa保压提取30min，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入50重量份丙酮中，1350W超声12min，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.改性：将3.5重量份步骤S1制得的大豆卵磷脂和10重量份乙二酸酐混合均匀，氮气保护下，升温至60℃，搅拌反应1.5h，3000r/min离心15min，清水洗涤，干燥，制得改性大豆卵磷脂；
S3.发酵培养基的制备：将15重量份步骤S1中的滤渣、10重量份葡萄糖、9重量份麦芽糖、0.5重量份维生素C、0.2重量份维生素B2、0.5重量份氯化钠、0.1重量份硫酸镁、0.1重量份氯化铁、0.1重量份硫酸锌、0.2重量份硫酸铜加入200重量份去离子水中，搅拌混合均匀，紫外线灭菌，制得发酵培养基；
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，得到菌种种子液，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为2%、2.5%、1.5%，37℃，60r/min，发酵培养42h，制得发酵液，冷冻干燥，制得发酵物；
所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，37℃，60r/min，活化培养16h，制得含菌量为109cfu/mL的菌种种子液；
S5.活性组合物的制备：将10重量份步骤S4制得的发酵物、2.5重量份蜂毒肽、2重量份防御素、2重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S6.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将20重量份步骤S2制得的改性大豆卵磷脂、2重量份胆固醇溶于50重量份45wt%乙醇水溶液中，然后将4重量份步骤S6制得的活性组合物溶于30重量份pH=7的PBS缓冲溶液中，加热至37℃，合并溶液，11000r/min均质4min，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
对比例11
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加蜂毒肽。
具体如下：
S6.活性组合物的制备：将10重量份步骤S5制得的活性菌肽、4.5重量份防御素、2重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物。
对比例12
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加防御素。
具体如下：
S6.活性组合物的制备：将10重量份步骤S5制得的活性菌肽、4.5重量份蜂毒肽、2重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物。
对比例13
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加蜂毒肽和防御素。
具体如下：
S6.活性组合物的制备：将10重量份步骤S5制得的活性菌肽、2重量份乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物。
对比例14
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S6中未添加乳铁蛋白。
具体如下：
S6.活性组合物的制备：将10重量份步骤S5制得的活性菌肽、2.5重量份蜂毒肽、2重量份防御素混合均匀，制得活性组合物。
测试例1 稳定性测试
测试对象：实施例1-3和对比例1制得的肿瘤患者康复用复合肽。
1、把1g肿瘤患者康复用复合肽分散于10mL pH=7.4的PBS缓冲溶液中，在-10℃放置24h后，用离心机在2500r/min转速下离心15min，测定沉淀质量。
2、把1g肿瘤患者康复用复合肽分散于10mL pH=7.4的PBS缓冲溶液中，在40℃下放置24h后，取2mL定容为50mL检测吸光度，浊度换算参照文献（任朝华.无机高分子絮凝剂的制备与应用研究[Ｄ].陕西科技大学硕士学位论文，2004）进行。
3、把1g肿瘤患者康复用复合肽分散于10mL pH=7.4的PBS缓冲溶液中，常温下放置10d后观察是否有沉淀产生。
结果见表1。
表1 稳定性结果对比表
Figure SMS_3
由上表可知，本发明实施例1-3制得的肿瘤患者康复用复合肽形成的脂质体稳定性佳，对比例1中未对大豆卵磷脂进行改性处理，稳定性明显下降，这可能是由于酰基的增加，双层膜排列整齐稳定，不易受温度的影响。
测试例2 小鼠体内毒性考察
取6-8周昆明种小鼠，随机分为21组，分别为实施例1-7和对比例1-14组，每组6只，分别灌胃2g/只相应组制得的肿瘤患者康复用复合肽，观察并记录小鼠的各种行为学指征变化，结果见表2。
表2 体内毒性结果对比表
Figure SMS_4
由上表可知，本发明实施例1-3制得的肿瘤患者康复用复合肽在灌胃后对小鼠的正常饮食、排泄与运动等因素均未见明显的影响，所记录各项行为学指征均正常，一天及一周后均未发现小鼠死亡现象，说明本发明中的多肽进入小鼠体内对其没有明显的急性或慢性毒性作用。
测试例3
取C57BL/6小鼠，体质量19-22g，雌雄各半取生长旺盛的肿瘤，无菌条件下以常规方法制成约1×107个/mL的癌细胞匀浆悬液，以每只0.05mL的量接种于受体小鼠的右足趾皮下。24h后分为24组，分别为实施例1-7组，对比例1-14组，抗肿瘤阳性对照组、免疫阳性对照组、模型组，每组6只。另取6只未进行肿瘤接种的小鼠为空白组。灌胃给药，每天1次，连续10d，小鼠给药量为2g/kg，给与实施例1-7或对比例1-14制得的肿瘤患者康复用复合肽,模型组和空白组给以等量的生理盐水。抗肿瘤阳性对照组小鼠腹腔给药CTX30mg/kg，每天1次，连续7d。免疫阳性对照组小鼠灌胃给与云芝糖肽2g/kg，灌胃给药，每天1次，连续10d。末次给药后处死各组小鼠截取足趾称肿瘤质量，计算肿瘤抑制率（%）。
肿瘤抑制率（%）=（m模型-m给药）/（m模型-m空白）×100%
式中：m模型为模型组足趾平均瘤质量/g；m给药为给药组足趾平均瘤质量/g；m空白为空白组足趾平均瘤质量/g。
次日解剖各组小鼠，无菌摘取脾脏，制备成单个脾细胞悬液，低渗除去红细胞，将细胞悬液转入培养瓶中37℃培养1h后去除贴壁细胞，计数活细胞调整至3×106个/mL，作为效应细胞。靶细胞取体外培养细胞L929常规培养24h，以培养液调整细胞浓度为1.5×105个/mL，使效应细胞与靶细胞浓度比为20:1。取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另设效应组和靶细胞对照组，于37℃、5% CO2条件下培养4h后，加入MTT染色液，再培养2h后加入消化液2h后测各孔570nm波长处OD值，计算NK细胞活性。
NK细胞活性（%）=[1-（OD2-OD3）/OD1]×100%
式中：OD1为靶细胞对照组OD值；OD2为给药组OD值；OD3为效应组OD值。
结果见表3。
表3 抑制肿瘤、提高免疫力结果对比表
Figure SMS_5
由上表可知，本发明实施例1-3制得的肿瘤患者康复用复合肽具有明显的抑制肿瘤生长，提高免疫细胞活性的效果。
实施例4、5与实施例3相比，复合酶为单一的纤维素酶或果胶酶。对比例7与实施例3相比，步骤S5中未进行复合酶酶解。实施例6、7与实施例3相比，消化酶为单一的胰蛋白酶或ɑ-糜蛋白酶。对比例8与实施例3相比，步骤S5中未进行消化酶酶解。对比例9与实施例3相比，步骤S5中未进行三氯醋酸溶液加热沸腾提取。对比例10与实施例3相比，未进行步骤S5。其肿瘤抑制率和NK细胞活性下降。本发明首先通过复合酶酶解发酵菌的细胞壁，促进胞内、胞外蛋白、糖的溶出，进一步采用三氯乙酸去除磷酸壁，采用消化酶将蛋白质酶解成小分子短肽、多肽等活性物质，使得本发明活性菌肽的制备方法简单，条件温和，制备周期缩短。
对比例1与实施例3相比，未进行步骤S2。其肿瘤抑制率和NK细胞活性下降。由于蜂毒肽分子结构中没有羧基，且含有3个赖氨酸和2个精氨酸残基，使其成为一种强碱性肽，具有较强的溶血副作用，因此，限制了其直接应用。另外，乳铁蛋白化学不稳定，在温湿的环境中容易降解失活，因此，需要将这些活性组合物采用包埋的方法包埋以提高其稳定性，还可以起到缓控释的效果，增强药效，延长药品的使用时间。脂质体作为药物载体可以提高药物的治疗指数，延长疗效，并可达到缓控释和靶向给药目的。但是，普通的脂质体稳定性较差，易破裂或者聚集成团，且磷脂材料易氧化，为了改善脂质体的稳定性，本发明对大豆卵磷脂进行二酸酐改性处理，大大提高了脂质体的稳定性，另外，本发明制备了一种乙醇脂质体，与普通脂质体相比，透皮速率及皮肤滞留药量显著提高，从而大大增强了药效。而且，大豆卵磷脂也可以起到很好的帮助肿瘤患者康复，软化血管、降低血压和胆固醇的功能，提高机体免疫力。
对比例2与实施例3相比，步骤S3中滤渣由蛋白胨替代。其肿瘤抑制率和NK细胞活性下降，可见，大豆豆渣中含丰富的活性物质，经过发酵后被发酵菌吸收，从而制得活性菌肽具有更好的生物活性，起到增强免疫，抗肿瘤的作用。
对比例3、4、5与实施例3相比，步骤S4中未接种嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌或保加利亚乳杆菌。对比例6与实施例3相比，未进行步骤S3、S4、S5。其肿瘤抑制率和NK细胞活性下降。在活性菌肽的制备过程中，首先为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌提供氮含量丰富的发酵培养基（通过添加足量的大豆滤渣），从而促进发酵菌的发酵产生丰富的蛋白质类物质。
对比例11、12与实施例3相比，步骤S6中未添加蜂毒肽或防御素。对比例13与实施例3相比，步骤S6中未添加蜂毒肽和防御素。其肿瘤抑制率下降。蜂毒肽、防御素是具有很好肿瘤细胞杀伤功能的抗菌肽，能够抗炎、镇痛、免疫增强、药物增敏等作用，由于癌细胞膜外带负电荷的磷脂酰丝氨酸和氧糖基化粘液素的过度表达意味着与正常的真核细胞相比，它们携带更多的净负电荷。蜂毒肽、防御素带有丰富的正电中心，且序列较短，在非极性溶剂中会形成两性分子结构。当诱导坏死的肽与细胞膜结合后，肽会通过膜溶解或膜穿孔机制使细胞膜被破坏，导致癌细胞坏死或凋亡，对肿瘤细胞具有更高的选择性，能够通过膜溶解方式杀死对化疗产生抗性的癌细胞，帮助肿瘤患者进一步清除体内癌细胞，从而对于肿瘤患者的康复有明显的促进作用。
对比例14与实施例3相比，步骤S6中未添加乳铁蛋白。NK细胞活性明显下降，可见，乳铁蛋白对于免疫增强有明显的的促进作用。
实施例8
一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，由以下原料按重量百分比制备而成：丙酸钙0.0001%、透皮吸收促进组合物1%、甜菊醇糖苷0.1%、实施例1制得的肿瘤患者康复用复合肽10%、生理盐水余量。
所述透皮吸收促进组合物包括薄荷脑和制备例1制得的透皮吸收促进剂，质量比为2:5。
制备方法包括以下步骤：将透皮吸收促进组合物加入水中，加入肿瘤患者康复用复合肽和丙酸钙，搅拌混合20min，加入甜菊醇糖苷，搅拌混合15min，过滤，灌封，制得肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂。
实施例9
一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，由以下原料按重量百分比制备而成：脱氢乙酸钠0.001%、透皮吸收促进组合物2%、硬脂酰柠檬酸酯0.7%、实施例2制得的肿瘤患者康复用复合肽15%、生理盐水余量。
所述透皮吸收促进组合物包括薄荷脑和制备例2制得的透皮吸收促进剂，质量比为2:7。
制备方法包括以下步骤：将透皮吸收促进组合物加入水中，加入肿瘤患者康复用复合肽和脱氢乙酸钠，搅拌混合30min，加入硬脂酰柠檬酸酯，搅拌混合30min，过滤，灌封，制得肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂。
实施例10
一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，由以下原料按重量百分比制备而成：双乙酸钠0.0005%、透皮吸收促进组合物1.5%、酒石酸二甘油酯0.4%、实施例3制得的肿瘤患者康复用复合肽12%、生理盐水余量。
所述透皮吸收促进组合物包括薄荷脑和制备例3制得的透皮吸收促进剂，质量比为2:6。
制备方法包括以下步骤：将透皮吸收促进组合物加入水中，加入肿瘤患者康复用复合肽和双乙酸钠，搅拌混合25min，加入酒石酸二甘油酯，搅拌混合22min，过滤，灌封，制得肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂。
对比例15
与实施例10相比，不同之处在于，透皮吸收促进组合物为单一的薄荷脑。
对比例16
与实施例10相比，不同之处在于，透皮吸收促进组合物为单一的制备例3制得的透皮吸收促进剂。
对比例17
与实施例10相比，不同之处在于，未添加透皮吸收促进组合物。
测试例4 体外透皮试验
离体皮肤的制备：将大鼠断颈处死，剪下腹部皮肤，去除皮下脂肪，用生理盐水反复冲洗，于4℃的生理盐水中保存。使用前用pH7.4的PBS缓冲溶液浸泡30min，再漂洗至洗液澄清透明，滤纸吸干。
透皮试验：采用改进的Franz药物透皮扩散试验仪进行试验（参考文献：黄莉，李娟，王业，等(替诺昔康凝胶剂的制备及其经皮吸收研究［J］,中国药学杂志，2005，40(23):1807-1810.），接收池容积6.5mL，透皮扩散面积2.8cm2，以pH7.4的PBS缓冲溶液作为扩散介质。将皮肤固定，分别均匀实施例10和对比例15-17制得的肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，于200r/min、37±0.5℃条件下进行试验，分别间隔一定时间取样0.5mL（同时补加等量同温扩散介质）。检测透过液中酒石酸二甘油酯的吸光值，由标准曲线计算浓度，根据下面公式计算单位面积累积渗透量（Q）。
Q=（
Figure SMS_6
×V）／S
式中，Cn为第n个取样点测得的药物浓度；V为接收池的体积；S为有效扩散面积。
单位面积累计渗透率K=Q/m×100%
其中，m为1g肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂中酒石酸二甘油酯的量。
结果见图2。由图可知，本发明实施例3制得的一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂在透皮吸收促进组合物的作用下，具有极好的透皮吸收效率，渗透率高，渗透快。对比例15、16与实施例10相比，透皮吸收促进组合物为单一的薄荷醇或制备例3制得的透皮吸收促进剂，对比例17与实施例10相比，未添加透皮吸收促进组合物，其透皮吸收效率下降，单位面积累计渗透率明显下降，可见，透皮吸收促进组合物包括透皮吸收促进剂和薄荷醇，薄荷醇对亲水性和亲脂性化合物的透皮吸收均有显著促进作用。本发明透皮吸收促进剂是一种高效皮肤渗透促进剂，结构中的双氧五环易于插入到磷脂双分子层结构中去，从而扰乱磷脂双分子层，促进药物的透皮吸收。另外一部分为类似噻酮结构，促渗效果明显优于氮酮。两者之间具有明显的协同增效的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肿瘤患者康复用复合肽的制备方法，其特征在于，从大豆中提取得到大豆卵磷脂，滤渣留用，经过二酸酐改性得到改性大豆卵磷脂，滤渣和碳源、维生素、无机盐加入水中，配制成发酵培养基，接种活化的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌，发酵培养后，杀菌，复合酶酶解，加入三氯醋酸溶液，加热沸腾提取，离心，消化酶酶解，制得活性菌肽，与蜂毒肽、防御素、乳铁蛋白混合制得活性组合物，包埋于改性大豆卵磷脂制得的脂质体中，得到肿瘤患者康复用复合肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.大豆卵磷脂的提取：将大豆洗净，干燥，打粉，得到大豆粉，加入乙醇水溶液中，在高压条件下保压提取，过滤，滤渣留用；滤液除去溶剂，加入丙酮中，超声，过滤，固体乙醇洗涤，制得大豆卵磷脂；
S2.改性：将步骤S1制得的大豆卵磷脂和二酸酐混合均匀，惰性气体保护下，升温反应，离心，洗涤，干燥，制得改性大豆卵磷脂；
S3.发酵培养基的制备：将步骤S1中的滤渣、碳源、维生素、无机盐加入去离子水中，搅拌混合均匀，灭菌，制得发酵培养基；
S4.发酵：将嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌活化后，接种至步骤S3制得的发酵培养基中，发酵培养，制得发酵液；
S5.活性菌肽的提取：将步骤S4制得的发酵液进行杀菌，加入复合酶，第一次酶解，灭酶，加入三氯醋酸溶液，加热沸腾提取，冷却，第一次离心，弃除沉淀，加入消化酶，第二次酶解，第二次离心，弃除沉淀，溶液第三次离心，收集沉淀，洗涤，冷冻干燥，制得活性菌肽；
S6.活性组合物的制备：将步骤S5制得的活性菌肽、蜂毒肽、防御素、乳铁蛋白混合均匀，制得活性组合物；
S7.肿瘤患者康复用复合肽的制备：将步骤S2制得的改性大豆卵磷脂、胆固醇溶于乙醇水溶液中，然后将步骤S6制得的活性组合物溶于缓冲溶液中，加热至35-40℃，合并溶液，均质，冷冻干燥，制得肿瘤患者康复用复合肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述乙醇水溶液的浓度为55-65wt%，所述高压条件的压力为400-600MPa，保压提取的时间为20-40min，所述超声的功率为1200-1500W，时间为10-15min；步骤S2中所述二酸酐选自丁二酸酐、丙二酸酐、乙二酸酐、戊二酸酐中的至少一种，所述大豆卵磷脂和二酸酐的质量比为（2-5）:10，所述升温反应的温度为50-70℃，时间为1-2h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述滤渣、碳源、维生素、无机盐、去离子水的质量比为(10-20):(15-22):(0.5-1):(0.7-1.5):200；步骤S4中所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌的活化为将菌种接种至高氏培养基中，36-38℃，50-70r/min，活化培养12-18h，制得含菌量为108-109cfu/mL的菌种种子液，所述嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌菌种种子液的接种量为1-3%、2-3%、1-2.5%，所述发酵培养的条件为36-38℃，50-70r/min，发酵培养36-48h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述杀菌的方法为100-110℃杀菌20-30min，所述复合酶为纤维素酶和果胶酶的混合物，质量比为(5-7):2，所述第一次酶解的温度为40-50℃，时间为1-2h，所述消化酶为胰蛋白酶和ɑ-糜蛋白酶的混合物，质量比为(3-5):2，所述第二次酶解的温度为35-40℃，时间为1-2h，所述三氯醋酸溶液的浓度为20-40wt%，所述加热沸腾提取的时间为20-30min，所述第一次离心的条件为9000-10000r/min，时间为10-15min，所述第二次离心的条件为3000-5000r/min，时间为3-5min，所述第三次离心的条件为9000-10000r/min，时间为20-30min；步骤S6中所述活性菌肽、蜂毒肽、防御素、乳铁蛋白的质量比为10:(2-3):(1-3):(1-3)；步骤S7中所述乙醇水溶液的浓度为40-50wt%，所述改性大豆卵磷脂、胆固醇、活性组合物的质量比为20:(1-3):(3-5)，所述均质的条件为10000-12000r/min，时间为3-5min，所述缓冲溶液为pH为6.8-7.2的PBS缓冲溶液。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的肿瘤患者康复用复合肽。
7.一种肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，其特征在于，由以下原料按重量百分比制备而成：防腐剂0.0001-0.001%、透皮吸收促进组合物1-2%、表面活性剂0.1-0.7%、权利要求6所述肿瘤患者康复用复合肽10-15%、生理盐水余量。
8.根据权利要求7所述肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，其特征在于，所述透皮吸收促进组合物包括薄荷脑和透皮吸收促进剂，质量比为2:(5-7)；所述透皮吸收促进剂的结构式如式I所示：
Figure QLYQS_1
式I。
9.根据权利要求8所述肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂，其特征在于，所述透皮吸收促进剂的合成方法如下：
T1.将二水合糖精钠、碱和3-溴-1丙醇混合反应，制得中间体，结构如下：
Figure QLYQS_2
；
T2.将中间体、碱和2-（2-溴乙基）-1,3-二氧戊环混合反应，制得透皮吸收促进剂。
10.一种如权利要求7-9任一项所述肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将透皮吸收促进组合物加入水中，加入肿瘤患者康复用复合肽和防腐剂，搅拌混合20-30min，加入表面活性剂，搅拌混合15-30min，过滤，灌封，制得肿瘤患者康复用复合肽喷雾剂。
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