CN112999261B - 一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。该舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物，由以下原料按重量制备而成：纳豆发酵提取物70‑120份、人参皂苷Re 1‑2份、三七皂苷S 7‑12份、青钱柳黄酮10‑20份本发明制备方法简单、原料来源广，制得的组合物具有很好的降血脂、溶血栓作用，特别对动脉粥样硬化具有很好的抑制和治疗作用，且安全无副作用，可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用，具有广阔的应用前景。

Description

一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物及其制备方法和应用。
背景技术
动脉硬化是动脉的一种炎症性病变，可使动脉管壁增厚、变硬，失去弹性、管腔狭小。动脉硬化是随着人年龄增长而出现的血管疾病，其通常是在青少年时期发生，到中老年时期加重、发病。随着人们生活水平的提高，心血管动脉硬化的发病率逐渐增多，现已成为老年人死亡的主要原因之一。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是动脉硬化中最常见而重要的类型，其特点是受累动脉的内膜有类脂质的沉着，复合糖类的积聚，继而纤维组织增生和钙沉着，并有动脉中层的病变。本病主要累及大型及中型的肌弹力型动脉，以主动脉、冠状动脉及脑动脉为多见，常导致管腔闭塞或管壁破裂出血等严重后果，为心肌梗塞和脑梗塞的主要病因。它影响大、中动脉，可引起相当严重的后果。冠状动脉粥样硬化时，可造成心肌供血不足，引起心绞痛乃至心肌梗死；脑动脉硬化可引起脑供血不足、眩晕、头痛。后期脑萎缩时，可有精神变态、痴呆等，脑动脉内血栓形成或因动脉粥样硬化引起的小动脉瘤破裂出血引起的脑卒中(中风)，可造成意识丧失、偏瘫、失语等严重后果；肾动脉硬化可引起顽固性高血压；肠动脉硬化可引起消化不良、便秘、腹泻；下肢动脉粥样硬化可引起间歇跛行，严重时发生肢端缺血坏死。
近年来，随着人们生活水平的提高，加上人口结构老龄化，该病的发病率和病死率呈快速上升趋势，发病年龄呈年轻化趋势。据报道，我国每年患此病约死亡110万人。因此开发治疗该病的药物渐成研究的热点。近几来，很多中医研究者开始专注研究采用中药组合物达到治疗动脉硬化的目的。虽然临床上已经有诸多药方用于缓解或治疗动脉硬化疾病，但是目前为止并无广泛推广应用。
纳豆由黄豆通过纳豆芽孢杆菌发酵制成豆制品，具有黏性，气味较臭，味道微甜，不仅保有黄豆的营养价值、富含维生素K2、提高蛋白质的消化吸收率，更重要的是发酵过程产生了多种生理活性物质，具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用。
纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100%,同时具有强力的病原菌抑制能力,是各种益菌当中,对环境耐受力最好可以直达小肠的菌种之一,口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环保。可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应，并能生成多种蛋白酶(特别是碱性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶等。纳豆芽孢杆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候,产生出的酵素纳豆激酶(Nattokinase，NK),具有神奇的药效,有治疗高血脂、溶解血栓等作用，而且还能产生出氨基酸的美味。
发明内容
本发明的目的在于提出一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物及其制备方法和应用，制备方法简单、原料来源广，制得的组合物具有很好的降血脂、溶血栓作用，特别对动脉粥样硬化具有很好的抑制和治疗作用，且安全无副作用，可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种纳豆发酵提取物的制备方法，将红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌分别活化后，加入含有三七粉的半固态培养基中培养，混合得到复合发酵菌液，将脱毒熟化后的大豆粉碎，加入复合发酵菌液中，发酵培养，过滤干燥，得到纳豆发酵提取物。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，分别培养成菌种种子液；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将碳源、氮源、维生素和无机盐用无菌水溶解，混合均匀后，加入三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为6.8-7.5，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液分别接种于步骤S3制得的半固态培养基中，第二次有氧培养，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中三个培养基等体积混合，过滤除掉三七粉固体，并稀释得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡20-24h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理2-4h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵24-48h，过滤，固体用无菌水洗涤，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
作为本发明的进一步改进，所述红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的质量比为（1-5）：（7-12）：（2-4）；所述第一次有氧培养条件为36-38℃，氧含量为22-30%，湿度为70-80%，培养时间为12-24h；所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL。
作为本发明的进一步改进，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的一种或几种混合；所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E中的一种或几种混合；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种或几种混合；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯氨酸中的一种或几种混合；所述碳源、氮源、维生素、无机盐、三七粉和无菌水的质量比为（4-12）：（5-10）：（0.15-0.3）：（0.4-1.2）：（7-12）：100。
作为本发明的进一步改进，所述红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的接种量分别为2-5%、3-6%、1-3%；所述第二次有氧培养条件为36-38℃，氧含量为22-30%，湿度为75-85%，培养时间为24-36h；所述稀释倍数为100-300倍。
作为本发明的进一步改进，所述乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液中乙酸含量为10-20wt%，乙醇含量为25-40wt%，三乙胺含量为5-10wt%，余量为水；所述大豆粉和复合发酵菌液的固液比为1：（2-5）。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的纳豆发酵提取物。
本发明进一步保护一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物，由以下原料按重量制备而成：上述纳豆发酵提取物70-120份、人参皂苷Re 1-2份、三七皂苷S 7-12份、青钱柳黄酮10-20份。
本发明进一步保护一种上述的舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：将纳豆发酵提取物、人参皂苷Re、三七皂苷S和青钱柳黄酮，混合均匀后，得到舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物。
本发明进一步保护一种上述的舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物在制备治疗动脉硬化的食品、保健食品及药品中的应用。
本发明具有如下有益效果：本发明将红曲霉、纳豆芽孢杆菌以及羊肚菌进行混合培养后，得到的复合发酵菌液用于对脱毒熟化处理后的大豆进行发酵培养，其中，红曲霉在发酵过程中将产生聚酮类次级代谢产物红曲色素，包括红曲玉红胺、红斑红曲胺、红曲玉红素、红斑红曲素、红曲素、安卡红曲黄素等，能提升血清高密度脂蛋白水平，降低低密度脂蛋白水平和减少肝脏堆积胆固醇，另外，活性物质Monacolin K能显著抑制胆固醇的活性，对HMG-CoA还原酶均有强烈的抑制作用，而γ-氨基丁酸具有降血糖、降血脂的效果；同时，由于三种菌种的混合培养，还能有效抑制红曲霉对桔霉素的产生，从而降低生物毒性；纳豆芽孢杆菌在发酵过程中高产量产生具有强烈溶血栓活性物质纳豆激酶，以及调节血糖、血脂活性物质大豆异黄酮，如染料木素、染料木苷和infrabin等，而羊肚菌经过发酵后产生丰富的多糖类物质，在舒缓动脉粥样硬化、降血脂等方面有明显的效果。
本发明添加了三七皂苷S、人参皂苷Re和青钱柳黄酮，具有协同增效的作用，其中，三七皂苷S、青钱柳黄酮具有很好的降血脂的功效，三七皂苷S能够调节脂类物质的代谢，改善患者血液高黏和高凝状态，清除血管内的氧自由基，降低有害物质对血管内皮的损害，青钱柳黄酮具有较强的清除自由基能力，能明显抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂，还具有软化动脉血管的作用，与人参皂苷Re以及制备的纳豆发酵提取物混合后，人参皂苷Re能够减少脂质在肝脏的沉积，减少主动脉和泡沫细胞内的胆固醇含量，从而得到一种具有舒缓动脉硬化作用的纳豆发酵组合物，该组合物具有很好的降血脂、溶血栓等效果，并针对动脉粥样硬化具有明显的治疗作用。
本发明制备方法简单、原料来源广，制得的组合物具有很好的降血脂、溶血栓作用，特别对动脉粥样硬化具有很好的抑制和治疗作用，且安全无副作用，可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
红曲霉为ACCC 30342 红曲霉，购于上海复祥生物科技有限公司；纳豆芽孢杆菌为CICC 21076纳豆芽孢杆菌，购于中国工业菌种保藏中心；羊肚菌为ACCC 50764羊肚菌，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
人参皂苷Re，CAS号52286-59-6，购于大连富生制药有限公司；三七皂苷S，CAS号575446-95-6，购于成都彼样生物科技有限公司；青钱柳黄酮，CAS号574-12-9，购于赣州华汉生物科技有限公司。
实施例1纳豆发酵提取物的制备方法
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将1g红曲霉、7g纳豆芽孢杆菌和2g羊肚菌分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为36℃，氧含量为22%，湿度为70%，培养时间为12h，分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为108cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将4g葡萄糖、5g尿素、0.1g维生素K、0.05g维生素C和0.2g氯化铁、0.2g硫酸锌用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入7g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为6.8，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液分别接种于步骤S3制得的半固态培养基中，红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的接种量分别为2%、3%、1%，第二次有氧培养，培养条件为36℃，氧含量为22%，湿度为75%，培养时间为24h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中三个培养基等体积混合，过滤除掉三七粉固体，并稀释100倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡20h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为10wt%，乙醇含量为25wt%，三乙胺含量为5wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理2h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将100g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入200g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵24h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
实施例2纳豆发酵提取物的制备方法
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将5g红曲霉、12g纳豆芽孢杆菌和4g羊肚菌分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为38℃，氧含量为30%，湿度为80%，培养时间为24h，分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将12g蔗糖、5g硝酸铵、3g半胱氨酸、2g甲氨酸、0.3g维生素C和0.5g氯化钙、0.3g硫酸镁、0.4g硫酸锌用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入12g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为7.5，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液分别接种于步骤S3制得的半固态培养基中，红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的接种量分别为5%、6%、3%，第二次有氧培养，培养条件为38℃，氧含量为30%，湿度为85%，培养时间为36h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中三个培养基等体积混合，过滤除掉三七粉固体，并稀释300倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡24h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为20wt%，乙醇含量为40wt%，三乙胺含量为10wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理4h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将10g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入50g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵48h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
实施例3纳豆发酵提取物的制备方法
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将3.5g红曲霉、10g纳豆芽孢杆菌和3g羊肚菌分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为27%，湿度为75%，培养时间为16h，分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将9g麦芽糖、5g尿素、2g谷氨酸、0.02g维生素K、0.1g维生素B2、0.1g维生素A和0.2g硫酸锰、0.2g氯化锌、0.2g氯化铜、0.2g氯化锰用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入9g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液分别接种于步骤S3制得的半固态培养基中，红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的接种量分别为3.5%、4.5%、2%，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25%，湿度为80%，培养时间为30h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中三个培养基等体积混合，过滤除掉三七粉固体，并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡22h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为15wt%，乙醇含量为32wt%，三乙胺含量为7wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理3h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将10g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入35g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例1
与实施例3相比，未添加红曲霉，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将10g纳豆芽孢杆菌和6.5g羊肚菌分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为27%，湿度为75%，培养时间为16h，分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将9g麦芽糖、5g尿素、2g谷氨酸、0.02g维生素K、0.1g维生素B2、0.1g维生素A和0.2g硫酸锰、0.2g氯化锌、0.2g氯化铜、0.2g氯化锰用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入9g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液分别接种于步骤S3制得的半固态培养基中，纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的接种量分别为4.5%、5.5%，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25%，湿度为80%，培养时间为30h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中二个培养基等体积混合，过滤除掉三七粉固体，并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡22h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为15wt%，乙醇含量为32wt%，三乙胺含量为7wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理3h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将10g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入35g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例2
与实施例3相比，未添加羊肚菌，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将6.5g红曲霉、10g纳豆芽孢杆菌分别接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为27%，湿度为75%，培养时间为16h，分别培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将9g麦芽糖、5g尿素、2g谷氨酸、0.02g维生素K、0.1g维生素B2、0.1g维生素A和0.2g硫酸锰、0.2g氯化锌、0.2g氯化铜、0.2g氯化锰用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入9g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液分别接种于步骤S3制得的半固态培养基中，红曲霉、纳豆芽孢杆菌的接种量分别为5.5%、4.5%，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25%，湿度为80%，培养时间为30h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中二个培养基等体积混合，过滤除掉三七粉固体，并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡22h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为15wt%，乙醇含量为32wt%，三乙胺含量为7wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理3h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将10g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入35g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例3
与实施例3相比，仅添加了红曲霉，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将16.5g红曲霉接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为27%，湿度为75%，培养时间为16h，培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将9g麦芽糖、5g尿素、2g谷氨酸、0.02g维生素K、0.1g维生素B2、0.1g维生素A和0.2g硫酸锰、0.2g氯化锌、0.2g氯化铜、0.2g氯化锰用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入9g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液接种于步骤S3制得的半固态培养基中，红曲霉的接种量分别为10%，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25%，湿度为80%，培养时间为30h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中培养基过滤除掉三七粉固体，并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡22h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为15wt%，乙醇含量为32wt%，三乙胺含量为7wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理3h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将10g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入35g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例4
与实施例3相比，仅添加了纳豆芽孢杆菌，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将16.5g纳豆芽孢杆菌接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为27%，湿度为75%，培养时间为16h，培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将9g麦芽糖、5g尿素、2g谷氨酸、0.02g维生素K、0.1g维生素B2、0.1g维生素A和0.2g硫酸锰、0.2g氯化锌、0.2g氯化铜、0.2g氯化锰用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入9g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液接种于步骤S3制得的半固态培养基中，纳豆芽孢杆菌的接种量分别为10%，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25%，湿度为80%，培养时间为30h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中培养基过滤除掉三七粉固体，并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡22h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为15wt%，乙醇含量为32wt%，三乙胺含量为7wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理3h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将10g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入35g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
对比例5
与实施例3相比，仅添加了羊肚菌，其他条件均不改变。
具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将16.5g羊肚菌接种到高氏培养基中划线，第一次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为27%，湿度为75%，培养时间为16h，培养成菌种种子液，菌种种子液的含菌量为109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将9g麦芽糖、5g尿素、2g谷氨酸、0.02g维生素K、0.1g维生素B2、0.1g维生素A和0.2g硫酸锰、0.2g氯化锌、0.2g氯化铜、0.2g氯化锰用100mL无菌水溶解，混合均匀后，加入9g三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为7，紫外线灭菌备用；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液接种于步骤S3制得的半固态培养基中，羊肚菌的接种量分别为10%，第二次有氧培养，培养条件为37℃，氧含量为25%，湿度为80%，培养时间为30h，得到活化菌种；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中培养基过滤除掉三七粉固体，并稀释200倍得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡22h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液（乙酸含量为15wt%，乙醇含量为32wt%，三乙胺含量为7wt%，余量为水）置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理3h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将10g经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入35g步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵36h，过滤，固体分别用100mL无菌水洗涤3次，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
实施例4舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物
原料组成（重量份）：实施例1制得的纳豆发酵提取物100份、人参皂苷Re 1.5份、三七皂苷S 10份、青钱柳黄酮15份。
包括以下步骤：将纳豆发酵提取物、人参皂苷Re、三七皂苷S和青钱柳黄酮，混合均匀后，得到舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物。
实施例5
与实施例4相比，纳豆发酵提取物由实施例2制得，其他条件均不改变。
实施例6
与实施例4相比，纳豆发酵提取物由实施例3制得，其他条件均不改变。
对比例6
与实施例6相比，纳豆发酵提取物由对比例1制得，其他条件均不改变。
对比例7
与实施例6相比，纳豆发酵提取物由对比例2制得，其他条件均不改变。
对比例8
与实施例6相比，纳豆发酵提取物由对比例3制得，其他条件均不改变。
对比例9
与实施例6相比，纳豆发酵提取物由对比例4制得，其他条件均不改变。
对比例10
与实施例6相比，纳豆发酵提取物由对比例5制得，其他条件均不改变。
对比例11
与实施例6相比，未添加纳豆发酵提取物，其他条件均不改变。
原料组成（重量份）：人参皂苷Re 1.5份、三七皂苷S 10份、青钱柳黄酮15份。
对比例12
与实施例6相比，未添加纳三七皂苷S，其他条件均不改变。
原料组成（重量份）：实施例3制得的纳豆发酵提取物100份、人参皂苷Re 1.5份、青钱柳黄酮25份。
对比例13
与实施例6相比，未添加青钱柳黄酮，其他条件均不改变。
原料组成（重量份）：实施例3制得的纳豆发酵提取物100份、人参皂苷Re 1.5份、三七皂苷S 25份。
测试例1
将本发明实施例1-3和对比例1-5制得的纳豆发酵提取物进行成分测定，结果见表1。
表1
组别 纳豆激酶活力（IU/ml） 异黄酮含量（mg/kg） 红曲色素含量（mg/kg） Monacolin K含量（mg/kg） 多糖含量（g/kg）
测定方法 《中国药典》2010年版，第二部，380页 GB/T23788-2009 GB5009.150-2016 HPLC法测定 苯酚-硫酸法,标准曲线按GB/T 15672-2009中葡萄糖标准曲线绘制
实施例1 3152 902 3525 6011 74
实施例2 3242 915 3618 6224 84
实施例3 3667 947 3698 6428 97
对比例1 3103 898 523 677 72
对比例2 3125 889 3489 6382 11
对比例3 284 118 3992 6723 9
对比例4 3341 1092 392 658 13
对比例5 377 210 405 792 104
由上表可知，本发明实施例制得的纳豆发酵提取物含有丰富的营养元素。
测试例2动脉硬化实验
1、试验动物：选取购自湖南中医药大学实验动物中心的大鼠130只，SPF级，雄性，体重为 220-240g；室温25±2℃，自由进食与饮水。
2、试验方法与结果：将大鼠适应性饲养一周后，随机分为正常组、模型组、实施例4-6以及对比例6-13组。其中正常对照组10只，喂基础饲料，造模组120只，模型组及各给药组采用一次性腹腔注射维生素D3 60万单位/kg，同时每天灌服高脂饲料饲养及10mL/kg脂肪乳(脂肪乳自配：每500mL脂肪乳中含胆固醇30g，胆酸钠5g，丙硫氧嘧啶2g，猪油75g)的方法制备大鼠动脉硬化模型。实施例4-6以及对比例6-13组分别为每天灌服实施例4-6以及对比例6-13制得的组合物20mg/(kg·d)；正常组和模型组每天灌服等量蒸馏水。每天1次，连续8 天，于末次给药60分钟后，眼静脉丛取血测定血脂、TNFα、IL-1、IL-6、IL-10及NF-kB，并进行腹主动脉血液流变学指标测定。处死大鼠，取腹主动脉、心脏、肝脏等浸泡于10％的福尔马林中，常规石蜡包埋、切片、HE染色观察动脉、心脏、肝脏病变情况，并计算中膜厚度与血管内腔半径比值，免疫组化分析采用SABC法观察动脉中膜NF-κB的阳性表达，并观察 动脉的病变情况。
实验结果见表2、表3。
表2对饮食性大鼠高脂血症血脂谱的作用(单位mmol/L)
组别 TC TG LDL-C HDL-C
实施例4 1.45±0.21<sup>**</sup> 1.10±0.11<sup>**</sup> 0.74±0.21<sup>**</sup> 2.45±0.52<sup>*</sup>
实施例5 1.42±0.18<sup>*</sup> 1.05±0.09<sup>**</sup> 0.71±0.19<sup>**</sup> 2.49±0.49<sup>**</sup>
实施例6 1.38±0.15<sup>**</sup> 1.01±0.10<sup>**</sup> 0.69±0.13<sup>**</sup> 2.53±0.47<sup>**</sup>
对比例6 1.56±0.23 1.23±0.17<sup>*</sup> 0.95±0.32 2.24±0.42
对比例7 1.59±0.29 1.21±0.14<sup>*</sup> 0.99±0.41 2.20±0.39<sup>*</sup>
对比例8 1.78±0.34 1.42±0.21 1.12±0.34 2.31±0.44
对比例9 1.85±0.29<sup>*</sup> 1.40±0.19 1.10±0.27<sup>*</sup> 1.88±0.31
对比例10 1.82±0.31<sup>*</sup> 1.49±0.22 1.08±0.34 1.91±0.28
对比例11 2.51±0.25 1.90±0.37 1.31±0.28 1.63±0.21
对比例12 1.50±0.19<sup>**</sup> 1.14±0.10<sup>*</sup> 0.81±0.11<sup>**</sup> 2.41±0.59<sup>**</sup>
对比例13 1.49±0.17<sup>**</sup> 1.17±0.12<sup>**</sup> 0.80±0.13<sup>*</sup> 2.39±0.62<sup>*</sup>
正常组 1.19±0.19<sup>**</sup> 0.95±0.11<sup>**</sup> 0.65±0.20<sup>**</sup> 1.45±0.34<sup>**</sup>
模型组 2.62±0.24 1.96±0.45 1.35±0.34 1.59±0.27
注：与模型组比，**p＜0.01，*p＜0.05。
表2表明，本发明舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物对动脉硬化模型大鼠的脂代谢异常有显著的调节作用，可明显降低模型大鼠胆固醇和低密度脂蛋白的水平，提高高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的比值，而且能抑制模型大鼠动脉壁中膜的增厚。
表3对实验性大鼠血TNFα、IL-1、IL-6、IL-10及NF-kB的作用(рmol/L)
组别 TNFα IL-1 IL-6 IL-10 NF-kB
实施例4 1.24±0.21<sup>**</sup> 1.39±0.23<sup>**</sup> 1.62±0.39<sup>**</sup> 1.65±0.23<sup>*</sup> 1.27±0.19<sup>**</sup>
实施例5 1.21±0.19<sup>**</sup> 1.38±0.21<sup>**</sup> 1.58±0.32<sup>**</sup> 1.69±0.31<sup>**</sup> 1.26±0.21<sup>**</sup>
实施例6 1.18±0.20<sup>**</sup> 1.38±0.17<sup>**</sup> 1.55±0.27<sup>**</sup> 1.71±0.29<sup>**</sup> 1.24±0.27<sup>**</sup>
对比例6 1.45±0.21 1.52±0.26 1.88±0.42 1.45±0.24 1.51±0.39
对比例7 1.49±0.29 1.57±0.31 1.84±0.37 1.49±0.27<sup>*</sup> 1.47±0.32
对比例8 1.75±0.33 1.87±0.21<sup>**</sup> 2.13±0.45 1.32±0.25 1.78±0.40
对比例9 1.82±0.29<sup>*</sup> 1.89±0.32 2.05±0.39 1.37±0.21<sup>*</sup> 1.82±0.38
对比例10 1.78±0.38 1.90±0.34 2.32±0.47 1.31±0.19 1.85±0.35
对比例11 2.51±0.31 2.29±0.19 2.79±0.28 1.21±0.15 2.48±0.32
对比例12 1.31±0.19<sup>**</sup> 1.44±0.27<sup>*</sup> 1.67±0.29<sup>**</sup> 1.60±0.21<sup>**</sup> 1.33±0.20
对比例13 1.29±0.24<sup>**</sup> 1.49±0.24<sup>*</sup> 1.65±0.23<sup>*</sup> 1.58±0.27<sup>**</sup> 1.35±0.17<sup>*</sup>
正常组 1.12±0.10<sup>**</sup> 1.35±0.22<sup>**</sup> 1.24±0.25<sup>**</sup> 1.79±0.35<sup>**</sup> 1.20±0.12<sup>**</sup>
模型组 2.62±0.33 2.35±0.30 2.87±0.32 1.11±0.23 2.57±0.37
注：与模型组比，**p＜0.01，*p＜0.05。
由表3可知，模型组大鼠TNFα、IL-1、IL-6及NF-kB的浓度明显提高、IL-10浓度明显降低，本发明实施例4-6组可明显降低炎症因子TNFα、IL-1、IL-6及NF-kB的浓度，提高抗炎因子IL-10 的浓度，抑制动脉NF-KB过量表达。
与现有技术相比，本发明将红曲霉、纳豆芽孢杆菌以及羊肚菌进行混合培养后，得到的复合发酵菌液用于对脱毒熟化处理后的大豆进行发酵培养，其中，红曲霉在发酵过程中将产生聚酮类次级代谢产物红曲色素，包括红曲玉红胺、红斑红曲胺、红曲玉红素、红斑红曲素、红曲素、安卡红曲黄素等，能提升血清高密度脂蛋白水平，降低低密度脂蛋白水平和减少肝脏堆积胆固醇，另外，活性物质Monacolin K能显著抑制胆固醇的活性，对HMG-CoA还原酶均有强烈的抑制作用，而γ-氨基丁酸具有降血糖、降血脂的效果；同时，由于三种菌种的混合培养，还能有效抑制红曲霉对桔霉素的产生，从而降低生物毒性；纳豆芽孢杆菌在发酵过程中高产量产生具有强烈溶血栓活性物质纳豆激酶，以及调节血糖、血脂活性物质大豆异黄酮，如染料木素、染料木苷和infrabin等，而羊肚菌经过发酵后产生丰富的多糖类物质，在舒缓动脉粥样硬化、降血脂等方面有明显的效果。
本发明添加了三七皂苷S、人参皂苷Re和青钱柳黄酮，具有协同增效的作用，其中，三七皂苷S、青钱柳黄酮具有很好的降血脂的功效，三七皂苷S能够调节脂类物质的代谢，改善患者血液高黏和高凝状态，清除血管内的氧自由基，降低有害物质对血管内皮的损害，青钱柳黄酮具有较强的清除自由基能力，能明显抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂，还具有软化动脉血管的作用，与人参皂苷Re以及制备的纳豆发酵提取物混合后，人参皂苷Re能够减少脂质在肝脏的沉积，减少主动脉和泡沫细胞内的胆固醇含量，从而得到一种具有舒缓动脉硬化作用的纳豆发酵组合物，该组合物具有很好的降血脂、溶血栓等效果，并针对动脉粥样硬化具有明显的治疗作用。
本发明制备方法简单、原料来源广，制得的组合物具有很好的降血脂、溶血栓作用，特别对动脉粥样硬化具有很好的抑制和治疗作用，且安全无副作用，可以作用食疗产品、保健食品以及药品的原料使用，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种纳豆发酵提取物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1. 菌种种子液的制备：将红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌分别接种到高氏培养基中，第一次有氧培养，分别培养成菌种种子液；所述红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的质量比为（1-5）：（7-12）：（2-4）；所述第一次有氧培养条件为36-38℃，氧含量为22-30%，湿度为70-80%，培养时间为12-24h；所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL；
S2. 三七粉的制备：将三七洗净、干燥后粉碎至100目，得到三七粉，紫外线灭菌备用；
S3. 半固态培养基的制备：将碳源、氮源、维生素和无机盐用无菌水溶解，混合均匀后，加入三七粉，用PBS溶液调节培养基pH值为6.8-7.5，紫外线灭菌备用；所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉中的一种或几种混合；所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E中的一种或几种混合；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种或几种混合；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯氨酸中的一种或几种混合；所述碳源、氮源、维生素、无机盐、三七粉和无菌水的质量比为（4-12）：（5-10）：（0.15-0.3）：（0.4-1.2）：（7-12）：100；
S4. 菌种的活化：将步骤S1得到的菌种种子液分别接种于步骤S3制得的半固态培养基中，第二次有氧培养，得到活化菌种；所述红曲霉、纳豆芽孢杆菌和羊肚菌的接种量分别为2-5%、3-6%、1-3%；所述第二次有氧培养条件为36-38℃，氧含量为22-30%，湿度为75-85%，培养时间为24-36h；所述稀释倍数为100-300倍；
S5. 复合发酵菌液的制备：将步骤S4中三个培养基等体积混合，过滤除掉三七粉固体，并稀释得到复合发酵菌液；
S6. 大豆的脱毒熟化：将经过抛光处理后的大豆洗净，无菌水浸泡20-24h后，置于上层筛网上，将乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液置于容器中，加盖并安装冷凝管，加热至沸腾，蒸汽处理2-4h后，冷却至常温后，粉碎，得到脱毒熟化的大豆粉；所述乙酸、乙醇和三乙胺的混合溶液中乙酸含量为10-20wt%，乙醇含量为25-40wt%，三乙胺含量为5-10wt%，余量为水；步骤S7中所述大豆粉和复合发酵菌液的固液比为1：（2-5）；
S7. 纳豆发酵提取物的制备：将经过步骤S6脱毒熟化处理后的大豆粉加入步骤S5得到的复合发酵菌液中，37℃恒温发酵24-48h，过滤，固体用无菌水洗涤，合并洗涤液和滤液，冷冻干燥，得到纳豆发酵提取物。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制得的纳豆发酵提取物。
3.一种舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物，其特征在于，由以下原料按重量份制备而成：权利要求2所述纳豆发酵提取物70-120份、人参皂苷Re 1-2份、三七皂苷S 7-12份、青钱柳黄酮10-20份。
4.一种如根据权利要求3所述的舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将纳豆发酵提取物、人参皂苷Re、三七皂苷S和青钱柳黄酮，混合均匀后，得到舒缓动脉硬化的纳豆发酵组合物。
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