CN117016713A - 一种猪毛菜红曲霉发酵饮料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猪毛菜红曲霉发酵饮料及其制备方法和应用，属食品领域，制备方法包括，将猪毛菜粉碎，与乙醇混合，超声热提取，过滤，将滤液减压浓缩、冷冻干燥得猪毛菜提取物1；将滤渣与水混合，灭菌得猪毛菜发酵培养基，接种红曲霉发酵，发酵液离心，得沉淀与猪毛菜红曲霉发酵原液，将沉淀与乙醇混合，超声热提取，过滤弃滤渣，将滤液减压浓缩、冷冻干燥，得猪毛菜提取物2；猪毛菜红曲霉发酵原液、猪毛菜提取物1、猪毛菜提取物2、蔗糖和水混合均匀，灭菌后冷却，加入防腐剂得成品。本方法减少了猪毛菜中活性成分的损失，所得饮料兼具红曲霉和猪毛菜的活性成分，具有优良的降血压、降血脂效果，在食品领域具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及到一种具有降血脂和降血压功效的猪毛菜红曲霉发酵饮料及其制备方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，生活方式、饮食结构的改变，心脑血管疾病已经取代传染病成为危害人类健康的头号杀手。高血压、高血脂是冠心病、脑血栓、心肌梗塞、肾功能衰竭、中风、半身不遂等心脑血管疾病的罪魁祸首，高血压、高血脂疾病往往伴随发生，具有高发病率、低控制率的特点，需长期不间断用药。目前临床上应用的降血脂药物主要有他汀类、贝特类药物等，降血压药物主要有沙坦类、普利类、地平类药物，短期使用无效或易反弹，长期使用会产生明显的肝脏毒性，同时治疗或预防高血压、高血脂疾病的药物很少见到，相关的功能食品也少有报道。猪毛菜(Salsola collina Pall)又名扎蓬棵、刺蓬、猪毛缨，为一年生藜科猪毛菜属植物猪毛菜的全草，猪毛菜是药食同源植物，猪毛菜含有多种生理活性成分，包括黄酮、生物碱、甾醇和多糖等，富含蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素、微量元素等多种营养物质，其100g嫩茎叶含蛋白质2.8mg，脂肪0.3mg，碳水化合物4g，尤其是硒的含量很高，为一般食品的20倍，是一道享誉民间的营养价值丰富的野菜。猪毛菜在民间常用于预防治疗高血压、高血脂、头晕、失眠、目眩、头痛、耳鸣等疾病，猪毛菜良好的降脂、降压效果以及其资源丰富、产量高、分布广的特点无疑成为预防、治疗高血压、高血脂等心脑血管疾病的理想药材。红曲霉(Monascus)是药食两用真菌，被药典收录，其接种于蒸熟的米饭上发酵制成的固体曲即红曲，是我国的传统食品，在我国的应用已有一千多年的历史，红曲霉及其产物含有莫纳克林K、r氨基丁酸、麦角甾醇、红曲红色素等多种功效成分，具有降血脂、降血压、降血糖、预防冠心病、治疗脂肪肝、抗肿瘤和抗疲劳等功能，对芽孢杆菌属、链球菌属、假单孢菌属等细菌具有抑菌活性，在食品防腐、食品染色、高血脂、高血压疾病防治方面有广泛的应用。“双向发酵”是在我国传统的中药炮制方法上，结合现代生物转化技术发展起来的一项技术，指采用具有一定活性成分的中药材或植物原料作为药性基质来代替传统的营养基质，并加入经过优选的菌种，药性基质和微生物互相影响，在微生物代谢转化中草药等药性基质成分的同时，中草药也可以对微生物的胞内、胞外代谢产物产生影响，甚至生成新的活性成分，这种效果是单纯利用微生物发酵或中药无法达到的。由于双向发酵具有提高中药或微生物活性成分含量、提高中药的药效、提高活性成分溶出度等作用，目前已得到越来越广泛的应用。
红曲霉和猪毛菜为药食两用药物，均有明显的降脂、降压效果，且两者的主要活性成分降脂、降压的作用靶点不同，有可能产生药效加合。红曲霉能产生葡萄糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶淀粉酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶等丰富的酶系，能有效破除猪毛菜植物细胞壁和果胶类物质形成的物理屏障，使有效活性成分溶出，从而提高提取效率，具有对猪毛菜活性成分进行转化、修饰以及产生新的活性物质的巨大潜力，并且红曲霉具有一定的发酵能力，能够在10％的乙醇溶液中生长，这些都为红曲霉在猪毛菜提取、糖化、发酵等步骤中发挥作用提供了良好的条件，是猪毛菜双向发酵体系用菌种的良好选择。红曲霉不仅具有良好的保健、药用价值，而且还具有鲜艳的红色，可做着色剂，在猪毛菜发酵过程中，红曲霉的颜色会渗入到发酵液中，使最终的红曲霉猪毛菜发酵液具有吸引人的红色，且颜色持久，不会褪去。红曲霉发酵过程中产生的红曲还具有防腐效果，在豆腐乳的防腐中已经使用了数百年，这一特点作为发酵和食品原料在生产和应用中有两大优势：一方面可以减少发酵过程中杂菌的污染，另一方面可以减少饮料配方体系中防腐剂的使用。目前，尚未有人开展猪毛菜红曲霉发酵的研究，更未将红曲霉对猪毛菜的转化与发酵工艺优化相结合进行研究的报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种猪毛菜红曲霉发酵饮料及其制备方法和应用，该饮料不仅具有普通饮料的营养功能，而且具有明显的降血脂和降血压效果，安全可靠，无毒副作用。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
第一方面，本发明提供一种具有降血脂和降血压功效的猪毛菜红曲霉发酵饮料及其制备方法，包括如下步骤：
(1)将猪毛菜粉碎，制得猪毛菜粉末；
(2)将猪毛菜粉末与70％乙醇按照1:20的比例混合均匀，超声波第一次热提取，抽滤得滤液和滤渣；
(3)将所得滤液，减压浓缩，冷冻干燥后，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物1；
(4)将所得滤渣与水(g:ml)按照1:1的比例混合，放入灭菌锅中121℃灭菌20min后取出，制得猪毛菜发酵培养基；
(5)向猪毛菜发酵培养基中加入8％-15％的红曲霉种子液，搅拌均匀，摊开，厚度1-2cm左右，在温度为28-32℃条件下，固体发酵72-144h，等到红曲长出白色略显粉红色的菌丝，停止固体发酵，得猪毛菜红曲霉固体发酵物；
(6)按照红曲霉猪毛菜固体发酵物湿重和无菌水比例1:20的比例(g:ml)混合，并搅拌均匀，密封,26-30℃厌氧发酵48-120h，制得猪毛菜红曲霉初始发酵液；
(7)将猪毛菜红曲霉初始发酵液过滤后，在5000-10000r/min下离心5-15min，得到沉淀物和猪毛菜红曲霉发酵原液。
(8)将所得滤渣和沉淀与30％乙醇(g:ml)按照1:20的比例混合均匀，超声波第二次热提取，抽滤得滤液和滤渣，弃滤渣；
(9)将所得滤液，减压浓缩后，冷冻干燥，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物2；
(10)按照猪毛菜发酵原液20-40ml，蒸馏水50-70ml，猪毛菜提取物1 0.8-1.2g，猪毛菜提取物2 0.3-0.8g，蔗糖5-10g的比例混合均匀，高温瞬时灭菌后；冷却至室温，加入防腐剂得到猪毛菜红曲霉发酵饮料；
上述步骤(1)中，所述猪毛菜为藜科猪毛菜属植物猪毛菜7-10月采摘的处于果期的全草，将收集到的猪毛菜流水下冲洗3-4次后于50℃干燥至恒重，立即使用或放至4℃冰箱中备用。
上述步骤(1)中，所述猪毛菜粉碎，包括将猪毛菜粉碎至60目以上。
上述步骤(2)中，所述超声波第一次热提取条件为，功率250-350W，2.5-3.5W/ml，频率20-40kHz，温度60～70℃，搅拌转速80-100rpm/min，时间为50-70min。
上述步骤(5)中，所述红曲霉，其生物学名称为：Monascus purpureus，购于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC CF 2008725。
优选地，所述红曲霉种子液的制备方法：将保存的红曲霉种子接入固体斜面培养基中活化，在30℃温度下培养7-10天，活化后，根据需要接入若干固体斜面培养基中扩大培养，将制好的红曲霉斜面孢子用无菌生理盐水冲洗，倒入经过灭菌的装有生理盐水的三角瓶中，三角瓶中预先装有数十粒玻璃珠，在摇床上震荡，充分打散孢子，用无菌滤纸过滤除去菌丝，用无菌生理盐水适当稀释，制成孢子浓度为1×106个/mL的红曲霉孢子悬液，将红曲霉孢子悬液按照10％的比例接入红曲霉种子培养基中，在温度30℃，转速200r/min，摇床培养72h即得红曲霉种子液；
所述的固体斜面培养基为麦芽汁培养基，配方为麦芽膏粉130g，琼脂1.5％，加水至1L，PH 6.0±0.2；
所述的红曲霉种子培养基的配方为麦芽膏粉130g，加水至1L，PH 6.0±0.2。
上述步骤(8)中，所述超声波第二次热提取条件为，功率250-350W，2.5-3.5W/ml，频率20-40kHz，温度50～60℃，搅拌转速80-100rpm/min，时间为50-70min；
上述步骤(10)中，所述高温瞬时灭菌条件为温度130-150℃，时间5-15秒；
上述步骤(10)中，所述防腐剂为对羟基苯乙酮、1,2-己二醇，所述对羟基苯乙酮占猪毛菜红曲霉发酵饮料的质量百分数为0.3％～0.8％，所述1,2-己二醇占猪毛菜红曲霉发酵饮料的质量百分数为0.3％～0.8％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、猪毛菜红曲霉发酵饮料具有良好的降血脂、降血压功效，每天饮用200-400ml可有效预防高血脂、高血压疾病的发生，每天饮用400-600ml可有效治疗高血脂、高血压疾病(见表1-5)，另外还具有一定的活血化瘀、预防和治疗脂肪肝以及抗氧化、抗衰老等有益功效，超量饮用也安全、无任何毒副作用(见表6)，有病治病，无病预防，滋补强身健体。
2、降血脂和降血压功效的猪毛菜红曲霉发酵饮料富含氨基酸、多糖、维生素、多种矿物质等对人体有益的成分，尤其富含有机硒、维生素C，营养丰富，通过发酵不仅丰富了饮料的营养成分，发酵后猪毛菜的涩味得到明显的改善，且猪毛菜中的芳香类物质也改良了饮料的风味，使风味更为醇厚。
3、本发明采用2步超声波热提取和微生物发酵的方法对猪毛菜中成分进行多步骤低温提取，提取效率高，提取过程不使用有机溶剂，无化学残留，最大限度的保留猪毛菜中活性成分；使用的原料猪毛菜和红曲霉均是药食两用中药材，产品在生产、使用及处理过程中均符合环境要求，对环境无害。
4、猪毛菜红曲霉发酵饮料的降血脂、降血压功效明显大于同等用量的猪毛菜和红曲霉加合的效果。猪毛菜经红曲霉作用后，去除了猪毛菜细胞壁的物理屏障作用，提高了猪毛菜有效成分的得率，在生物酶解作用下将猪毛菜中的大分子物质转化为小分子物质，便于人体吸收，同时红曲霉利用猪毛菜中的营养成分生长，猪毛菜中多种功效成分刺激红曲霉中莫纳克林K等降血脂、降血压成分的合成(见图1)，或者有可能在猪毛菜和红曲霉的双向发酵过程中产生了新的未知有益成分，显著提高了饮料的复合价值。
5、防腐、抗菌功能：红曲霉发酵产物中含有多种抗菌活性成分，并在传统食品豆腐乳中广泛应用，使得猪毛菜红曲霉发酵饮料添加少量化学防腐剂即可得到较长时间的保存。
6、色泽怡人：猪毛菜红曲霉发酵产物含有红曲红色素、黄色素等多种天然色素，为天然抗氧化剂、耐高温、易被人体降解，环境友好，在发酵的过程中，红曲色素的颜色渗入到饮料中，使最终的猪毛菜红曲霉发酵饮料具有诱人的红色(见图4、图5)，且颜色持久，不会褪去。
本发明采用的红曲霉，其生物学名称为：Monascus purpureus，购于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC CF 2008725。
附图说明
图1是莫纳克林K随发酵时间的变化结果图；
图2是猪毛菜红曲霉发酵饮料制备流程图；
图3是猪毛菜红曲霉固体发酵展示图；
图4是猪毛菜红曲霉液体发酵离心后展示图；
图5是猪毛菜红曲霉发酵饮料产品示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中，若未特别提及，所用试剂或材料均为常规市售，所用操作均为常规技术手段。
下述各实施例中，所述猪毛菜为藜科猪毛菜属植物猪毛菜7-10月采摘的处于果期的全草，将收集到的猪毛菜流水下冲洗3-4次后于50℃干燥至恒重，立即使用或放至4℃冰箱中备用。
下述各实施例中，所述红曲霉，其生物学名称为：Monascus purpureus，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC CF 2008725。
下述各实施例中，所述红曲霉种子液的制备方法：将保存的红曲霉种子接入固体斜面培养基中活化，在30℃温度下培养7-10天，活化后，根据需要接入若干固体斜面培养基中扩大培养，将制好的红曲霉斜面孢子用无菌生理盐水冲洗，倒入经过灭菌的装有生理盐水的三角瓶中，三角瓶中预先装有数十粒玻璃珠，在摇床上震荡，充分打散孢子，用无菌滤纸过滤除去菌丝，用无菌生理盐水适当稀释，制成孢子浓度为1×106个/mL的红曲霉孢子悬液。将红曲霉孢子悬液按照10％的比例接入红曲霉种子培养基中，在温度30℃，转速200r/min，摇床培养72h即得红曲霉种子液。
所述的固体斜面培养基为麦芽汁培养基，配方为麦芽膏粉130g，琼脂1.5％，加水至1L，PH 6.0±0.2。
所述的红曲霉种子培养基为，配方为麦芽膏粉130g，加水至1L，PH 6.0±0.2。
实施例1
步骤1，用实验室小型粉碎机将猪毛菜粉碎至过60目，制得猪毛菜粉末。
步骤2，将猪毛菜粉末与70％乙醇按照1:20的比例混合均匀，超声波热提取条件为，在功率250W，2.5W/ml，频率40kHz，温度60℃，搅拌转速80rpm/min，时间为70min的超声波条件下对猪毛菜中的活性成分进行提取；提取完成后，抽滤得滤液和滤渣。
步骤3，将所得滤液，减压浓缩，冷冻干燥后，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物1。
步骤4，将所得滤渣与水(g:mL)按照1:1的比例混合，放入灭菌锅中121℃灭菌20min后取出，制得猪毛菜发酵培养基。
步骤5，向猪毛菜发酵培养基中加入8％的红曲霉种子液，搅拌均匀，摊开，厚度1-2cm左右，在温度为32℃条件下，固体发酵72h，等到红曲霉长出白色略显粉红色的菌丝，停止固体发酵，得猪毛菜红曲霉固体发酵物。
步骤6，按照红曲霉猪毛菜固体发酵物湿重和无菌水比例1:20的比例混合，并搅拌均匀，密封，26℃厌氧发酵120h，制得猪毛菜红曲霉初始发酵液。
步骤7，将猪毛菜红曲霉初始发酵液过滤后，在5000r/min下离心15min，得到沉淀物和猪毛菜红曲霉发酵原液。
步骤8，将所得滤渣和沉淀与30％乙醇(g:ml)按照1:20的比例混合均匀，超声波第二次热提取，抽滤得滤液和滤渣，弃滤渣。
步骤9，将所得滤液，减压浓缩后，冷冻干燥，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物2。
步骤10，按照猪毛菜发酵原液20ml，蒸馏水70ml，猪毛菜提取物1 1.2g，猪毛菜提取物2 0.8g，蔗糖6.4g的比例混合均匀，在温度130℃，时间15秒条件下高温瞬时灭菌后；冷却至室温，加入占猪毛菜红曲霉发酵饮料质量百分数0.8％的对羟基苯乙酮和0.8％的1,2-己二醇，得到猪毛菜红曲霉发酵饮料。
实施例2
步骤1，用实验室小型粉碎机将猪毛菜粉碎至过80目，制得猪毛菜粉末。
步骤2，将猪毛菜粉末与70％乙醇按照1:20的比例混合均匀，超声波热提取条件为，在功率300W，3.0W/ml，频率30kHz，温度60℃，搅拌转速80rpm/min，时间为60min的超声波条件下对猪毛菜中的活性成分进行提取；提取完成后，抽滤得滤液和滤渣。
步骤3.将所得滤液，减压浓缩，冷冻干燥后，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物1。
步骤4，将所得滤渣与水(g:mL)按照1:1的比例混合，放入灭菌锅中121℃灭菌20min后取出，制得猪毛菜发酵培养基。
步骤5，向猪毛菜发酵培养基中加入12％的红曲霉种子液，搅拌均匀，摊开，厚度1-2cm左右，在温度为30℃条件下，固体发酵110h，等到红曲霉长出白色略显粉红色的菌丝，停止固体发酵，得猪毛菜红曲霉固体发酵物。
步骤6，按照红曲霉猪毛菜固体发酵物湿重和无菌水比例1:20的比例混合,并搅拌均匀，密封,28℃厌氧发酵90h，制得猪毛菜红曲霉初始发酵液。
步骤7，将猪毛菜红曲霉初始发酵液过滤后，在8000r/min下离心10min，得到沉淀物和猪毛菜红曲霉发酵原液。
步骤8，将所得滤渣和沉淀与30％乙醇(g:ml)按照1:20的比例混合均匀，超声波第二次热提取，抽滤得滤液和滤渣，弃滤渣。
步骤9，将所得滤液，减压浓缩后，冷冻干燥，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物2。
步骤10，按照猪毛菜发酵原液30ml，蒸馏水60ml，猪毛菜提取物1 1.0g，猪毛菜提取物2 0.6g，蔗糖7.4g的比例混合均匀，在温度140℃，时间10秒条件下高温瞬时灭菌后；冷却至室温，加入占猪毛菜红曲霉发酵饮料质量百分数0.5％的对羟基苯乙酮和0.5％的1,2-己二醇，得到猪毛菜红曲霉发酵饮料。
实施例3
步骤1，用实验室小型粉碎机将猪毛菜粉碎至过120目，制得猪毛菜粉末。
步骤2，将猪毛菜粉末与70％乙醇按照1:20的比例混合均匀，超声波热提取条件为，在功率350W，3.5W/ml，频率20kHz，温度70℃，搅拌转速100rpm/min，时间为50min的超声波条件下对猪毛菜中的活性成分进行提取；提取完成后，抽滤得滤液和滤渣。
步骤3.将所得滤液，减压浓缩，冷冻干燥后，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物1。
步骤4，将所得滤渣与水(g：mL)按照1:1的比例混合，放入灭菌锅中121℃灭菌20min后取出，制得猪毛菜发酵培养基。
步骤5，向猪毛菜发酵培养基中加入粉碎后质量比为15％的红曲霉种子液，搅拌均匀，摊开，厚度1-2cm左右，在温度为28℃条件下，固体发酵144h，等到红曲长出白色略显粉红色的菌丝，停止固体发酵，得猪毛菜红曲霉固体发酵物。
步骤6，按照红曲霉猪毛菜固体发酵物湿重和无菌水比例1:20的比例混合,并搅拌均匀，密封,30℃厌氧发酵48h，制得猪毛菜红曲霉初始发酵液。
步骤7，将猪毛菜红曲霉初始发酵液过滤后，在10000r/min下离心5min，得到沉淀物和猪毛菜红曲霉发酵原液。
步骤8，将所得滤渣和沉淀与30％乙醇(g:ml)按照1:20的比例混合均匀，超声波第二次热提取，抽滤得滤液和滤渣，弃滤渣。
步骤9，将所得滤液，减压浓缩后，冷冻干燥，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物2。
步骤10，按照猪毛菜发酵原液40ml，蒸馏水50ml，猪毛菜提取物1 0.8g，猪毛菜提取物2 0.3g，蔗糖8.1g的比例混合均匀，在温度150℃，时间5秒条件下高温瞬时灭菌后，冷却至室温，加入占猪毛菜红曲霉发酵饮料质量百分数0.3％的对羟基苯乙酮和0.5％的1,2-己二醇，得到猪毛菜红曲霉发酵饮料。
效果例
一、猪毛菜红曲霉发酵饮料预防和治疗大鼠高脂血症实验。
(1)实验大鼠
Wistar大鼠，清洁级，体重174±18g，10-12周龄，由河南省实验动物中心提供，许可证号SCXK(豫)2022-0007，实验期间环境温度23±2℃，湿度60±5％。
(2)饲料基础饲料：玉米：55％，麦麸16％，豆粕22％，鱼粉5％，食盐0.9％，微量元素0.1％，氨基酸1％，多维适量。
高脂饲料：2％胆固醇，10％猪油，甲基硫氧嘧啶0.2％，胆酸钠0.5％，基础饲料87.3％
(3)预防大鼠高脂血症试验方法
取45只Wistar大鼠，随机分成5组，每组9只大鼠，分别为正常对照组，高脂对照组、猪毛菜红曲霉饮料低剂量组、中剂量组和高剂量组，为便于大鼠灌胃，将猪毛菜红曲霉发酵饮料适当稀释或浓缩后进行实验，在饲喂高脂饲料同时按照低、中、高剂量组1mL/kg、2mL/kg，3mL/kg用量(折算后，分别相当于人每天100ml/120kg，200ml/120kg，300ml/120kg用量)，每天灌胃饮料；高脂对照组，饲喂高脂饲料同时灌胃和功能饮料组等剂量的蒸馏水；正常对照组饲喂基础饲料，并灌服等剂量的蒸馏水。连续饲喂30天，每周称重一次，实验结束禁食16小时，眼球采血测量各组大鼠血脂各项指标，采用酶法测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。
(4)治疗大鼠高脂血症试验方法
取45只Wistar大鼠，随机分成5组，每组9只，分别为正常对照组，模型对照组，猪毛菜红曲霉发酵饮料低、中、高剂量组，正常组每天饲喂基础饲料，模型对照组和红曲霉发酵饮料各剂量组每天饲喂高脂饲料，40天后称重，测定血脂水平。造模成功后，各组均改换基础饲料，为便于大鼠灌胃，将猪毛菜红曲霉发酵饮料适当稀释或浓缩后进行实验，在饲喂高脂饲料同时按照低、中、高剂量组2mL/kg，4mL/kg，6mL/kg用量(折算后，分别相当于人每天200ml/120kg，400ml/120kg，600ml/120kg用量)，每天灌胃功能饮料；高脂对照组，灌胃和功能饮料组等剂量的蒸馏水；正常对照组灌服等剂量的蒸馏水。连续饲喂30天，每周称重一次，实验结束禁食16小时，眼球采血，采用酶法测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。
(5)单次灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料对高血压大鼠血压的影响
选取180±10g大鼠30只，随机分为5组，分别作为正常对照组、高压对照组、饮料低、中、高剂量组。任选其中1组大鼠作为空白对照组，每天给予1ml生理盐水腹腔注射(分2次注射)，连续4周。其它4组按照每天15mg/kg的用量(分2次注射)注射左旋硝基精氨酸，连续4周，直至出现典型高血压症状(符合WHO/ISO高血压分级标准)。造模成功后高压对照组灌胃给予1ml生理盐水，饮料低、中、高剂量组分别给予2、4、6ml的猪毛菜红曲霉发酵饮料；观测各组大鼠给药后1h、2h和3h收缩压和舒张压的变化情况。
(6)连续灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料对高血压大鼠血压的影响
选取6只正常大鼠作为空白对照组，另选取左旋硝基精氨酸造模成功的大鼠24只，随机分为4组，分别作为高压对照组、饮料低、中、高剂量组。高压对照组灌胃给予1ml生理盐水，饮料低、中、高剂量组每天分别给予2、4、6ml的猪毛菜红曲霉发酵饮料，连续14d；观测各组大鼠给药后14d收缩压和舒张压的变化情况。
(7)连续灌胃后停止猪毛菜红曲霉发酵饮料对高血压大鼠血压的影响
在连续灌服猪毛菜红曲霉发酵饮料14d后，观测停止灌服猪毛菜红曲霉发酵饮料后各组大鼠收缩压和舒张压的变化情况。
(8)猪毛菜红曲霉发酵饮料对正常大鼠血压的影响
选取健康体重180g左右的Wistar雄性大鼠36只，随机分为4组，1号组为对照组，灌胃给以生理盐水1ml。2、3、4号组分别灌胃给予不同量的猪毛菜红曲霉发酵饮料；观测给药后不同时间段各组大鼠的血压变化情况。
(9)猪毛菜红曲霉发酵饮料的急性毒性实验
采用最大耐受计量法测定猪毛菜红曲霉发酵饮料的急性毒性，取家兔12只，雌雄各半，将猪毛菜红曲发酵液浓缩后灌胃给予，相当于浓缩前150ml/kg，相当于成人(50kg计)每次口服7500ml，用药后观察家兔活动状态，饮食，粪便，呼吸、体重及死亡情况，连续观察14d。
(10)发酵过程中莫纳可林K含量的变化
采用紫外分光光度法定时测定猪毛菜在红曲霉固体发酵和液体发酵过程中莫纳克林K含量，固体发酵按照比例折算成同体积的浓度含量。
二、结果
1、猪毛菜红曲霉发酵饮料对大鼠高脂血症的预防作用，结果如下表1。
表1.猪毛菜红曲霉发酵饮料对大鼠高脂血症的预防作用。
注：同列有不同肩注字母表示差异显著(P<0.05)，肩注数字有任何一个相同的，表示差异不显著(P>0.05),表中数据为(平均数±标准误差)。
猪毛菜红曲霉发酵饮料高脂对照组和正常对照组相比较，高脂对照组TC、TG、LDL-C均显著高于正常对照组(P<0.05)，HDL-C低于正常对照组，但没有显著差异(P>0.05)，说明饲喂高脂饲料能显著提高大鼠的血脂水平。猪毛菜红曲霉发酵饮料低、中、高各组给药后与高脂对照组比较，HDL-C随灌胃饮料的增加而增高，但没有显著差异(P>0.05)，TC、TG、LDL-C除低剂量组TG降低但没有显著差异外(P>0.05)，大鼠中、高饮料剂量组TC、LDL-C均显著降低(P<0.05)，说明灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料能有效降低大鼠血脂含量，对大鼠高脂血症具有明显的预防作用；猪毛菜红曲霉发酵饮料TC、LDL-C、HDL-C和HDL-C中剂量组(相当于人200mL/120kg)、高剂量组、正常对照组之间无显著差异性(P>0.05),故最适人用饮用剂量推荐为200-300mL/天。
2、猪毛菜红曲霉发酵饮料对高脂血症大鼠的治疗作用，结果如下表2。
表2.猪毛菜红曲霉发酵饮料对高脂血症大鼠的治疗作用。
注：同列有不同肩注字母表示差异显著(P<0.05)，肩注数字有任何一个相同的，表示差异不显著(P>0.05),表中数据为(平均数±标准误差)。
高脂对照组与正常对照组相比较，血清TC、TG、LDL-C明显升高(P<0.05)，HDL-C显著降低(P<0.05)，说明本实验模型建立成功；猪毛菜红曲霉发酵饮料低剂量组与高脂对照组及给予猪毛菜红曲霉发酵饮料前相比较，TC含量显著降低(P<0.05)，其它指标没有表现出显著差异性；猪毛菜红曲霉发酵饮料中、高剂量组给药后与高脂对照组及给药前相比较，大鼠TC、LDL-C明显降低(P<0.05)，TG含量降低，而HDL-C含量升高，但均没有表现出显著差异性(P>0.05)；猪毛菜红曲霉发酵饮料高剂量组和中剂量组实验各指标均没有表现出显著差异(P>0.05)，该实验说明4mL/kg和6ml/kg用量(相当于人每天用量400mL/120kg和600mL/120kg)的猪毛菜红曲霉发酵饮料对大鼠高脂血症具有治疗作用。
3、单次灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料对高血压大鼠血压的影响，结果如下表3。
表3.单次灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料对高血压大鼠血压的影响。
注：同列有不同肩注字母表示差异显著(P<0.05)，肩注数字有任何一个相同的，表示差异不显著(P>0.05),表中数据为(平均数±标准误差)。
高压对照组收缩压和舒张压显著高于正常对照组(P<0.05)，说明大鼠注射左旋硝基精氨酸高血压模型造模成功。单次灌服猪毛菜乙醇提取物后，低、中、高灌胃饮料组收缩压和舒张压均呈现先下降后上升趋势，1h后3个剂量组收缩压和舒张压开始下降，2h达到最低，3h又开始上升，并且呈现明显的量效关系，即灌胃饮料越多，收缩压和舒张压下降的也越多。其中，灌服饮料中、高剂量组在服药后2h收缩压和舒张压和服药前相比较显著下降(P<0.05)，说明口服猪毛菜红曲霉发酵饮料对左旋硝基精氨酸引起的高血压大鼠有降压作用。
4、连续灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料对高血压大鼠血压的影响，结果如下表4。
表4.连续灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料对高血压大鼠血压的影响。
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注：同列有不同肩注字母表示差异显著(P<0.05)，肩注数字有任何一个相同的，表示差异不显著(P>0.05),表中数据为(平均数±标准误差)
正常对照组和模型对照组的大鼠血压在灌胃前后收缩压和舒张压没有明显变化，表明L-NNA诱导的高血压模型所形成的大鼠血压稳定。3个饮料组中，随着灌胃天数的增加，大鼠收缩压和舒张压呈明显下降趋势，收缩压和舒张压随着饮料灌胃剂量的增加，降低幅度也增加，直至接近正常大鼠的血压值，呈现明显的量效关系。3个饮料组中，低剂量组(2ml)第9天后(包括第9天)收缩压显著低于灌胃前(P<0.05)，舒张压第11天显著低于灌胃前(P<0.05)；中等剂量组(4ml)第7天后(包括第7天天)收缩压显著低于灌胃前(P<0.05)，舒张压第9天显著低于灌胃前(P<0.05)；高剂量组(6ml)第5天后(包括第5天)收缩压和舒张压均显著低于灌胃前(P<0.05)。该实验说明低、中、高饮料剂量组对大鼠高血压均有治疗作用，剂量越大，降压幅度越大，越早出现降压效果，推荐猪毛菜红曲霉发酵饮料治疗高血压的用量为4 -6ml/kg用量(相当于人每天用量400mL/120kg和600mL/120kg)。
5、连续灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料高血压大鼠停止灌胃后对血压的影响，结果如下表5。
表5.连续灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料高血压大鼠停止灌胃后血压的变化。
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注：同列有不同肩注字母表示差异显著(P<0.05)，肩注数字有任何一个相同的，表示差异不显著(P>0.05),表中数据为(平均数±标准误差)
停药后第1天各剂量组收缩压和舒张压均有上升趋势，到第6天各剂量组血压和模型组持平，说明猪毛菜红曲霉发酵饮料治疗高血压需长期服用，停用后易反弹。
6、猪毛菜红曲霉发酵饮料对正常大鼠血压的影响，结果如下表6。
表6猪毛菜红曲霉发酵饮料对正常大鼠血压的影响。
注：同列有不同肩注字母表示差异显著(P<0.05)，肩注数字有任何一个相同的，表示差异不显著(P>0.05),表中数据为(平均数±标准误差)
从灌胃猪毛菜红曲霉发酵饮料后大鼠血压随时间的变化可以看到，给药组与对照组血压变化相似，没有显著差异(P>0.05)，猪毛菜红曲霉发酵饮料对正常大鼠血压没有明显影响。
7、猪毛菜红曲霉发酵饮料急性毒性
各组小鼠灌胃后生长良好，体重增加，行为正常，无死亡及异常反应，40d后处死解剖观察，各器官未见异常改变。本发明的猪毛菜红曲霉发酵饮料最大剂量口服(每天7500ml)使用，对动物无明显损害，对机体无毒性反应，是一种安全可靠的饮料。
8、猪毛菜红曲霉共发酵过程中莫纳克林K的变化
莫纳克林K随发酵时间的变化如图1所示。
猪毛菜红曲霉发酵过程中莫纳可林K含量随发酵时间先升高后趋于平稳，最后稍有降低，莫纳可林K含量从0.10±0.01g/L增至0.35±0.02g/L，在发酵进行170h达到最高点，说明猪毛菜对于红曲霉产生莫纳可林K具有促进作用。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种猪毛菜红曲霉发酵饮料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将猪毛菜粉碎，制得猪毛菜粉末；
（2）将猪毛菜粉末与70 %乙醇按照质量体积比为1:20的比例混合均匀，超声波第一次热提取，抽滤得滤液和滤渣；
（3）将步骤（2）所得滤液，减压浓缩，冷冻干燥后，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物1；
（4）将步骤（2）所得滤渣与水按照质量体积比为1:1的比例混合，放入灭菌锅中121 ℃灭菌20 min后取出，制得猪毛菜发酵培养基；
（5）向步骤（4）所得猪毛菜发酵培养基中加入8 %-15 %的红曲霉种子液，搅拌均匀，摊开，厚度1-2cm，在温度为 28-32 ℃条件下，固体发酵72-144 h，等到红曲霉长出白色略显粉红色的菌丝，停止固体发酵，得猪毛菜红曲霉固体发酵物；
（6）将红曲霉猪毛菜固体发酵物湿重和无菌水按照质量体积比为1:20的比例混合，并搅拌均匀，密封，26-30℃厌氧发酵48-120 h，制得猪毛菜红曲霉初始发酵液；
（7）将步骤（6）所得猪毛菜红曲霉初始发酵液过滤后，在5000-10000 r/min下离心5-15min，得到沉淀物和猪毛菜红曲霉发酵原液；
（8）将步骤（7）所得沉淀物与30 %乙醇按照质量体积比为1:20的比例混合均匀，超声波第二次热提取，抽滤得滤液和滤渣，弃滤渣；
（9）将步骤（8）所得滤液，减压浓缩后，冷冻干燥，粉碎，过40目筛，制得猪毛菜提取物2；
（10）按照猪毛菜发酵原液20-40 ml、蒸馏水50-70 ml、猪毛菜提取物1 0.8-1.2g、猪毛菜提取物2 0.3-0.8 g、蔗糖5-10 g的比例混合均匀，高温瞬时灭菌后；冷却至室温，加入防腐剂得到猪毛菜红曲霉发酵饮料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述猪毛菜为藜科猪毛菜属植物猪毛菜7-10月采摘的处于果期的全草，将收集到的猪毛菜流水下冲洗 3-4 次后于 50 ℃干燥至恒重，立即使用或放至4 ℃冰箱中备用。
3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述超声波第一次热提取条件为，功率250-350 W，2.5-3.5 W/ml，频率20-40 kHz，温度60～70 ℃，搅拌转速80-100 rpm/min，时间为50-70 min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述红曲霉，其生物学名称为：Monascus purpureus，购于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC CF 2008725。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述红曲霉种子液的制备方法为：
将保存的红曲霉种子接入固体斜面培养基中活化，在30 ℃温度下培养7-10天，活化后，根据需要接入若干固体斜面培养基中扩大培养，将制好的红曲霉斜面孢子用无菌生理盐水冲洗，倒入经过灭菌的装有生理盐水的三角瓶中，三角瓶中预先装有数十粒玻璃珠，在摇床上震荡，充分打散孢子，用无菌滤纸过滤除去菌丝，用无菌生理盐水适当稀释，制成孢子浓度为1×106个/mL的红曲霉孢子悬液；将红曲霉孢子悬液按照10 %的比例接入红曲霉种子培养基中，在温度30 ℃，转速200 r/min，摇床培养72 h即得红曲霉种子液；
所述的固体斜面培养基为麦芽汁培养基，配方为麦芽膏粉130 g，琼脂1.5 %，加水至1L，pH 6.0±0.2；
所述的红曲霉种子培养基的配方为麦芽膏粉130 g，加水至1 L，pH 6.0±0.2。
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述超声波第二次热提取条件为：功率250-350 W，2.5-3.5 W/ml，频率20-40 kHz，温度50～60 ℃，搅拌转速80-100 rpm/min，时间为50-70 min。
7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述高温瞬时灭菌条件为温度130-150℃，时间5-15秒。
8. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述防腐剂为对羟基苯乙酮、1,2-己二醇，所述对羟基苯乙酮占猪毛菜红曲霉发酵饮料的质量百分数为0.3 %～0.8 %，所述1,2-己二醇占猪毛菜红曲霉发酵饮料的质量百分数为0.3 %～0.8 %。
9.采用权利要求1-8任意一种所述的制备方法制备的猪毛菜红曲霉发酵饮料。
10.如权利要求9所述的猪毛菜红曲霉发酵饮料在制备具有降血脂和降血压功效食品方面的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202311217201.2A CN117016713A (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 一种猪毛菜红曲霉发酵饮料及其制备方法和应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311217201.2A CN117016713A (zh) | 2023-09-20 | 2023-09-20 | 一种猪毛菜红曲霉发酵饮料及其制备方法和应用 |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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-
2023
- 2023-09-20 CN CN202311217201.2A patent/CN117016713A/zh active Pending
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