CN104694588A - 基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素mk-7的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,包括如下步骤:菌种活化、种子培养、发酵培养基预处理、发酵培养、喷雾干燥制备维生素MK-7。本发明相比现有技术具有以下优点:本发明的一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,制备工艺简单且易于控制,后加工成本低,并且发酵原料是提取菌菇多糖后的副产品,原料易得成本低,而且可以实现副产品的循环利用。喷雾干燥得到的维生素MK-7粗品无毒性可以直接添加到食品中作为维生素MK-7的增补剂。本发明浓缩提取的MK-7回收率达到70%以上。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法。
背景技术
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种,是一种益生菌,能产生多种营养物质,如维生素、氨基酸、促生长因子等。纳豆芽孢杆菌作为一种很有研究前景的菌种,在生产营养物质及作用机理方面引起许多学者的关注和研究。
纳豆芽孢杆菌在生产维生素MK-7方面有很大潜力,维生素MK-7在生物体内有重要的作用。治疗和预防骨质疏松症,维生素MK-7生成骨蛋白质,增加骨密度,防止骨折。维生素MK-7可预防肝硬化进展为肝癌。治疗维生素MK-7缺乏性出血症,促进凝血酶原的形成,加速凝血,维持正常的凝血时间。
纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种,是一种益生菌,能产生多种营养物质,如维生素、氨基酸、促生长因子等。纳豆芽孢杆菌作为一种很有研究前景的菌种,在生产营养物质及作用机理方面引起许多学者的关注和研究。
纳豆芽孢杆菌在生产MK-7(Menaquinone-7)方面有很大潜力,MK-7是维生素MK-7的一种,根据C23上异戊二烯侧链长度的不同,维生素MK-7(Menaquinone,MK)以MK-n表示,其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数。MK-7能预防并治疗骨质疏松症,它能促进骨蛋白质的生成,并与钙生成骨质,从而增加骨密度防止骨折。
目前纳豆芽孢杆菌发酵产维生素MK-7均采用化学成分培养基,尚未发现采用本发明采用的利用工业副产品进行发酵生产维生素MK-7的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,包括如下步骤:
(1)、菌种活化,将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟后,再在温度为37℃条件下,活化培养36-48小时,;
(2)、种子培养,将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.2~7.4,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为35-40℃条件下,培养20-30小时,得到液体种子;
(3)、发酵培养基预处理,将发酵培养基蒸煮5-10分钟后,再在常温下静置10-15小时,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟;
该发酵培养基的配方由以下组分组成:70~90g/L菌菇副产品、20~40g/L的大豆粉或10~20g/L的豆腐渣粉,40~60g/L甘油和5~7g/LK2HPO4,该调发酵培养基的PH为6.5-7.5;
(4)、发酵培养,在经过预处理的发酵培养基中,按照7%~12%的接种量,接种步骤(2)得到的液体种子,并在35-40℃,以转速180-220r/min摇瓶,培养6-8天;
(5)、喷雾干燥制备维生素MK-7
(51)、喷雾干燥,在无菌条件下,往接种后的发酵液中加入保护剂,在压缩机压力为0.2~0.4MPa条件下,进行喷雾干燥,喷雾干燥进口温度为150℃,出口温度为60~70℃,得到固体产品;
该保护剂的配方由以下组分组成:30~40g/L脱脂奶粉,10~20g/L麦芽糖,5~10g/L蔗糖,15~25g/L甘露醇和及10~20g/LL-谷氨酸钠;
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合物,以转速180~250r/min摇床震荡30~60min后,静置12~15小时;
(53)、收集上清,将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷,再以180~250r/min摇床震荡10~20min,置于-18~-30℃冰箱冷冻12-24小时;
(54)、吸取有机相,将经步骤(53)处理的混合物,在65℃下,旋蒸除去有机溶剂,得到淡黄色固体为维生素MK-7。
作为上述方案的进一步优化,菌种活化采用的平板培养基,其配方由以下组分组成:蛋白胨4~6g/L,牛肉膏4~6g/L,氯化钠4~6g/L,琼脂粉20g/L。
作为上述方案的进一步优化,在制备种子过程中,种子培养液的配方由以下组分组成:葡萄糖8~12g/L,蛋白胨8~12g/L,氯化钠4~6g/L。
作为上述方案的进一步优化,该将菌菇副产品为平菇、香菇、草菇、金针菇中的一种或几种经提取多糖后剩余的工业产物;该大豆粉或豆腐渣粉在55-70℃下烘干,经烘干后的大豆粉或豆腐渣粉的含水量<10%。
作为上述方案的进一步优化,该发酵培养基的配方由以下组分组成:70~90g/L菌菇副产品、20~40g/L的大豆粉或10~20g/L的豆腐渣粉、5g/L-10g/L麸皮、.2g/L-0.3g/LMgSO4、0.1g/L-0.2g/LZnCl2、40~60g/L甘油和5~7g/LK2HPO4,该调发酵培养基的PH为6.5-7.5;本发明相比现有技术具有以下优点:本发明的一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,制备工艺简单且易于控制,后加工成本低,生产环境友好,并且发酵原料是提取菌菇多糖后的副产品,原料易得成本低,而且可以实现副产品的循环利用。喷雾干燥得到的维生素MK-7粗品无毒性可以直接添加到食品中作为维生素MK-7的增补剂。经提纯后,可以制成维生素MK-7类药品。使用本发明的方法制备的维生素MK-7回收率达到70%以上。
附图说明
图1是本发明的基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1.菌种活化:
本发明采用本实验室分离的一株具有产维生素MK-7能力的一株纳豆芽孢杆菌(BN-2-6)作为发酵菌种,将-80℃保存的纳豆芽孢杆菌将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟后,再在温度为37℃条件下,活化培养36小时。其中平板培养基的组成成分为:蛋白胨4g/L,牛肉膏4g/L,氯化钠4g/L,琼脂粉20g/L。然后挑取发育健壮的纳豆芽孢杆菌单菌。
2.种子培养:
将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.2,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为35℃条件下,培养20小时,得到液体种子。其中,种子培养液的成分为:葡萄糖8g/L,蛋白胨8g/L,氯化钠4g/L。
3.发酵培养基预处理:
将菌菇副产品(其中菌菇副产品包括平菇和香菇,混合比例为1:1)、大豆及豆腐渣在65℃烘箱中进行烘干,含水量为5%,然后将菌菇副产品、大豆及豆腐渣磨碎,过60目筛网,配置发酵培养基。该发酵培养基成分包括:70g/L菌菇副产品,20g/L大豆粉,40g/L甘油,5g/LK2HPO4。将发酵培养基常压蒸煮5min,放置过夜,调PH到7.0,然后121℃灭菌20分钟,待培养基冷发酵培养基预处理,将发酵培养基蒸煮5分钟后,再在常温下静置10小时,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟;再将发酵培养基自然冷却;
4.发酵培养:
在经过预处理的发酵培养基中,按照7%的接种量,接种步骤2得到的液体种子,并在35℃,以转速200r/min摇瓶,培养7天;
5.喷雾干燥制备成品:
(51)、喷雾干燥,在无菌条件下,往接种后的发酵液中加入保护剂,在压缩机压力为0.2~0.4MPa条件下,进行喷雾干燥,喷雾干燥进口温度为150℃,出口温度为60℃,得到固体产品,维生素MK-7含量为170.32mg/kg。
该保护剂的配方由以下组分组成:40g/L脱脂奶粉,10g/L麦芽糖,5g/L蔗糖,15g/L甘露醇和20g/LL-谷氨酸钠。
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合物,以转速200r/min摇床震荡40min后,静置13小时;
(53)、收集上清,将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷,再以200r/min摇床震荡20min,置于-18~-30℃冰箱冷冻12-24小时;
(54)、吸取有机相,将经步骤(53)处理的混合物,在65℃下,旋蒸除去有机溶剂,得到淡黄色固体为维生素MK-7。实用本实施例的方法维生素MK-7回收率为75%。
实施例2
1.菌种活化:
本发明采用本实验室分离的一株具有产维生素MK-7能力的一株纳豆芽孢杆菌(BN-2-6)作为发酵菌种,将-80℃保存的纳豆芽孢杆菌将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟后,再在温度为37℃条件下,活化培养48小时。其中平板培养基的组成成分为:蛋白胨5g/L,牛肉膏5g/L,氯化钠5g/L,琼脂粉20g/L。然后挑取发育健壮的纳豆芽孢杆菌单菌。
2.种子培养:
将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.2,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为37℃条件下,培养24小时,得到液体种子。其中,种子培养液的成分为:葡萄糖10g/L,蛋白胨10g/L,氯化钠5g/L。
3.发酵培养基预处理:
将菌菇副产品(其中菌菇副产品包括平菇、香菇、草菇、金针菇,含量均为25%)、大豆及豆腐渣在65℃烘箱中进行烘干,含水量为5%,然后将菌菇副产品、大豆及豆腐渣磨碎,过60目筛网,配置发酵培养基。该发酵培养基成分包括:80g/L菌菇副产品、20g/L大豆粉及10g/L豆腐渣、50g/L甘油、6g/LK2HPO4、8g/L麸皮、0.25g/LMgSO4、0.15g/LZnCl2。将发酵培养基常压蒸煮10min,放置过夜,调PH到7.0,然后121℃灭菌20分钟,待培养基冷发酵培养基预处理,将发酵培养基蒸煮5-10分钟后,再在常温下静置10-15小时,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟;再将发酵培养基自然冷却;
4.发酵培养:
在经过预处理的发酵培养基中,按照10%的接种量,接种步骤2得到的液体种子,并在35℃,以转速200r/min摇瓶,培养8天;
5.喷雾干燥制备成品:
(51)、喷雾干燥,在无菌条件下,往接种后的发酵液中加入保护剂,在压缩机压力为0.2~0.4MPa条件下,进行喷雾干燥,喷雾干燥进口温度为150℃,出口温度为60℃,得到固体产品,维生素MK-7含量为202.32mg/kg。
该保护剂的配方由以下组分组成:40g/L脱脂奶粉,20g/L麦芽糖,5g/L蔗糖,25g/L甘露醇和20g/LL-谷氨酸钠。
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合物,以转速250r/min摇床震荡60min后,静置15小时;
(53)、收集上清,将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷,再以250r/min摇床震荡20min,置于-30℃冰箱冷冻24小时;
(54)、吸取有机相,将经步骤(53)处理的混合物,在65℃下,旋蒸除去有机溶剂,得到淡黄色固体为维生素MK-7。实用本实施例的方法维生素MK-7回收率为80%。
实施例3
1.菌种活化:
本发明采用本实验室分离的一株具有产维生素MK-7能力的一株纳豆芽孢杆菌(BN-2-6)作为发酵菌种,将-80℃保存的纳豆芽孢杆菌将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟后,再在温度为37℃条件下,活化培养42小时。其中平板培养基的组成成分为:蛋白胨6g/L,牛肉膏6g/L,氯化钠6g/L,琼脂粉20g/L。然后挑取发育健壮的纳豆芽孢杆菌单菌。
2.种子培养:
将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.4,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为40℃条件下,培养30小时,得到液体种子。其中,种子培养液的成分为:葡萄糖12g/L,蛋白胨12g/L,氯化钠6g/L。
3.发酵培养基预处理:
将菌菇副产品(其中菌菇副产品包括草菇、金针菇,混合比例1:1)、大豆及豆腐渣在70℃烘箱中进行烘干,含水量为10%,然后将菌菇副产品、大豆及豆腐渣磨碎,过32目筛网,配置发酵培养基。该发酵培养基成分包括:90g/L菌菇副产品,20g/L豆腐渣,60g/L甘油,7g/LK2HPO4。将发酵培养基常压蒸煮10min,放置过夜,调PH到7.0,然后121℃灭菌20分钟,待培养基冷发酵培养基预处理,将发酵培养基蒸煮5-10分钟后,再在常温下静置10-15小时,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟;再将发酵培养基自然冷却;
4.发酵培养:
在经过预处理的发酵培养基中,按照12%的接种量,接种步骤2得到的液体种子,并在40℃,以转速200r/min摇瓶,培养6天;
5.喷雾干燥制备成品:
(51)、喷雾干燥,在无菌条件下,往接种后的发酵液中加入保护剂,在压缩机压力为0.2MPa条件下,进行喷雾干燥,喷雾干燥进口温度为150℃,出口温度为60℃,得到固体产品,维生素MK-7含量为150.11mg/kg。
该保护剂的配方由以下组分组成:30g/L脱脂奶粉,10g/L麦芽糖,5g/L蔗糖,25g/L甘露醇和10g/LL-谷氨酸钠。
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合物,以转速180r/min摇床震荡30min后,静置12小时;
(53)、收集上清,将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷,再以250r/min摇床震荡20min,置于-18℃冰箱冷冻24小时;
(54)、吸取有机相,将经步骤(53)处理的混合物,在65℃下,旋蒸除去有机溶剂,得到淡黄色固体为维生素MK-7。实用本实施例的方法维生素MK-7回收率为70%。
本发明的方法制备维生素MK-7,所采用的培养基成分是将菌菇提取多糖后得到的工业副产品。菌菇包括平菇、香菇、草菇、金针菇等,如平菇属于担子菌门散菌目侧耳科侧耳属,是种常见的灰色食用菇,平菇含丰富的营养物质,每百克干品中含蛋白质20—23克,还含有多种矿物质及多糖等。因此,菌菇作为培养基可以为纳豆芽孢杆菌提供碳源、氮源。生产过程中产生了大量废弃的菌菇渣,处理不当会成为二次污染源,造成经济损失或环境恶化。菌菇渣营养丰富,其营养成分因食用菌种类和栽培主料等不同而有较大差异,但平均情况大致如下:粗蛋白质平均含量约为8%,粗脂肪平均为0.8%,粗纤维平均约为17%,无氮浸出物平均约为40%,同时还含有丰富的钙、锌、铜、磷、铁、镁等矿物质中微量元素。这些菌菇渣可以为纳豆芽孢杆菌合成MK-7提供充足的碳源,氮源及其他微量元素。
本发明的方法制备维生素MK-7,采用喷雾干燥制得成品。喷雾干燥主要是通过机械作用,将原料液分散成很细的像雾一样的微粒,与热空气接触,在瞬间将大部分水分除去,使物料中的固体物质干燥成粉末。原料液可以是溶液、乳浊液或悬浮液,也可以是熔融液或膏状物。干燥产品可以根据需要,制成粉状、颗粒状、空心球状或团粒状。喷雾干燥具传热快、水分蒸发迅速、干燥时间短的特点,且制品质量好,溶解性能高,适用于热敏性药物,特别是可以用于一些特殊物料如含糖量高、有活性的物质。
本发明的一种基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,制备工艺简单且易于控制,后加工成本低,生产环境友好,并且发酵原料是提取菌菇多糖后的副产品,原料易得成本低,而且可以实现副产品的循环利用。喷雾干燥得到的维生素MK-7粗品无毒性可以直接添加到食品中作为维生素MK-7的增补剂。经提纯后,可以制成维生素MK-7类药品。使用本发明的方法制备的维生素MK-7回收率达到70%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)、菌种活化,将纳豆芽孢杆菌在平板培养基中,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟后,再在温度为37℃条件下,活化培养36-48小时;
(2)、种子培养,将经菌种活化的纳豆芽孢杆菌接种到种子培养液中,在PH为7.2~7.4,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟,再在温度为35-40℃条件下,培养20-30小时,得到液体种子;
(3)、发酵培养基预处理,将发酵培养基蒸煮5-10分钟后,再在常温下静置10-15小时,在温度为121℃条件下,灭菌20分钟;
该发酵培养基的配方由以下组分组成:70~90g/L菌菇副产品、20~40g/L的大豆粉或10~20g/L的豆腐渣粉,40~60g/L甘油和5~7g/LK2HPO4,该调发酵培养基的PH为6.5-7.5;
(4)、发酵培养,在经过预处理的发酵培养基中,按照7%~12%的接种量,接种步骤(2)得到的液体种子,并在35-40℃,以转速180-220r/min摇瓶,培养6-8天;
(5)、喷雾干燥制备维生素MK-7
(51)、喷雾干燥,在无菌条件下,往接种后的发酵液中加入保护剂,在压缩机压力为0.2~0.4MPa条件下,进行喷雾干燥,喷雾干燥进口温度为150℃,出口温度为60~70℃,得到固体产品;
该保护剂的配方由以下组分组成:30~40g/L脱脂奶粉,10~20g/L麦芽糖,5~10g/L蔗糖,15~25g/L甘露醇和10~20g/LL-谷氨酸钠;
(52)、将步骤(51)中得到的固体产品中加入正丙醇和正己烷混合物,以转速180~250r/min摇床震荡30~60min后,静置12~15小时;
(53)、收集上清,将经步骤(52)处理的混合液中加入二氯甲烷,再以180~250r/min摇床震荡10~20min,置于-18~-30℃冰箱冷冻12-24小时;
(54)、吸取有机相,将经步骤(53)处理的混合物,在65℃下,旋蒸除去有机溶剂,得到淡黄色固体为维生素MK-7。
2.根据权利要求1所述的基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,其特征在于:菌种活化采用的平板培养基,其配方由以下组分组成:蛋白胨4~6g/L、牛肉膏4~6g/L、氯化钠4~6g/L、琼脂粉20g/L。
3.根据权利要求1所述的基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,其特征在于:在制备种子过程中,种子培养液的配方由以下组分组成:葡萄糖8~12g/L,蛋白胨8~12g/L,氯化钠4~6g/L。
4.根据权利要求1所述的基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,其特征在于:该将菌菇副产品为平菇、香菇、草菇、金针菇中的一种或几种经提取多糖后剩余的工业产物;该大豆粉或豆腐渣粉在55-70℃下烘干,经烘干后的大豆粉或豆腐渣粉的含水量<10%。
5.根据权利要求1所述的基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素MK-7的制备方法,其特征在于:该发酵培养基的配方由以下组分组成:70~90g/L菌菇副产品、20~40g/L的大豆粉或10~20g/L的豆腐渣粉、5g/L-10g/L麸皮、0.2g/L-0.3g/LMgSO4、0.1g/L-0.2g/LZnCl2、40~60g/L甘油和5~7g/LK2HPO4,该调发酵培养基的PH为6.5-7.5。
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