CN110564803B - 一种秋葵生物活性肽的生产工艺及应用 - Google Patents

一种秋葵生物活性肽的生产工艺及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种秋葵生物活性肽的生产工艺及应用，按照本发明的工艺制得的产品口感好，分子量小，分子量小于1000道尔顿的肽含量高于93％，人体更容易吸收，其吸收率能达到90％以上。游离氨基酸含量低，产品纯度高。并且本发明制得的秋葵活性肽具有较高的抗氧化性，还具有改善肠道功能的作用。

Description

一种秋葵生物活性肽的生产工艺及应用
技术领域
本发明属于活性肽生产技术领域，具体涉及一种秋葵生物活性肽的生产工艺及应用。
背景技术
秋葵(Abelmoschus esculentus L.Moench)为锦葵科(Malvaceae)秋葵属(Abelmoschus Medic)，亦称黄秋葵、咖啡黄葵，一年生草本植物。秋葵种子近球形，种皮呈灰黑色至褐色，有小腺体，揉之有咖啡香味，干粒约重55g～75g。目前秋葵种子主要用于油脂的提取，随之会产生大量的饼粕。黄秋葵种子蛋白质含量丰富约占20％，脱脂后可达55％[1]，蛋白质营养价值与大豆蛋白接近。随着人们生活水平的不断提高，对植物蛋白的需求量也越来越大，植物蛋白不仅可作为食品添加剂，也可作为营养成分补充人体所需的蛋白质。蛋白质由于其分子量大且结构复杂，摄入人体后不易被消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的有效发挥。
近年来，生物活性肽在生物体内所发挥的生理功能受到越来越多的重视。生物活性肽与蛋白质相比，具有结构简单分子量小的特点，生物活性肽不仅能为机体提供营养，还具有调节植物神经系统、活化细胞免疫机能、改善心血管功能、抗衰老等多种生理活性功能。氧化与人类的癌症、老化、动脉硬化等多种疾病相关，适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病，对于预防和治疗心血管、糖尿病、癌症、衰老等慢性病有一定的疗效。1960年Marcuse首次报道了生物活性肽具有抗氧化活性，此后对食源性抗氧化肽的活性研究引起广泛关注，并发现许多来自食物蛋白生物活性肽具有抗氧化活性。因此，通过蛋白质的可控酶解技术制备天然的抗氧化肽，研究开发生物活性肽类抗氧化食品、保健品具有十分重要的科学意义和应用前景。
“酶解黄秋葵籽蛋白制备抗氧化肽的工艺优化”(《食品研究与开发》2018年第24期，郭溆等)，一文中公开了利用制备的黄秋葵籽粕蛋白为原料，采用酶解法以获得具有抗氧化活性的多肽，为黄秋葵籽粕的精深加工提供理论依据。首先进行蛋白酶的筛选，选取最佳的碱性蛋白酶对碱溶酸沉法制备的黄秋葵籽粕蛋白进行酶解；以水解度和DPPH自由基清除力为指标进行单因素试验，分别考察底物浓度、酶解时间、加酶量、pH值和酶解温度对制备抗氧化活性肽的影响。该文中是以黄秋葵籽为原料制备蛋白，通过对比复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解效果，选出最佳的单一蛋白酶，发明人在实际的应用效果中发现，单一选用某种酶效果并不显著，生物活性肽的得率并不高，并且纯度相对较低。另外，制得的肽产品口感较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种秋葵生物活性肽的生产工艺，用以解决现有技术中秋葵活性肽得率和纯度相对较低以及口感较差的问题。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种秋葵生物活性肽的生产工艺，所述生产工艺包括如下步骤：
(1)秋葵蛋白原料的制备：采用碱提酸沉法，称取黄秋葵籽粕置于烧杯中，按1g∶(8-10)mL的料液比加入去离子水，用1mol/L NaOH溶液调整pH值到11.0，180W超声2.5h提取蛋白，5000r/min离心10min，收集上清液，用1mol/L盐酸调pH值至3.80，离心收集沉淀，沉淀置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干，-20℃储存备用；
(2)将制备的秋葵蛋白原料溶解于蒸馏水中，80℃加热溶胀10min后置于恒温水浴中，加入复合蛋白酶，调节pH值为5-6.5，在温度为50～55℃的条件下水解1.5-3h，然后调节pH值为6.5-8，再加入胰蛋白酶，在36.5-37.5℃的温度下水解2-4h；灭活复合蛋白酶和胰蛋白酶，离心取上清液，得秋葵生物活性肽粗提取液；
(3)秋葵生物活性肽粗提取液中加入相当于粗提取液重量10-20％的吸附剂搅拌均匀，吸附1-3小时，取上清液；
(4)将上清液用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤1000道尔顿的肽的滤液；
(5)浓缩→灭菌→干燥→包装→金属探测→检测→出厂。
优选地，步骤(2)中所述复合蛋白酶由微生物蛋白酶和植物蛋白酶按照重量比为1∶2的比例混合而成；其中，所述微生物蛋白酶由乳酸菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌按照重量比为2∶1∶3的比例混合发酵得到；所述植物蛋白酶为木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶。优选地，所述复合蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的4-6％，所述胰蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的2-4％。
优选地，灭活处理的温度为80-95℃，时间为20-35min。
优选地，步骤(3)所述的吸附剂为氧化铝、活性碳或磷酸钙的一种或几种的混合物，混合物以任意比例混合均可。
优选地，所述浓缩采用的是真空浓缩，干燥采用的是喷雾干燥(温度为80-110℃)或者是真空冷冻干燥。
按照上述秋葵生物活性肽的生产工艺加工的活性肽，不仅抗氧化性高，还具有改善肠道功能的作用。
本发明具有如下优点：
本发明在现有技术的基础上，对其所采用的蛋白质水解酶进一步改进，选择最适合秋葵水解的蛋白质水解酶，其对DPPH自由基的清除率来可以达到66.5％。按照本发明的方法制得的产品口感好，分子量小，经过测定，发现本发明得到的活性肽其分子量小于1000道尔顿的肽含量高于93％，人体更容易吸收，其吸收率能达到90％以上。游离氨基酸含量低，产品纯度高。并且本发明制得的秋葵活性肽具有较高的抗氧化性，还具有改善肠道功能的作用。
并且，经检测，本发明制得的秋葵活性肽含有谷胺甘肽并且富硒，对人体健康十分有益。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1
一种秋葵生物活性肽的生产工艺，所述生产工艺包括如下步骤：
(1)秋葵蛋白原料的制备：采用碱提酸沉法，称取黄秋葵籽粕置于烧杯中，按1g∶8mL的料液比加入去离子水，用1mol/L NaOH溶液调整pH值到11.0，180W超声2.5h提取蛋白，5000r/min离心10min，收集上清液，用1mol/L盐酸调pH值至3.80，离心收集沉淀，沉淀置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干，-20℃储存备用；
(2)将制备的秋葵蛋白原料溶解于蒸馏水中，80℃加热溶胀10min后置于恒温水浴中，加入复合蛋白酶，调节pH值为5，在温度为50℃的条件下水解3h，然后调节pH值为6.5，再加入胰蛋白酶，在36.5-℃的温度下水解4h；灭活复合蛋白酶和胰蛋白酶，灭活处理的温度为80℃，时间为35min，离心取上清液，得秋葵生物活性肽粗提取液；所述复合蛋白酶由微生物蛋白酶和植物蛋白酶按照重量比为1∶2的比例混合而成；其中，所述微生物蛋白酶由乳酸菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌按照重量比为2∶1∶3的比例混合发酵得到；所述植物蛋白酶为木瓜蛋白酶；所述复合蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的4％，所述胰蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的4％；
(3)秋葵生物活性肽粗提取液中加入相当于粗提取液重量10％的吸附剂(吸附剂为氧化铝)搅拌均匀，吸附1-3小时，取上清液；
(4)将上清液用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤1000道尔顿的肽的滤液；
(5)浓缩→灭菌→干燥→包装→金属探测→检测→出厂，其中浓缩采用的是真空浓缩，干燥采用的是喷雾干燥(温度为80-110℃)。
实施例2
一种秋葵生物活性肽的生产工艺，所述生产工艺包括如下步骤：
(1)秋葵蛋白原料的制备：采用碱提酸沉法，称取黄秋葵籽粕置于烧杯中，按1g∶9mL的料液比加入去离子水，用1mol/L NaOH溶液调整pH值到11.0，180W超声2.5h提取蛋白，5000r/min离心10min，收集上清液，用1mol/L盐酸调pH值至3.80，离心收集沉淀，沉淀置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干，-20℃储存备用；
(2)将制备的秋葵蛋白原料溶解于蒸馏水中，80℃加热溶胀10min后置于恒温水浴中，加入复合蛋白酶，调节pH值为6，在温度为55℃的条件下水解2.5h，然后调节pH值为7，再加入胰蛋白酶，在37.0℃的温度下水解3h；灭活复合蛋白酶和胰蛋白酶，灭活处理的温度为85℃，时间为30min，离心取上清液，得秋葵生物活性肽粗提取液；所述复合蛋白酶由微生物蛋白酶和植物蛋白酶按照重量比为1∶2的比例混合而成；其中，所述微生物蛋白酶由乳酸菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌按照重量比为2∶1∶3的比例混合发酵得到；所述植物蛋白酶为菠萝蛋白酶；所述复合蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的5％，所述胰蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的3％；
(3)秋葵生物活性肽粗提取液中加入相当于粗提取液重量15％的吸附剂(活性碳)搅拌均匀，吸附1-3小时，取上清液；
(4)将上清液用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤1000道尔顿的肽的滤液；
(5)浓缩→灭菌→干燥→包装→金属探测→检测→出厂，其中浓缩采用的是真空浓缩，干燥采用的是真空冷冻干燥。
实施例3
一种秋葵生物活性肽的生产工艺，所述生产工艺包括如下步骤：
(1)秋葵蛋白原料的制备：采用碱提酸沉法，称取黄秋葵籽粕置于烧杯中，按1g∶10mL的料液比加入去离子水，用1mol/L NaOH溶液调整pH值到11.0，180W超声2.5h提取蛋白，5000r/min离心10min，收集上清液，用1mol/L盐酸调pH值至3.80，离心收集沉淀，沉淀置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干，-20℃储存备用；
(2)将制备的秋葵蛋白原料溶解于蒸馏水中，80℃加热溶胀10min后置于恒温水浴中，加入复合蛋白酶，调节pH值为6.5，在温度为50℃的条件下水解3h，然后调节pH值为8，再加入胰蛋白酶，在37.5℃的温度下水解4h；灭活复合蛋白酶和胰蛋白酶，灭活处理的温度为95℃，时间为20min，离心取上清液，得秋葵生物活性肽粗提取液；所述复合蛋白酶由微生物蛋白酶和植物蛋白酶按照重量比为1∶2的比例混合而成；其中，所述微生物蛋白酶由乳酸菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌按照重量比为2∶1∶3的比例混合发酵得到；所述植物蛋白酶为木瓜蛋白酶。优选地，所述复合蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的6％，所述胰蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的2％；
(3)秋葵生物活性肽粗提取液中加入相当于粗提取液重量20％的吸附剂(吸附剂为活性碳和磷酸钙的混合物，重量比为1∶1)搅拌均匀，吸附1小时，取上清液；
(4)将上清液用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤1000道尔顿的肽的滤液；
(5)浓缩→灭菌→干燥→包装→金属探测→检测→出厂，其中浓缩采用的是真空浓缩，干燥采用的是喷雾干燥(温度为80-110℃)。
为了进一步说明本发明的有益效果，发明人还进行了如下试验：
一、喷雾干燥温度的选择
120～140℃现有肽的喷雾干燥温度，本发明选用温度为80-110℃，此温度下，制得的活性肽活性更高。
二、抗氧化能力的检测
1、DPPH自由基(二苯代苦味酰基自由基)清除能力的检测方法
DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，溶液颜色为紫色，在517nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH自由基的孤对电子被配对而使其颜色变浅，反应结束后达到稳定；而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈量效关系。若样品能将DPPH自由基清除，则表明样品具有降低羟基自由基、烷基自由基或超氧阴离子自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。因此，可以通过此波长处吸光度的变化来评价样品对DPPH自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力。
将2mL，0.2mM的DPPH乙醇溶液加入到2mL含有不同浓度样品溶液的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517nm处测定吸光值，吸光值越小，表明自由基清除能力越强。2mM BHT(2，6-二叔丁基对甲基苯酚)乙醇溶液作为清除DPPH自由基能力的阳性对照。
清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
A0为2mL，0.2mM的DPPH乙醇溶液和2mL的样品溶剂的反应液的吸光值，作为空白对照；Ai为2mL，0.2mM的DPPH乙醇溶液和2mL的样品的反应液的吸光值；Ai为2mL无水乙醇和2mL的样品的反应液的吸光值。
2、羟基自由基清除能力的检测
羟基自由基是最活泼的自由基之一，因其反应速率极快，它也是对机体造成危害最大的自由基。
分别取10mM FeSO4溶液和10mM EDTA溶液各0.1mL混合于洁净试管中，加入0.2mL，10mM的2-脱氧-D-核糖溶液，然后分别加入2，4，6，8，10mg/mL的乳清蛋白酶解物水溶液各0.2mL，用0.1M，pH7.4磷酸缓冲溶液定容至1.8mL，再加入0.2mL，10mM H2O2溶液。空白样加入蒸馏水0.2mL代替该H2O2溶液。混合后置于37℃恒温水浴中反应1h。加入2.8％(wt)TCA(三氯乙酸)溶液1mL终止反应。然后加入1mL，1％(wt)硫代巴比妥酸(TBA)溶液混匀后，置沸水浴中反应15min，流水迅速冷却。532nm处测定吸光度，计算清除率(P)。
P＝[1-(AS-A0)/(Ac-A0)]×100％
AS样品液的吸光值；AC：相同量的蒸馏水代替样品液，其他处理同上，测定吸光值；A0：相同量的蒸馏水代替样品液，25℃室温反应1h，其它处理同上，测定吸光值。
3、试验1
分别单独选用碱性蛋白酶、复合蛋白酶(微生物蛋白酶和植物蛋白酶按照重量比为1∶2的比例混合而成；其中，所述微生物蛋白酶由乳酸菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌按照重量比为2∶1∶3的比例混合发酵得到；以及与本发明选用的方法(先加入复合蛋白酶，调节pH值为5-6.5，在温度为50～55℃的条件下水解1.5-3h，然后调节pH值为6.5-8，再加入胰蛋白酶，在36.5-37.5℃的温度下水解2-4h)对比。
除了酶解反应的蛋白酶不同，酶解反应的温度和pH值按照各酶的生产厂商要求的最佳值之外，其他操作完全同实施例1中的步骤和条件进行。酶解液如实施例2中经过粗提→吸附→超滤→浓缩→灭菌→干燥等步骤，然后分别溶于蒸馏水中配成2，4，6，8，10％(w/v)的溶液。测量其对DPPH自由基的清除能力，比较不同蛋白酶酶解物的抗氧化活性，结果表明上述几种蛋白酶水解得到的酶解产物的水解度和DPPH自由基清除力均不同，结果见表1。
表1不同蛋白酶对DPPH自由基的清除率(％)
样品浓度(mg/m1) 碱性蛋白酶 复合蛋白酶 本发明
0 0 0 0
2 23.5 25.6 25.8
4 36.8 38.6 40.5
6 47.6 50.3 56.8
8 44.5 53.4 66.5
10 45.1 54.1 67.2
从表1可以看出，从不同酶对DPPH自由基的清除率来讲，本发明>碱性蛋白酶>复合蛋白酶，本发明最高可以达到66.5％，从清除率和用量综合考虑，选择添加浓度为8mg/ml时最合适。
4、试验2
将实施例2中第3步骤中超滤所用的超滤膜不同，分别用截留分子量为10,000Da、5,000Da和1,000Da的超滤膜进行超滤，分别收集分子量小于10,000Da、5,000Da和1,000Da的组分。各组分如实施例1中浓缩、脱盐、干燥，最后溶于蒸馏水中配成5％(w/v)的溶液，用于测定DPPH自由基的清除率，结果见表2。可见活性肽的分子量范围不同，其抗氧化能力相差也很大。由表2中可知本发明所获得的活性肽的抗氧化活性成分主要集中在10,000Da以下。优选的是分子量小于5,000Da的滤过液，更优选的是分子量小于1,000Da的滤过液，其抗氧化活性明显增强。
表2活性肽不同分子量对自由基清除率的影响
Figure BDA0002250928330000111
三、功能验证
将按照实施例1-3的方法制得的成品活性肽产品(每袋10g)，每次一袋，一天两次，早晚各一次，选择肠胃功能差的人进行统计，结果发现，肠胀气者10人均得到明显的改善，便溏者10人中有7人得到明显改善，肠鸣者10人有8人得到明显改善，可见，本发明制得的活性肽能够有效的改善肠道功能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种秋葵生物活性肽的生产工艺，其特征在于，所述生产工艺包括如下步骤：
(1)秋葵蛋白原料的制备：采用碱提酸沉法，称取黄秋葵籽粕置于烧杯中，按1g∶8-10mL的料液比加入去离子水，用1mol/L NaOH溶液调整pH值到11.0，180W超声2.5h提取蛋白，5000r/min离心10min，收集上清液，用1mol/L盐酸调pH值至3.80，离心收集沉淀，沉淀置于-60℃真空冷冻干燥机中冻干，-20℃储存备用；
(2)将制备的秋葵蛋白原料溶解于蒸馏水中，80℃加热溶胀10min后置于恒温水浴中，加入复合蛋白酶，调节pH值为5-6.5，在温度为50～55℃的条件下水解1.5-3h，然后调节pH值为6.5-8，再加入胰蛋白酶，在36.5-37.5℃的温度下水解2-4h；灭活复合蛋白酶和胰蛋白酶，离心取上清液，得秋葵生物活性肽粗提取液；所述复合蛋白酶由微生物蛋白酶和植物蛋白酶按照重量比为1:2的比例混合而成；其中，所述微生物蛋白酶由乳酸菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌按照重量比为2：1：3的比例混合发酵得到；所述植物蛋白酶为木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶；所述复合蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的4-6％，所述胰蛋白酶的添加量为秋葵蛋白原料重量的2-4％；
(3)秋葵生物活性肽粗提取液中加入相当于粗提取液重量10-20％的吸附剂搅拌均匀，吸附1-3小时，取上清液；
(4)将上清液用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤1000道尔顿的肽的滤液；
(5)浓缩→灭菌→干燥→包装→金属探测→检测→出厂。
2.根据权利要求1所述的秋葵生物活性肽的生产工艺，其特征在于，灭活处理的温度为80-95℃，时间为20-35min。
3.根据权利要求1所述的秋葵生物活性肽的生产工艺，其特征在于，步骤(3)所述的吸附剂为氧化铝、活性碳或磷酸钙的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1所述的秋葵生物活性肽的生产工艺，其特征在于，所述浓缩采用的是真空浓缩，干燥采用的是喷雾干燥或者是真空冷冻干燥。
5.根据权利要求4所述的秋葵生物活性肽的生产工艺，其特征在于，喷雾干燥采用的温度为80-110℃。
6.按照权利要求1-5任一项所述的秋葵生物活性肽的生产工艺加工的活性肽，其特征在于，所述活性肽具有改善肠道功能的作用。
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