CN101928742B - 一种具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化活性的乳清蛋白活性肽及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：(1)将蛋白酶加入乳清蛋白溶液中进行酶解，其中酶解温度为40～60℃，pH6.0～8.0；(2)酶解完成后，灭活蛋白酶；(3)将酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液；(4)上清液用截留分子量≤10,000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤10,000道尔顿的肽的滤液；(5)滤液浓缩；(6)浓缩液脱盐；(7)浓缩脱盐后的溶液，然后冷冻干燥。本发明获得的乳清蛋白活性肽具有显著的抗氧化功能特性且功能特性专一，质量稳定，可广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。其生产工艺简单，便于规模化生产，乳清蛋白原料利用率高，生产成本低。

Description

一种具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽及其制备方法

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，特别涉及通过酶解从乳清蛋白中获得具有抗氧化功能活性肽的方法，以及由该方法获得的具有抗氧化功能的活性肽及其应用。

背景技术

牛乳是一种成分复杂的生物流体，其中蛋白质含量为30～35g/L，主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，其中酪蛋白约占80％，乳清蛋白约占20％。牛乳中含有大量不同活性的生物活性肽，这些肽或自然存在于乳中或源于蛋白水解后的产物。乳清蛋白经蛋白酶酶解得到的生物活性肽因具有多种生理功能，如免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抗菌等，是一种多功能营养因子，被广泛的应用于食品和医药等领域。

近年来，陆续发现某些氨基酸、蛋白质和蛋白质酶解物还具有清除自由基的抗氧化的活性。如Jung等人(1995)，Chen等人(1996，1998)研究发现某些氨基酸，如Glu、Met、Tyr、His、Lys、Pro、Cys等具有清除羟基自由基的作用。Satué-Gracia等人(2000)发现乳清蛋白中的乳铁传递蛋白对铁具有亲合力，特别是在富含铁的婴儿食品中能够抑制由铁催化的氧化作用，其认为乳清蛋白的抗氧化活性可能是由于其提供了氢原子还原自由基以及来源于半胱氨酸的游离的巯基基团而抑制了脂类的自动氧化。Rival等人(2001)发现酪蛋白和酪蛋白酶解物具有抑制亚油酸氧化的作用和自由基清除活性。2003年-Ramos和Xiong发现乳清蛋白的promatex酶解物在烤猪肉饼中具有抗氧化效果，其推测可能是通过抑制初期的脂类氧化反应(防止氢过氧化物和共扼二烯烃的形成)，进而延迟了氧化的进程。

自由基是人体生命活动过程中生物化学反应的中间产物。正常情况下，机体内自由基的产生和清除处于一种动态平衡中，不会对机体造成损害。但当自由基和活性氧基团(ROS)的产生过量时，或者随着年龄的增长，机体正常的氧化还原平衡被破坏；脂类，蛋白质和DNA就会发生氧化反应，导致组织细胞结构和功能的破坏并引起机体的损伤衰老，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要因素。研究发现，通过补充抗氧化剂可以清除自由基，提高机体的抗氧化能力，降低机体氧化应激水平。因此，抗氧化的药物或食品得到了广泛的研究和应用。

但是现有的乳源生物活性肽是作为多功能营养因子被生产制备的。通常以蛋白质水解度为衡量标准，而不是以特定的功能特性(如抗氧化活性)为目标来进行制备的，生产工艺中并没有特别的避免抗氧化活性的损失。因此这样所获得的乳源生物活性肽不仅成分复杂，具有特定功能特性的活性肽含量较低，抗氧化活性不强，功能特性不专一，而且还会造成原料的大量浪费，生产成本较高。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的乳清蛋白活性肽存在的抗氧化活性肽含量低，抗氧化活性不强的不足，提供一种具有抗氧化活性的乳清蛋白活性肽及其制备方法，该制备方法特别富集了乳清蛋白活性肽中的抗氧化的成分，避免了抗氧化活性的下降，所得的乳清蛋白活性肽具有良好的抗氧化活性，可以作为抗氧化的功能性产品。

本发明人选用各种蛋白酶来水解乳清蛋白，在制备过程中采用可以保留抗氧化活性的方法，避免导致抗氧化活性降低的操作，终于得到了具有良好抗氧化活性的乳清蛋白活性肽。

因此，本发明解决上述技术问题的技术方案是，一种具有抗氧化活性的乳清蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)将蛋白酶加入乳清蛋白溶液中进行酶解，其中酶解温度为40～60℃，pH6.0～8.0；(2)酶解完成后，灭活蛋白酶；(3)将酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液；(4)上清液用截留分子量≤10,000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤10,000道尔顿的肽的滤液；(5)滤液浓缩；(6)浓缩液脱盐；(7)浓缩脱盐后的溶液，然后冷冻干燥。

根据本发明，步骤(1)是：将蛋白酶加入乳清蛋白溶液中进行酶解，其中酶解温度为40～60℃，pH6.0～8.0。其中，所述的进行酶解的反应可以和本领域常规的一样在酶解反应器中进行。在酶解反应器中，按照常规方法将乳清分离蛋白溶于水中而制得乳清蛋白溶液。乳清蛋白溶液可以是常规的浓度，本发明优选的乳清蛋白溶液浓度为3～10％，所述的百分比为质量体积百分比(w/v)。乳清蛋白作为酶解反应的底物，当底物浓度低于3％时，容易造成酶的浪费；反之，当浓度超过10％时，不利于在酶解过程中的搅拌，从而造成水解不彻底。本发明最优选的乳清蛋白浓度在4％(w/v)。此时，浓度适合，最有利于搅拌，水解反应均衡。配制好的乳清蛋白溶液在酶解之前，较佳的还进行如下预处理：配制好的的乳清蛋白溶液在70～100℃条件下，加热5～20min，然后冷却至40～60℃，调节pH。

所述的蛋白酶可以是现有的酶解乳清蛋白的各种蛋白酶，可以选自胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶，最佳的是木瓜蛋白酶。

所述的蛋白酶和底物即乳清蛋白的质量比同常规，较佳的蛋白酶与乳清蛋白的质量百分比是1～6％。

进行酶解的温度可以是现有的乳清蛋白酶解温度，较佳的是40～60℃，更佳的是45℃。所用的温度范围，主要取决于所用蛋白酶的适用温度范围。温度太高，蛋白酶变性失活；温度太低，则不是蛋白酶的作用范围。

进行酶解的pH值可以是现有的乳清蛋白酶解pH值，较佳的是pH6.0～8.0，更佳的是pH6.5。

进行酶解的时间和现有技术中的一样，稍长或稍短对于本发明的实施或效果不构成实质性的影响，只要是所用的蛋白酶充分反应即可。本领域的技术人员可视具体情况而定。酶解时间较佳的为2～8h，更佳的为4h。

根据本发明，步骤(2)是：酶解完成后，灭活蛋白酶。步骤(2)所述的灭活蛋白酶的方法是常规技术，较佳的是将酶解液升温到90～100℃，保持10～20min。

根据本发明，步骤(3)是：将酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液。步骤(3)是常规技术，是为了去除未水解的乳清蛋白。所述的将酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除的方法较佳的是调节酶解液的pH值为pH6.6～7.2，然后离心，弃沉淀取上清液。所述的离心条件较佳的是5000～10000rpm，15～30min。

根据本发明，步骤(4)是：上清液用截留分子量≤10,000道尔顿(Da)的超滤膜进行超滤，收集分子量≤10,000道尔顿的肽的滤液。其中，所述的截留分子量≤10,000Da的超滤膜较佳的是截留分子量为5,000Da的超滤膜，收集的是分子量≤5,000Da的肽的滤液。分子量大于10,000Da的乳清蛋白活性肽的抗氧化活性很低，介于10,000Da和5,000Da之间的乳清蛋白活性肽的抗氧化活性较高，分子量≤5,000Da的乳清蛋白活性肽的抗氧化活性得到明显提高，是本发明的优选范围。

根据本发明，步骤(5)是：滤液浓缩。由于步骤(4)得到的经过超滤的酶解液滤液体积太大，浓度太小，在进行脱盐之前，通常将酶解液浓缩。步骤(5)所述的滤液浓缩的方法也是常规技术，较佳的是减压浓缩，更佳的是在小于40℃条件下的减压浓缩。在大于40℃下浓缩，可能影响抗氧化活性。浓缩液较佳的也可以在进行冷冻干燥，然后冷冻贮存备用。干燥的方法如本领域常规较佳的是真空冷冻干燥。

根据本发明，步骤(6)是：浓缩液脱盐。步骤(6)所述的浓缩液脱盐的方法也是常规技术，较佳的是采用大孔吸附树脂进行脱盐。所述的大孔吸附树脂是非极性大孔树脂，较佳的是比表面积较大的非极性大孔树脂，最佳的是大孔吸附树脂DA201-C或SP-207。最佳的，采用大孔吸附树脂DA201-C，上样液浓度为5～15mg/mL，洗脱液为50～80％的乙醇，洗脱剂的流速在0.5～2BV/h，洗脱时间大约在1～3h，就将大部分吸附的肽洗脱下来。解吸附率可达71.8％，脱盐率达到98％，利用大孔吸附树脂对蛋白水解液进行动态脱盐处理能达到很好的效果。

根据本发明，步骤(7)是：浓缩脱盐后的溶液，然后冷冻干燥。所述的浓缩的方法较佳的是减压蒸发浓缩。步骤(6)脱盐洗脱下来的溶液，通过减压蒸发等在低温下操作方法得到浓缩液。浓缩液冷冻干燥后得到的的白色或淡黄色粉末即为本发明的乳源抗氧化活性肽。其中，所述的冷冻干燥优选真空冷冻干燥，而不采用喷雾干燥，是为了更好地保持所获得活性肽的抗氧化活性。

本发明还提供上述制备方法获得的具有抗氧化活性的乳清蛋白活性肽。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供一种具有良好的抗氧化活性的乳清蛋白活性肽，具有明显的功能特性且功能特性专一，质量稳定，可广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。该乳清蛋白酶解活性肽的生产方法，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产；生产工艺简单，操作参数容易控制，重复性好；大孔吸附树脂脱盐易于控制，效果好；乳清蛋白原料利用率高，生产成本低。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是本发明的乳清蛋白活性肽清除DPPH自由基和羟基自由基的能力。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。实施例中所用的材料和方法如下：

一、材料和试剂

乳清蛋白：WPI(美国哥伦比亚公司)；

BHT，DPPH·：(Sigma公司)；

蛋白酶(上海宏源生物科技有限公司)；

2-脱氧-D-核糖，Tris Base(Fluka公司进口分装)；

DA201-C，TP-1、HZ-816大孔吸附树脂：江苏苏青水处理工程集团有限公司；

AB-8：上海奇康生物工程公司；

SP-207：上海天呈科技有限公司；

731大孔吸附树脂，NKA-II：南开大学化工厂；

其他试剂均为国产分析纯。

二、检测方法

1、DPPH自由基(二苯代苦味酰基自由基)清除能力的检测方法

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，溶液颜色为紫色，在517nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH自由基的孤对电子被配对而使其颜色变浅，反应结束后达到稳定；而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈量效关系。若样品能将DPPH自由基清除，则表明样品具有降低羟基自由基、烷基自由基或超氧阴离子自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。因此，可以通过此波长处吸光度的变化来评价样品对DPPH自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力。实施例中对DPPH自由基清除能力的检测方法根据文献(Chen HM，Muramoto，K，Yamauchi，et al.Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptidefragments found in the digest of a soybean protein.J Agri.Food Chem.，1998，46：49-53)中的方法进行，具体如下。

将2mL，0.2mM的DPPH乙醇溶液加入到2mL含有不同浓度样品溶液的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517nm处测定吸光值，吸光值越小，表明自由基清除能力越强。2mM BHT(2，6-二叔丁基对甲基苯酚)乙醇溶液作为清除DPPH自由基能力的阳性对照。

清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％

A₀为2mL，0.2mM的DPPH乙醇溶液和2mL的样品溶剂的反应液的吸光值，作为空白对照；A_i为2mL，0.2mM的DPPH乙醇溶液和2mL的样品的反应液的吸光值；A_j为2mL无水乙醇和2mL的样品的反应液的吸光值。

2、羟基自由基清除能力的检测方法

羟基自由基是最活泼的自由基之一，因其反应速率极快，它也是对机体造成危害最大的自由基。实施例中羟基自由基清除能力的检测方法根据文献(陈美珍，余杰，郭慧敏.Study on the scavenging effects of the enzymichydrolysates of soy protein isolates on hydroxyls.Food Sci(食品科学)，2002，23：43～46)中的方法进行，具体如下。

分别取10mM FeSO4溶液和10mM EDTA溶液各0.1mL混合于洁净试管中，加入0.2mL，10mM的2-脱氧-D-核糖溶液，然后分别加入2，4，6，8，10mg/mL的乳清蛋白酶解物水溶液各0.2mL，用0.1M，pH7.4磷酸缓冲溶液定容至1.8mL，再加入0.2mL，10mM H₂O₂溶液。空白样加入蒸馏水0.2mL代替该H₂O₂溶液。混合后置于37℃恒温水浴中反应1h。加入2.8％(wt)TCA(三氯乙酸)溶液1mL终止反应。然后加入1mL，1％(wt)硫代巴比妥酸(TBA)溶液混匀后，置沸水浴中反应15min，流水迅速冷却。532nm处测定吸光度，计算清除率(P)。

P＝[1-(A_S-A₀)/(A_c-A₀)]×100％

A_s样品液的吸光值；A_C：相同量的蒸馏水代替样品液，其他处理同上，测定吸光值；A₀：相同量的蒸馏水代替样品液，25℃室温反应1h，其它处理同上，测定吸光值。

3、大孔树脂的吸附率(A)和解吸附率(W)的计算方法

在250mL具塞锥形瓶中加入1g预先处理好的干树脂，无水乙醇充分溶胀，去离子水洗净无水乙醇；再加入WPI酶解物溶液30mL，放入25℃恒温振荡器中振荡(振荡速度为120次/min)，使树脂与料液充分接触；每小时取样，测定溶液中的蛋白含量。振荡结束后，滤纸过滤，将树脂与溶液分离；计算树脂的吸附率(A)。将吸附乳清蛋白酶解液的树脂，用蒸馏水洗涤后，大孔吸附树脂分别采用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中的蛋白含量，计算解吸附率(W)。

A＝[(C₀-C₁)/C₀]×100％

W＝C₂V₁/[(C₀-C₁)V₀]×100％

吸附率：A；解吸附率：W；C₀：原液蛋白浓度(mg/mL)；V₀：吸附液体积(10mL)；V₁：解吸液体积(30mL)；C₁：吸附液蛋白浓度(mg/mL)；C₂：解吸液蛋白浓度(mg/mL)。

实施例1

1、酶解：

(1)乳清蛋白溶解

将1000mL水加入酶解反应器中，升温至45℃，称取40g乳清蛋白，在磁力搅拌下缓慢加入水中，用2M NaOH调节pH6.5，在45℃的条件下使乳清分离蛋白全部溶解，酶解反应器中乳清蛋白的浓度为4％(w/v)。

(2)酶解反应

按照酶与底物(乳清蛋白)的质量百分比为2.2％的量，加入0.88g木瓜蛋白酶，保持反应温度为45℃，并通过ZDJ-4A自动电位滴定仪滴加2M的NaOH维持酶解液的pH6.5恒定，酶解时间为3.5小时。

2、离心

将酶解液加热至100℃，10min进行灭酶，然后冰浴快速冷却至室温，用2M盐酸调酶解液至pH7.0，有沉淀析出，以10000rpm离心30min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。

3、超滤

将离心后的酶解物上清液用截留分子量为5000Da的超滤膜超滤，收集分子量小于5000Da的组分。将滤过液减压浓缩后，采用LABCONCO真空冻干机真空冷冻干燥。置于-20℃贮存备用。

4、大孔吸附树脂脱盐

用水将冻干的样品溶解，样品浓度为10mg/mL，采用大孔吸附树脂DA201-C进行脱盐。大孔吸附树脂DA201-C用无水乙醇浸泡24h，充分溶胀后，用无水乙醇洗至洗脱液加适量蒸馏水无白色混浊，随后用蒸馏水洗净无水乙醇；接着用5％(wt)盐酸浸泡3h，再用蒸馏水洗净；接着用5％NaOH溶液浸泡3h后，再用蒸馏水洗至中性，过滤、干燥树脂。将1g干燥树脂加入250mL具塞锥形瓶中，无水乙醇充分溶胀，去离子水洗净无水乙醇；再加入10mg/mL的WPI酶解物样品溶液30mL，放入25℃恒温振荡器中振荡(振荡速度为120次/min)，使树脂与料液充分接触。吸附率为32.8％。振荡3h后，以4BV去离子水以2～4BV/h的流速洗涤层析柱后，采用75％的乙醇溶液进行洗脱，流速为1BV/h，收集在1～2h之间的洗脱液。解吸附率为81％。将脱盐前后的样品配成相同浓度分别测定其电导率，脱盐率为94％。

5、浓缩、干燥样品

将上述洗脱液减压浓缩获得浓缩液；将浓缩液采用LABCONCO真空冻干机进行真空冷冻干燥，得到白色粉末样品。然后将样品溶于蒸馏水中配成5％(w/v)的溶液。样品的DPPH自由基清除率为62.7％。同时测得乳清蛋白的DPPH自由基清除率为25.8％。

实施例2

1、酶解：

(1)乳清蛋白溶解

将1000mL水加入酶解反应器中，升温至70℃，称取30g乳清蛋白，在磁力搅拌下缓慢加入水中，加热5min，使乳清分离蛋白全部溶解，然后降温至40℃。用2M NaOH调节pH6.0，酶解反应器中乳清蛋白的浓度为3％(w/v)。

(2)酶解反应

按照酶与底物(乳清蛋白)的质量百分比为1％的量，加入0.3g木瓜蛋白酶，保持反应温度为40℃，并通过ZDJ-4A自动电位滴定仪滴加2M的NaOH维持酶解液的pH6.0恒定，酶解时间为4小时。

2、离心

将酶解液加热至90℃，20min进行灭酶，然后冰浴快速冷却至室温，用2M盐酸调酶解液至pH7.0，有沉淀析出，以5000rpm离心30min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。

3、超滤

将离心后的酶解物上清液用截留分子量为5000Da的超滤膜超滤，收集分子量小于5000Da的组分。将滤过液减压浓缩后，采用LABCONCO真空冻干机真空冷冻干燥。置于-20℃贮存备用。

4、大孔吸附树脂脱盐

如实施例1中进行大孔吸附树脂脱盐，脱盐率为95％。

5、浓缩、干燥样品

将脱盐后的洗脱液减压浓缩得到浓缩液；将浓缩液采用LABCONCO真空冻干机进行真空冷冻干燥，得到白色粉末样品。然后将样品溶于蒸馏水中配成5％(w/v)的溶液。样品的DPPH自由基清除率为58.4％，乳清蛋白的DPPH自由基清除率为28.5％。

实施例3

1、酶解：

(1)乳清蛋白溶解

将1000mL水加入酶解反应器中，升温至100℃，称取100g乳清蛋白，在磁力搅拌下缓慢加入水中，加热20min，使乳清分离蛋白全部溶解，然后降温至60℃。用2M NaOH调节pH8.0，酶解反应器中乳清蛋白的浓度为10％(w/v)。

(2)酶解反应

按照酶与底物(乳清蛋白)的质量百分比为6％的量，加入6g木瓜蛋白酶，保持反应温度为60℃，并通过ZDJ-4A自动电位滴定仪滴加2M的NaOH维持酶解液的pH8.0恒定，酶解时间为4小时。

2、离心

将酶解液加热至95℃，15min进行灭酶，然后冰浴快速冷却至室温，用2M盐酸调酶解液至pH7.0，有沉淀析出，以8000rpm离心20min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。

3、超滤

将离心后的酶解物上清液用截留分子量为5000Da的超滤膜超滤，收集分子量小于5000Da的组分。将滤过液减压浓缩后，采用LABCONCO真空冻干机真空冷冻干燥。置于-20℃贮存备用。

4、大孔吸附树脂脱盐

如实施例1中进行大孔吸附树脂脱盐，脱盐率为92％。

5、浓缩、干燥样品

将脱盐后的洗脱液减压浓缩得到浓缩液；将浓缩液采用LABCONCO真空冻干机进行真空冷冻干燥，得到白色粉末样品。然后将样品溶于蒸馏水中配成5％(w/v)的溶液。样品的DPPH自由基清除率为59.8％。

下面通过试验例来进一步说明本发明的有益效果。

试验实施例1蛋白酶的筛选

选用胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。除了酶解反应的蛋白酶不同，酶解反应的温度和pH值按照各酶的生产厂商要求的最佳值之外，其他操作完全同实施例1中的步骤和条件进行。酶解液如实施例1中经过超滤、脱盐、冻干，然后分别溶于蒸馏水中配成2，4，6，8，10％(w/v)的溶液。测量其对DPPH自由基的清除能力，比较不同蛋白酶酶解物的抗氧化活性，结果见表1。

由表1中可知，四种酶解产物中，木瓜蛋白酶酶解物对DPPH自由基的清除能力最强，胃蛋白酶酶解物对DPPH自由基的清除能力最弱。由表1中还可知不同浓度的WPI酶解物对DPPH自由基都有较强的清除作用，DPPH自由基的清除率随着浓度的增加而增大。

表1.不同蛋白酶WPI酶解物的抗氧化活性

试验实施例2不同分子量范围的WPI酶解物的抗氧化活性

将实施例1中第3步骤中超滤所用的超滤膜不同，分别用截留分子量为10,000Da和5,000Da的超滤膜进行超滤，分别收集分子量小于10,000Da和5,000Da的组分。各组分如实施例1中浓缩、脱盐、干燥，最后溶于蒸馏水中配成5％(w/v)的溶液，用于测定DPPH自由基的清除率，结果见表2。可见乳清蛋白酶解物的分子量范围不同，其抗氧化能力相差也很大。由表2中可知乳清蛋白酶解物的抗氧化活性成分主要集中在10,000Da以下。优选的是分子量小于5,000Da的滤过液，其抗氧化活性明显增强。

表2.不同分子量范围的WPI酶解物的抗氧化活性

试验实施例3WPI酶解物对DPPH·和·OH的清除效果比较

将实施例1制备的WPI酶解物冻干粉溶解于蒸馏水中，配成不同浓度的溶液。测定不同浓度WPI酶解物对DPPH·和·OH的清除能力，结果见图1。

由图1可知，不同浓度乳清蛋白酶解物对DPPH·和·OH均有较强的清除作用，清除率随着酶解物浓度的增加而增大。在整个浓度范围内，蛋白酶酶解物对·OH的清除能力超过对DPPH·的清除能力。这主要是由于乳清蛋白酶解物富含供氢体，具有提供氢质子的能力，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而终止自由基链式反应，起到清除自由基或抑制自由基反应的目的。

Claims (5)

1.一种具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将蛋白酶加入乳清蛋白溶液中进行酶解，其中酶解温度为40～60℃，pH6.0～8.0；(2)酶解完成后，灭活蛋白酶；(3)将酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液；(4)上清液用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集分子量≤5000道尔顿的肽的滤液；(5)滤液浓缩；(6)浓缩液脱盐；(7)浓缩脱盐后的溶液，然后冷冻干燥；其中，步骤(1)所述的蛋白酶选自胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶，所述的蛋白酶和底物即乳清蛋白的质量百分比是1～6％；步骤(1)所述的乳清蛋白溶液浓度为3～10％，所述的百分比为质量体积百分比；步骤(1)所述的乳清蛋白溶液在酶解之前，还进行如下预处理：配制好的乳清蛋白溶液在70～100℃条件下，加热5～20min，然后冷却至40～60℃，调节pH至所用酶的最适pH。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述的滤液浓缩的方法是减压浓缩；步骤(7)所述的浓缩的方法是减压蒸发浓缩，所述的冷冻干燥是真空冷冻干燥。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的灭活蛋白酶的方法是将酶解液升温到90～100℃，保持10～20min；步骤(3)所述的将酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除的方法是调节酶解液的pH值为pH6.6～7.2，然后离心，弃沉淀取上清液，所述的离心条件是5000～10000rpm，15～30min；步骤(6)所述的浓缩液脱盐的方法是采用大孔吸附树脂进行脱盐。

4.一种由权利要求1～3任一项所述的制备方法制得的具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽。

5.如权利要求4所述的具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽在食品、化妆品或制药中的应用。

Images