CN112094880B - 一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,包括以下步骤:取牦牛奶渣粉,按料液比1:3~5g/ml加入蒸馏水,得底物,往底物中加入复合酶,超声破碎,酶解,沸水浴灭酶,离心,取上清液进行冷冻干燥,即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。所得多肽能有效清除超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基,而且具有与铁离子螯合的能力,同时具有很好的过氧化氢清除能力。本发明提供的牦牛奶渣多肽富集抗氧化活性成分,可用于药品制备。此外,本发明不仅响应了国家变废为宝的策略,且方法操作简单,生产成本低,对新型抗氧化保健品和食品添加剂开发与应用具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,涉及生物工程技术领域。
背景技术
奶渣是将牦牛全乳提制酥油后的脱脂乳加热处理后,再加入皱胃酶或酸奶后经过滤、晒干而成。牦牛奶渣质地坚硬呈碎渣状,易于保存,有着丰富的蛋白质、16种氨基酸、钙、铁、维生素、乳糖,脂肪含量低,具有巨大的市场潜力和发展前景,是高原牧民重要的食物蛋白来源之一,在野外放牧生活中十分方便。但目前奶渣的研究及产品开发有限,除自食与送与宾客以外,多用于饲养牲畜,利用价值较低,工业化生产更是少之又少,只有极少数转化为经济来源。
CN110904176A公开了一种北芪菇蛋白源抗氧化肽的制备方法,CN106317170B公开了一种紫苏籽抗氧化肽及其应用,序列为Tyr-Leu(YL)。这些方案中不乏存在具有抗氧化活性的多肽,但来源对象多为肉源蛋白肽和植物源蛋白肽,乳制品类蛋白肽却鲜少。
另一方面,在将牦牛乳制成酥油过程中,不可避免的产生大量奶渣,这些奶渣含有丰富的蛋白质及其他营养物质,目前由于技术的限制,这些奶渣蛋白并没有被充分利用,造成资源的浪费。
发明内容
本发明要解决的技术问题是,克服现有技术的不足,提供一种工艺简单的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是,一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,包括以下步骤:
取牦牛奶渣粉,按料液比1:3~5g/ml加入蒸馏水,得底物,往底物中加入复合酶,均质(均质转速优选10000转/min,时间优选5min),37~38℃水浴酶解2~4h,酶解1~2次,沸水浴10min以上灭酶,离心,取上清液进行冷冻干燥(优选冷冻干燥温度-40℃,干燥48h),即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。
进一步,复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。优选胃蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1︰0.8~1.2。复合酶与底物的质量之比为1:80~120。
胃蛋白酶的效能为1:30000,胰蛋白酶的酶活为大于250USP u/mg。
离心的条件为12000~15000rpm/min离心20~30min。优选12000rpm/min离心20min。
胃蛋白酶、胰蛋白酶是常用的蛋白质降解酶,主要来源于动物。用胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解得到的奶渣多肽,可防止奶渣多肽进入体内被小肠和胃部所吸收,从而达到抗氧化的效果,具有使用安全、量少、酶解效果好等优点,并在肉类、植物类、水产品、乳制品等中得到广泛应用。
本发明方法简单,所得多肽具有较强的抗氧化活性,并且可以将该多肽应用于保健食品和药品的开发与研究。而且本发明的原料是现有技术中不能加以高价值应用的奶渣,资源得到最有效的应用。
所得多肽能有效清除超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基,而且具有与铁离子螯合的能力,同时具有很好的过氧化氢清除能力。本发明提供的牦牛奶渣多肽富集抗氧化活性成分,可用于药品制备。此外,本发明不仅响应了国家变废为宝的策略,且方法操作简单,生产成本低,对新型抗氧化保健品和食品添加剂开发与应用具有重要价值。
附图说明
图1是实施例中所得多肽对DPPH自由基清除活性的作用效果图;
图2是实施例中所得多肽对超氧阴离子自由基清除能力的作用效果图;
图3是实施例中所得多肽对羟基自由基清除能力的作用效果图;
图4是实施例中所得多肽对铁离子还原抗氧化能力的作用效果图;
图5是实施例中所得多肽对过氧化氢清除能力的作用效果图;
N1:来源海拔2800m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽;
N2:来源海拔3500m~4000m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽;
N3:来源海拔4300m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽;
N1非酶解:来源海拔2800m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽;
N2非酶解:来源海拔3500m~4000m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽;
N3非酶解:来源海拔4300m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽。
具体实施方式
在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为详细的理解。为了彻底了解本发明,将在下面描述中提出详细的解构。本发明的较佳实施例详细描述如下。
下面的实施例说明本发明所得多肽对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、铁还原抗氧化能力以及过氧化氢清除能力的作用效果。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例之具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,包括以下步骤:
取牦牛奶渣粉,按料液比1:4g/ml加入蒸馏水,得底物,往底物中加入复合酶,均质5min(均质转速10000转/min),37℃水浴酶解2h,酶解2次,沸水浴10min灭酶,离心,上清液即为奶渣多肽上清液;取上清液进行冷冻干燥(冷冻干燥温度-40℃,干燥48h),即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。
复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。胃蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1︰1。复合酶与底物的质量之比为1:100。
离心的条件为12000rpm/min离心20min。
实施例2
对实施例1中得到的奶渣多肽的抗氧化性进行研究。
DPPH自由基清除作用:用无水乙醇配置浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液,取实施例1所得的奶渣多肽上清液,按表1所示的用量逐个加入DPPH溶液和无水乙醇,混匀后,于室温下避光放置30min后,在518nm处测定吸光度,平行测定3次,按下列公式计算清除率。
表1
超氧阴离子自由基清除作用:用蒸馏水配置50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2),用0.01mol/L的HCl溶液配置0.3mmol/L的邻苯三酚溶液。自氧化速率V0的测定:在试管中加入5ml Tris-HCl缓冲液,25℃恒温水浴中放置20min,再加入0.5ml邻苯三酚溶液,立即混匀倒入比色杯中,在325nm处测定A值,每反应30s记录一组,共反应5min。将记录的数据以时间为横坐标,吸光值为纵坐标,作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V0。
奶渣多肽酶解液清除超氧阴离子速率V1的测定:在试管中加入5ml Tris-HCl缓冲液,加入1ml蒸馏水,1ml奶渣多肽上清液于25℃恒温水浴中放置20min,再加入0.5ml邻苯三酚溶液,立即混匀倒入比色杯中,在325nm处测定A值,每反应30s记录一组,共反应5min。将记录的数据以时间为横坐标,吸光值为纵坐标,做直线回归得到的斜率表示奶渣多肽酶解液清除超氧阴离子的速率V1。清除率计算公式为:
羟基自由基清除作用:用蒸馏水配置pH=7.4、0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液,5mmol/L的邻菲罗啉,7.5mmol/L的硫酸亚铁以及1%的过氧化氢溶液。在试管中分别加入2ml磷酸盐缓冲液,0.3ml邻菲罗啉溶液,充分混匀后,加入0.2ml FeSO4溶液,每加一管后立即混匀。然后向其中加入奶渣多肽上清液,混匀,再加入2ml H2O2,最后补充体积至8ml。另再做损伤管和未损伤管,其中损伤管中加入1ml H2O2,未损伤管不加H2O2,最后补充各管体积至8ml。于37℃下保温1h,测在536nm下的吸光值,计算清除率,其计算公式为:
A0--未损伤管的吸光值;
A1--损伤管的吸光值;
A2--加奶渣多肽上清液的吸光值。
铁离子还原抗氧化能力(FRAP)作用:用蒸馏水配置pH=3.6的醋酸钠缓冲溶液,20mmol/L的三氯化铁,用40mmol/L的HCl溶液配置10mmol/L的TPTZ。将醋酸钠缓冲液、三氯化铁、TPTZ按10:1:1的比例混合制得工作液。取0.5ml 70%乙醇、0.5ml奶渣多肽上清液、9ml工作液混合于37℃下恒温培养10min,得混合液;以缓冲液为空白,测其在593nm下的吸光度值,计算公式为:
式中:
V1:奶渣多肽酶解液(奶渣多肽上清液)总体积,ml;
V2:所测样品(酶解液混合液)体积,ml;
m:奶渣(奶渣指牦牛奶经过打酥油后,残渣干燥后所得的奶渣)质量,g。
过氧化氢清除能力(H2O2)作用:用蒸馏水配制0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4),用缓冲溶液配制4mmol/L过氧化氢溶液、4.5mmol/L苯酚红溶液,用苯酚红溶液配制300ug/ml HRPase得HRPase-苯酚红溶液。取2ml奶渣多肽上清液与800ul过氧化氢溶液混合,室温培养20min,以蒸馏水为对照,再加入1200ul HRPase-苯酚红溶液室温培养10min,用分光光度计在610nm下测吸光度值,计算公式如下:
在本实施例中,对三个不同海拔所得到的奶渣进行酶解与不酶解的上清液的DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟基自由基清除能力、铁离子还原抗氧化能力、过氧化氢清除活性进行测定。结果表示,三个不同海拔的奶渣均有抗氧化能力,经过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解后,具有更强的抗氧化能力,且将奶渣酶解与不酶解之间抗氧化能力存在显著性差异,见图1~图5。
Claims (6)
1.一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
取牦牛奶渣粉,按料液比1:3~5 g/ml加入蒸馏水,得底物,往底物中加入复合酶,均质,37~38℃水浴酶解2~4 h,酶解1~2次,沸水浴10 min以上灭酶,离心,取上清液进行冷冻干燥,即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽;
复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。
2.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,其特征在于,胃蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1︰0.8~1.2。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,其特征在于,复合酶与底物的质量之比为1:80~120。
4.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,其特征在于,胃蛋白酶的效能为1:30000,胰蛋白酶的酶活为大于250 USP u/mg。
5.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,其特征在于,离心的条件为12000~15000 rpm/min离心20~30min。
6.根据权利要求5所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法,其特征在于,12000 rpm/min离心20 min。
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基于生物信息学制备牦牛奶渣蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽的工艺优化;史加加等;《高原农业》;20210815;第5卷(第4期);第402-415页 * |
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