CN112094880B - 一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，包括以下步骤：取牦牛奶渣粉，按料液比1：3～5g/ml加入蒸馏水，得底物，往底物中加入复合酶，超声破碎，酶解，沸水浴灭酶，离心，取上清液进行冷冻干燥，即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。所得多肽能有效清除超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基，而且具有与铁离子螯合的能力，同时具有很好的过氧化氢清除能力。本发明提供的牦牛奶渣多肽富集抗氧化活性成分，可用于药品制备。此外，本发明不仅响应了国家变废为宝的策略，且方法操作简单，生产成本低，对新型抗氧化保健品和食品添加剂开发与应用具有重要价值。

Description

一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，涉及生物工程技术领域。
背景技术
奶渣是将牦牛全乳提制酥油后的脱脂乳加热处理后，再加入皱胃酶或酸奶后经过滤、晒干而成。牦牛奶渣质地坚硬呈碎渣状，易于保存，有着丰富的蛋白质、16种氨基酸、钙、铁、维生素、乳糖，脂肪含量低，具有巨大的市场潜力和发展前景，是高原牧民重要的食物蛋白来源之一，在野外放牧生活中十分方便。但目前奶渣的研究及产品开发有限，除自食与送与宾客以外，多用于饲养牲畜，利用价值较低，工业化生产更是少之又少，只有极少数转化为经济来源。
CN110904176A公开了一种北芪菇蛋白源抗氧化肽的制备方法，CN106317170B公开了一种紫苏籽抗氧化肽及其应用，序列为Tyr-Leu(YL)。这些方案中不乏存在具有抗氧化活性的多肽，但来源对象多为肉源蛋白肽和植物源蛋白肽，乳制品类蛋白肽却鲜少。
另一方面，在将牦牛乳制成酥油过程中，不可避免的产生大量奶渣，这些奶渣含有丰富的蛋白质及其他营养物质，目前由于技术的限制，这些奶渣蛋白并没有被充分利用，造成资源的浪费。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种工艺简单的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，包括以下步骤：
取牦牛奶渣粉，按料液比1：3～5g/ml加入蒸馏水，得底物，往底物中加入复合酶，均质(均质转速优选10000转/min，时间优选5min)，37～38℃水浴酶解2～4h，酶解1～2次，沸水浴10min以上灭酶，离心，取上清液进行冷冻干燥(优选冷冻干燥温度-40℃,干燥48h)，即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。
进一步，复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。优选胃蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1︰0.8～1.2。复合酶与底物的质量之比为1：80～120。
胃蛋白酶的效能为1：30000，胰蛋白酶的酶活为大于250USP u/mg。
离心的条件为12000～15000rpm/min离心20～30min。优选12000rpm/min离心20min。
胃蛋白酶、胰蛋白酶是常用的蛋白质降解酶，主要来源于动物。用胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解得到的奶渣多肽，可防止奶渣多肽进入体内被小肠和胃部所吸收，从而达到抗氧化的效果，具有使用安全、量少、酶解效果好等优点，并在肉类、植物类、水产品、乳制品等中得到广泛应用。
本发明方法简单，所得多肽具有较强的抗氧化活性，并且可以将该多肽应用于保健食品和药品的开发与研究。而且本发明的原料是现有技术中不能加以高价值应用的奶渣，资源得到最有效的应用。
所得多肽能有效清除超氧阴离子、羟基自由基、DPPH自由基，而且具有与铁离子螯合的能力，同时具有很好的过氧化氢清除能力。本发明提供的牦牛奶渣多肽富集抗氧化活性成分，可用于药品制备。此外，本发明不仅响应了国家变废为宝的策略，且方法操作简单，生产成本低，对新型抗氧化保健品和食品添加剂开发与应用具有重要价值。
附图说明
图1是实施例中所得多肽对DPPH自由基清除活性的作用效果图；
图2是实施例中所得多肽对超氧阴离子自由基清除能力的作用效果图；
图3是实施例中所得多肽对羟基自由基清除能力的作用效果图；
图4是实施例中所得多肽对铁离子还原抗氧化能力的作用效果图；
图5是实施例中所得多肽对过氧化氢清除能力的作用效果图；
N1：来源海拔2800m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽；
N2：来源海拔3500m～4000m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽；
N3：来源海拔4300m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽；
N1非酶解：来源海拔2800m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽；
N2非酶解：来源海拔3500m～4000m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽；
N3非酶解：来源海拔4300m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为详细的理解。为了彻底了解本发明，将在下面描述中提出详细的解构。本发明的较佳实施例详细描述如下。
下面的实施例说明本发明所得多肽对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、铁还原抗氧化能力以及过氧化氢清除能力的作用效果。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例之具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，包括以下步骤：
取牦牛奶渣粉，按料液比1：4g/ml加入蒸馏水，得底物，往底物中加入复合酶，均质5min(均质转速10000转/min)，37℃水浴酶解2h，酶解2次，沸水浴10min灭酶，离心，上清液即为奶渣多肽上清液；取上清液进行冷冻干燥(冷冻干燥温度-40℃,干燥48h)，即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。
复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。胃蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1︰1。复合酶与底物的质量之比为1：100。
离心的条件为12000rpm/min离心20min。
实施例2
对实施例1中得到的奶渣多肽的抗氧化性进行研究。
DPPH自由基清除作用：用无水乙醇配置浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液，取实施例1所得的奶渣多肽上清液，按表1所示的用量逐个加入DPPH溶液和无水乙醇，混匀后，于室温下避光放置30min后，在518nm处测定吸光度，平行测定3次，按下列公式计算清除率。
Figure BDA0002657141110000041
表1
Figure BDA0002657141110000042
超氧阴离子自由基清除作用：用蒸馏水配置50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.2)，用0.01mol/L的HCl溶液配置0.3mmol/L的邻苯三酚溶液。自氧化速率V0的测定：在试管中加入5ml Tris-HCl缓冲液，25℃恒温水浴中放置20min，再加入0.5ml邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，在325nm处测定A值，每反应30s记录一组，共反应5min。将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V0。
奶渣多肽酶解液清除超氧阴离子速率V1的测定：在试管中加入5ml Tris-HCl缓冲液，加入1ml蒸馏水，1ml奶渣多肽上清液于25℃恒温水浴中放置20min，再加入0.5ml邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，在325nm处测定A值，每反应30s记录一组，共反应5min。将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，做直线回归得到的斜率表示奶渣多肽酶解液清除超氧阴离子的速率V1。清除率计算公式为：
Figure BDA0002657141110000051
羟基自由基清除作用：用蒸馏水配置pH＝7.4、0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液，5mmol/L的邻菲罗啉，7.5mmol/L的硫酸亚铁以及1％的过氧化氢溶液。在试管中分别加入2ml磷酸盐缓冲液，0.3ml邻菲罗啉溶液，充分混匀后，加入0.2ml FeSO4溶液，每加一管后立即混匀。然后向其中加入奶渣多肽上清液，混匀，再加入2ml H2O2，最后补充体积至8ml。另再做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入1ml H2O2，未损伤管不加H2O2，最后补充各管体积至8ml。于37℃下保温1h，测在536nm下的吸光值，计算清除率，其计算公式为：
Figure BDA0002657141110000052
A0--未损伤管的吸光值；
A1--损伤管的吸光值；
A2--加奶渣多肽上清液的吸光值。
铁离子还原抗氧化能力(FRAP)作用：用蒸馏水配置pH＝3.6的醋酸钠缓冲溶液，20mmol/L的三氯化铁，用40mmol/L的HCl溶液配置10mmol/L的TPTZ。将醋酸钠缓冲液、三氯化铁、TPTZ按10：1：1的比例混合制得工作液。取0.5ml 70％乙醇、0.5ml奶渣多肽上清液、9ml工作液混合于37℃下恒温培养10min，得混合液；以缓冲液为空白，测其在593nm下的吸光度值，计算公式为：
Figure BDA0002657141110000053
式中：
V1：奶渣多肽酶解液(奶渣多肽上清液)总体积，ml；
V2：所测样品(酶解液混合液)体积，ml；
m：奶渣(奶渣指牦牛奶经过打酥油后，残渣干燥后所得的奶渣)质量，g。
过氧化氢清除能力(H2O2)作用：用蒸馏水配制0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)，用缓冲溶液配制4mmol/L过氧化氢溶液、4.5mmol/L苯酚红溶液，用苯酚红溶液配制300ug/ml HRPase得HRPase-苯酚红溶液。取2ml奶渣多肽上清液与800ul过氧化氢溶液混合，室温培养20min，以蒸馏水为对照，再加入1200ul HRPase-苯酚红溶液室温培养10min，用分光光度计在610nm下测吸光度值，计算公式如下：
Figure BDA0002657141110000061
在本实施例中，对三个不同海拔所得到的奶渣进行酶解与不酶解的上清液的DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟基自由基清除能力、铁离子还原抗氧化能力、过氧化氢清除活性进行测定。结果表示，三个不同海拔的奶渣均有抗氧化能力，经过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解后，具有更强的抗氧化能力，且将奶渣酶解与不酶解之间抗氧化能力存在显著性差异，见图1～图5。

Claims (6)

1.一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取牦牛奶渣粉，按料液比1：3～5 g/ml加入蒸馏水，得底物，往底物中加入复合酶，均质，37～38℃水浴酶解2～4 h，酶解1～2次，沸水浴10 min以上灭酶，离心，取上清液进行冷冻干燥，即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽；
复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。
2.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，其特征在于，胃蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1︰0.8～1.2。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，其特征在于，复合酶与底物的质量之比为1：80～120。
4.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，其特征在于，胃蛋白酶的效能为1：30000，胰蛋白酶的酶活为大于250 USP u/mg。
5.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，其特征在于，离心的条件为12000～15000 rpm/min离心20～30min。
6.根据权利要求5所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法，其特征在于，12000 rpm/min离心20 min。
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