CN102093469B - 一种乳源性抗氧化活性肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种乳源性抗氧化活性肽及其组合物。该乳源性抗氧化活性肽的氨基酸序列是组氨酸-异亮氨酸-精氨酸(即His-Ile-Arg)。经体外抗氧化活性实验显示，其具有良好的抗氧化活性，可以应用于食品、化妆品和医药等领域。

Description

一种乳源性抗氧化活性肽及其应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，特别涉及一种乳源性抗氧化活性肽及其组合物。 

背景技术

牛乳是一种成分复杂的生物流体，其中蛋白质含量为30-35g/L，主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，其中酪蛋白约占80％，乳清蛋白约占20％。牛乳蛋白质在营养上是优质的全价蛋白质，蕴藏着多种生物活性肽片段。机体摄入的蛋白质并非全部在肠道内被彻底降解成游离氨基酸才能为人体吸收利用，蛋白质在消化过程中释放出的大量肽类物质，也有可能被机体直接吸收并对人体的生理机能具有特殊的调节作用。某些生物活性肽进入体内后，还可产生类似激素类活性物质的作用。研究人员已从牛乳蛋白的酶解产物中发现了具有免疫调节、降血压、抗血栓、矿物质结合、抗氧化、抗菌和抗病毒等作用的活性肽类物质并鉴定了其结构。 

自由基是人体生命活动过程中生物化学反应的中间产物。正常情况下，机体内自由基的产生和清除处于一种动态平衡状态，不会对机体造成损害。但当自由基和活性氧基团(ROS)的产生过量时，或者随着年龄的增长，机体正常的氧化还原平衡被破坏；脂类，蛋白质和DNA就会发生氧化反应，导致组织细胞结构和功能的破坏并引起机体的损伤衰老，这也是诱发肿瘤等恶性疾病发生的重要因素。 

通常把具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功能的生物活性肽称为抗氧化肽。随着人们对食品安全和合成抗氧化剂安全问题的日益关注，天然抗氧化肽因为具有较强的抗氧化性和高安全性，近年来已成为各国 科研人员研究的热点。然而到目前为止，研究人员能够了解结构并进行相关机理研究的天然抗氧化肽仅仅限于肌肽、谷胱甘肽等少数抗氧化肽，而研究更多的是各种天然蛋白酶解物中具有一定抗氧化性的低分子混和肽。同时由于自由基生命科学的发展，具有抗氧化作用的功能性食品和药物也引起了众多研究人员的关注，肌肽、谷胱甘肽以及大豆肽的抗氧化作用也逐渐显示出它们在医药、食品、饲料等领域应用的优势。 

Satué-Gracia等(2000)发现乳清蛋白中的乳铁传递蛋白对铁具有亲合力，特别是在富含铁的婴儿食品中能够抑制由铁催化的氧化作用。进一步研究发现，乳清蛋白的抗氧化活性可能是由于其提供了氢原子还原自由基以及来源于半胱氨酸的游离的巯基基团抑制了脂类的自动氧化。Rival等(2001)研究发现β-酪蛋白的胰蛋白酶酶解物及胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的酪蛋白酶解物对亚油酸具有抑制活性。其中β-酪蛋白的f(33-48)和f(169-176)片段对亚油酸具有较高的抑制活性，而β-酪蛋白的f(177-183)片段则对酶诱导的亚油酸氧化却几乎没有作用。Rival等(2001)采用3种不同的方法研究了合成肽的氨基酸序列和抗氧化活性之间的关系。结果表明与其结构相似的化合物，如肌肽(β-Ala-His)既有自由基清除活性又有抑制脂氧合酶的能力。Suetsuna，Ukeda和Ochi(2000)从酪蛋白酶解物中分离得到Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu，深入研究发现其C端的二肽Glu-Leu序列对羟基自由基和DPPH自由基清除具有重要影响。Hernández-Ledesma等(2005)研究了由corolase PP水解β-乳球蛋白获得的肽，其中一个序列为Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile的肽，具有比BHA更高的抗氧化活性。 

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的抗氧化肽数量少，抗氧化活性低，抗氧化途径不清的缺陷，提供一种新的抗氧化活性肽。 

本发明人通过木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白，酶解产物经过分离纯化等处理 步骤获得一种肽，发现其具有良好的抗氧化功能，并分析了其氨基酸序列，从而完成了本发明。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种乳源性抗氧化活性肽，其氨基酸序列是组氨酸-异亮氨酸-精氨酸(即His-Ile-Arg)。 

本发明所述的乳源性抗氧化活性肽的制备方法，可以是常规的人工合成方法，即通过全氨基酸序列合成而得。也可以采用基因工程技术，即利用重组的生物工程菌生产而得。或者由乳清蛋白经过蛋白酶水解，从酶解产物中分离而得。 

本发明还提供含有所述的乳源性抗氧化活性肽的组合物，至少包括一种活性成分为所述的乳源性抗氧化活性肽和一种载体，所述的载体可以是药用载体、食用载体和/或者化妆品用载体。所述的乳源性抗氧化活性肽在组合物中的含量可以是0.1～99.9(wt)％。 

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。 

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供了乳源性的抗氧化活性肽，经体外抗氧化活性实验显示具有良好的抗氧化活性，水溶性好，安全性高可以应用于食品、化妆品和医药等领域。本发明方法对于实现乳清蛋白的综合利用和提高其附加值具有重要的意义。 

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。 

图1是乳清蛋白酶解反应物的凝胶层析谱图。其中，1～5表示第1至第5个洗脱峰。 

图2是乳抗氧化肽的半制备型RP-HPLC图谱。其中，1～6表示第1至第6个洗脱峰。 

图3是乳抗氧化肽的分析型RP-HPLC图谱。 

图4是乳抗氧化肽的MALDI-TOF-TOF-MS一级图谱。 

图5是乳抗氧化肽的MALDI-TOF-TOF-MS二级图谱。 

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。 

实施例1酶解乳清蛋白 

1、采用酶反应器进行酶解反应： 

(1)乳清蛋白溶解 

将1000mL蒸馏水加入酶解反应器中，升温至最佳温度45℃，称取40g乳清分离蛋白(美国哥伦比亚公司)，在磁力搅拌下缓慢加入水中，用2MNaOH调节pH6.5，在45℃的条件下使乳清分离蛋白全部溶解，使酶解反应器中乳清分离蛋白的浓度为4％(w/v)。 

(2)酶解 

按照酶量为底物(乳清分离蛋白)的2.2(wt)％的比例(500U/g酶)，加入木瓜蛋白酶，维持反应温度为45℃，并通过ZDJ-4A自动电位滴定仪滴加2M的NaOH维持酶解液的pH6.5恒定，酶解时间为3.5h。 

2、离心 

将酶解液加热至100℃，10min进行灭酶，然后冰浴快速冷却至室温，用2M盐酸调酶解液至pH 7.0，有沉淀析出，以10000rpm离心30min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。 

3、超滤 

将离心后的酶解物上清液用截留分子量为5000Da的超滤膜超滤，收集分子量小于5000Da的组分。将滤过液减压浓缩后，采用LABCONCO冻干机真空冷冻干燥。冻干品置于-20℃贮存备用。 

实施例2凝胶过滤层析 

将实施例1中所得的冻干品用蒸馏水溶解，配制成浓度为10mg/mL的溶液，12,000×g离心15min，上清液用于凝胶过滤色谱(gel filtrationchromatography，GFC)分离。凝胶过滤色谱参数如下：色谱柱为SephadexG-15柱(1.6cm×72cm)，用20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡；检测波长为220nm；进样量为10mL；洗脱液为20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，流速为0.5mL/min；自动分布收集器收集洗脱峰。凝胶层析图谱见图1，从图1可见有5个洗脱峰组分。合并每次收集的相同洗脱峰组分冻干，对所得的每种组分分别进行抗氧化活性测定。 

实施例3DPPH自由基清除能力的检测 

2，2-二苯基-1-苦肼基自由基(2，2-dipheny1-1-picrylhydrazy1，DPPH)分析法是一种筛选自由基清除剂的简便方法。DPPH自由基在有机溶剂中由于苯环的共轭和位阻效应以及硝基的吸电子作用是一种稳定的以氮为中心的自由基，溶液颜色为紫色；其结构中含有3个苯环，其中1个氮原子上有1个孤对电子，在517nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，DPPH自由基的孤对电子被配对而使溶液颜色变浅，反应结束后达到稳定；而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈量效关系。若样品能将DPPH自由基清除，则表明样品具有降低羟基自由基、烷基自由基或超氧阴离子自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。因此，可以通过此波长处吸光度的变化来评价样品对DPPH自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力。 

将2mL 0.2mM的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2mL样品溶液的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517nm处测定吸光值。 

清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％ 

A₀为2mL 0.2mM的DPPH无水乙醇溶液，加2mL的样品溶剂时测得的吸光值，为空白对照； 

A_i为2mL 0.2mM的DPPH无水乙醇溶液，加2mL的样品时测得的吸 光值； 

A_j为2mL无水乙醇，加2mL的样品时测得的吸光值。 

分别将实施例2分布收集的洗脱液P1-P5(第一至第五个峰)组分冻干，用蒸馏水稀释到相同浓度，按照上述方法测定抗氧化活性。P1-P5组分的DPPH自由基清除率分别为29.1％、37.4％、40.6％、53.3％和30.2％。P1-P5均有一定的抗氧化活性，P4＞P3＞P2＞P5＞P1，P1和P2清除率较低，小于分离前的样品峰。P4组分的自由基清除能力最强，抗氧化活性最高，相对于 其它峰抗氧化活性较显著。 

收集抗氧化活性最强的P4组分，经旋转蒸发得到浓缩液，将浓缩液经真空冷冻干燥后得到冻干品。 

实施例4RP-HPLC纯化(反相-高效液相色谱) 

1、半制备型RP-HPLC 

将实施例3制得的抗氧化活性最强的P4组分冻干品用蒸馏水溶解后经高速离心机12,000×g离心15min，再过0.45μm滤膜过滤后，用半制备型RP-HPLC进行纯化。RP-HPLC的分离纯化条件：半制备型柱(μBondapakC₁₈ 19mm×300mm)；流动相：A，5％乙腈，含0.05％三氟乙酸(TFA)；B，80％乙腈，含0.05％TFA；检测波长220nm，流速：1mL/min，进样量：2mL。梯度洗脱程序为0～5min，100％A；5～20min，100％A～40％B；20～30min，40％B～100％B；30～40min，100％B；40～50min，100％B～100％A；50～55min，100％A。所述百分比为体积百分比。 

半制备型RP-HPLC图谱见图2。从图2可见，将待分离的P4组分经半制备型RP-HPLC分离后主要得到6个洗脱峰组分，分别收集并冷冻干燥后测定其抗氧化活性。结果如下：P1(27.5％)，P2(42.5％)，P3(61.3％)，P4(40.8％)，P5(31.7％)，P6(24.5％)。其中第3个洗脱峰组分的抗氧化活性最强P3(61.3％)。从梯度洗脱程序看，在此区域内采用的是降低流动相极性(即降低流动相中水的含量)的线性梯度洗脱。 

2、分析型RP-HPLC 

将半制备型RP-HPLC分离得到抗氧化活性最强的第3个洗脱峰组分收集冻干；继续用分析型RP-HPLC分离。RP-HPLC的分离纯化条件：分析型柱(μBondapak C₁₈ 3.9mm×300mm)；流动相：A，5％乙腈，含0.05％三氟乙酸(TFA)；B，80％乙腈，含0.05％TFA；检测波长220nm，流速：1mL/min，进样量：2mL。梯度洗脱程序为0～5min，100％A；5～20min，100％A～40％B；20～30min，40％B～100％B；30～40min，100％B；40～50min，100％B～100％A；50～55min，100％A。所述百分比为体积百分比。 

分析型RP-HPLC图谱见图3。从图3可见，获得了单一的1个洗脱峰组分。 

实施例5结构鉴定 

(1)质谱分析：将实施例4分析型RP-HPLC纯化后的洗脱峰组分采用MALDI-TOF-TOF-MS进行结构鉴定。质谱分析参数如下：激光源：波长355nm：YAG激光器，加速电压20kV，质量扫描范围：m/z 100～800。质谱仪的分析软件采用4700Explorer TM Software。 

MALDI-TOF-TOF-MS的一级图谱见图4，二级图谱见图5。由图4，5中可以看出，质谱图中大部分出现的是b和y系列碎片，这验证了肽链中酰胺键较容易断裂的推断，其中丰度较强的主要离子峰都可以从结构上进行解释。此外，碱性氨基酸对肽键断裂也有特殊的作用，它们的质子亲和能较高，具有使质子在肽链或碎片上定位的倾向。如果精氨酸在肽链的N端，碎裂中倾向于产生N端离子，精氨酸在C端则倾向于产生C端离子。由于木瓜蛋白酶水解作用的专一性较强，只断裂赖氨酸或精氨酸羧基末端参与形成的肽键，精氨酸应在肽链的C末端。因此，质谱图中应是y系列的离子(图4)。经过软件分析并标注(图5)，可以看出在此区域内显示H(His)、I(Ile)、R(Arg)3种氨基酸的多个相关特征离子峰，其中分别标注为H、I和R的3个峰所对应的是这3种氨基酸的亚氨正离子的质荷比。由于L(Leu)与I(Ile)的相关特征离子峰是完全相同的。因此，图5中的离子峰可能是I。在得到肽段的氨 基酸残基种类的信息之后，运用De Novo Explorer分析软件对这几种氨基酸排列的顺序进行分析。经过分析，我们认为这个抗氧化肽的氨基酸序列为HI(L)R，分子质量为425.28Da。由于软件无法区分L(Leu)与I(Ile)。因此，必须结合氨基酸组成分析的结果进一步确定，这样才能最后确定该抗氧化肽氨基酸的种类和数量。 

(2)氨基酸序列分析 

将实施例4分析型RP-HPLC纯化后的组分用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析。结果表明：该抗氧化肽主要由组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)和精氨酸(Arg，R)组成，相对摩尔比例为1∶1∶1，相对分子质量为425.28Da。 

综上所述，本发明根据质谱分析和氨基酸组成分析结果两方面确证分离得到的乳抗氧化肽的氨基酸序列为HIR(His-Ile-Arg)。 

Claims (1)

1.氨基酸序列是组氨酸-异亮氨酸-精氨酸的小肽作为抗氧化活性肽的、非治疗目的的应用。