CN112961212B - 一类ace抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明提供了一类ACE抑制肽，其氨基酸序列分别为：Leu‑Phe‑Arg‑Ala‑Phe（LFRAF）、Leu‑Phe‑Arg‑Ala‑Arg（LFRAR）、Leu‑Phe‑Arg‑Ala‑Val（LFRAV）、Leu‑Phe‑Arg‑Tyr‑Phe（LFRYF）、Leu‑Phe‑Arg‑Asn‑Phe（LFRNF）、Leu‑Phe‑Arg‑Glu‑Phe（LFREF）、Ala‑Phe‑Arg‑Ala‑Phe（AFRAF）、Met‑Phe‑Arg‑Ala‑Phe（MFRAF）、Val‑Phe‑Arg‑Ala‑Phe（VFRAF）。本发明ACE抑制肽具有强的ACE抑制活性，分子量小，制备成本低，工艺简单，易于工业化生产，同时通过长期食用可以预防、缓解以及辅助治疗高血压，在食品、医药、保健品等领域具有广阔的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明属于生物小分子活性肽技术领域，具体涉及一类ACE抑制肽及其制备方法和应用。
背景技术
高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，是冠心病、中风、心力衰竭的主要发病因素。血管紧张素转化酶（ACE）对血压起着重要的调节作用。临床上高血压患者大多数使用合成ACE抑制剂（如卡托普利）控制血压的升高，这类药物虽然疗效显著，但往往会产生味觉功能紊乱和血压过度偏低等副作用。从天然食物中分离的ACE抑制肽，虽然降压效果没有合成药物明显，但具有对正常血压无影响、没有毒副作用等优势。
芝麻（Sesamum indicum L.），又称胡麻、脂麻、油麻，是世界上重要的油料作物之一。目前，我国芝麻主要用于生产芝麻油，制油后会产生大量芝麻饼粕，芝麻饼粕中主要成分为蛋白质。然而芝麻饼粕大部分直接作为饲料、肥料使用，附加值低，造成了蛋白质资源的浪费。高温芝麻饼粕多是在100℃以上温度高压压榨制油后产生，或是160-200℃高温焙烤生香制取芝麻油后产生的副产物。由于经过高温处理，芝麻饼粕中芝麻蛋白发生严重变性，影响其后续加工利用。为了充分利用资源，扩大芝麻蛋白的应用范围，对高温芝麻饼粕进行一定处理进而制备活性肽具有重要意义，为芝麻饼粕深加工提供新途径，实现芝麻加工副产物的高效增值。
目前，常见的水解方式有酶解、化学降解。然而酶解法存在转化率低、水解速率低、效率低等局限性，且蛋白酶的价格昂贵，长时间酶解还会导致微生物污染。化学降解会使用化学试剂，降低蛋白质量。亚临界水是指温度在沸点（100 ℃）以上临界温度（374 ℃）以下仍保持为液体状态的水，又称为高温水、高温液态水、超加热水等。亚临界水技术具有设备操作简单、成本低、提取率高等优点，又具有良好的渗透与溶解能力，已经成为提取分离领域的研究热点。传统的亚临界水技术采用的温度在200 ℃以上，所需能耗高。因此利用低温亚临界水处理高温芝麻饼粕中的蛋白以期制备活性肽具有研究价值。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题、现状及发展前景，提供一类ACE抑制肽；该ACE抑制肽分子量小、抑制活性高、副作用小、易于分离纯化，且制备工艺简单，在食品、医药、保健品等领域具有广阔的应用开发前景。
本发明还提供了上述ACE抑制肽的制备方法和应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供了一类ACE抑制肽，所述ACE抑制肽的氨基酸序列为：aFRbc，其中，a为L、A、M或V；b为A、Y、N或E；c为F、R或V。该肽为五肽，具有强的ACE抑制活性。
进一步优选的，所述ACE抑制肽的氨基酸序列为Leu-Phe-Arg-Ala-Phe（LFRAF）及其衍生序列Leu-Phe-Arg-Ala-Arg（LFRAR）、Leu-Phe-Arg-Ala-Val（LFRAV）、Leu-Phe-Arg-Tyr-Phe（LFRYF）、Leu-Phe-Arg-Asn-Phe（LFRNF）、Leu-Phe-Arg-Glu-Phe（LFREF）、Ala-Phe-Arg-Ala-Phe（AFRAF）、Met-Phe-Arg-Ala-Phe（MFRAF）、Val-Phe-Arg-Ala-Phe（VFRAF）等。
上述ACE抑制肽的制备方法，其可以通过人工化学合成的方法制备，如采用化学固相合成法按照本领域常规技术人工合成多肽。
进一步优选的，当所述ACE抑制肽为LFRAF时，其可以从芝麻饼粕中提取获得，包括提取高温芝麻饼粕中原料蛋白、低温亚临界水水解、分离纯化等步骤，具体如下：
1）提取芝麻原料蛋白：将芝麻饼粕粉碎、脱脂，加蒸馏水混匀，用碱调节pH为10-12，搅拌50-70min后离心、取上清液，然后加酸将pH调至4-5，静置、离心，收集所得蛋白沉淀物并冷冻干燥，即为芝麻原料蛋白；
2）低温亚临界水水解：将步骤1）所得原料蛋白按料液比1g：20-100 mL加蒸馏水混匀获得蛋白溶液，调节pH为2-6，然后转移至反应釜中于100-150 ℃反应30-90 min，反应结束后冷却至室温，将pH调至中性后离心、取上清液，备用；
3）分离纯化：将步骤2）所得上清液进行超滤，然后将透过液采用NGC色谱系统分离，收集并筛选出高活性的洗脱峰对应的组分，即收集保留时间在5.23-5.47min的组分，浓缩后于-60℃冷冻干燥即得。使用Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱鉴定，鉴定到该活性肽的氨基酸序列为：Leu-Phe-Arg-Ala-Phe（LFRAF）。
进一步优选的，步骤2）中转移至反应釜中于105-125 ℃反应40-80 min。
具体的，步骤1）和2）中，离心速度为4500-5000 r/min，离心时间为20-25 min。
具体的，步骤3）中，超滤选用3kDa的超滤膜进行。
进一步优选的，步骤3）中，NGC色谱系统分离的条件为：流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈，流动相B为含0.1%三氟乙酸的超纯水；流动相A由45%变化至50%，以梯度洗脱的方式洗脱50min，流速设置为7.5 mL/min；检测波长为220nm，色谱柱为Shim-pack GIS C18制备柱。
本发明还提供了上述ACE抑制肽在制备预防或治疗高血压药物中的应用。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明提供的活性肽分子量小，成本低，制备工艺简单，易于分离纯化，适合工业化生产；
2）本发明提供的多个小分子肽都具有强的ACE抑制活性，且副作用小，同时通过长期食用可以预防、缓解以及辅助治疗高血压，可用于开发治疗高血压的相关保健品或者药物，在食品、保健品、医药等许多领域有广阔的市场前景；
3）本发明部分ACE抑制肽选用来源广泛的芝麻饼粕为原料，合理利用芝麻粕中的蛋白资源，对保护环境、促进社会经济的可持续发展有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中芝麻多肽样液NGC色谱系统分离色谱图；
图2 为实施例1提取所得芝麻多肽样品在Nano-LC-ESI-MS/MS中的二级质谱图；
图3为实施例2中人工合成活性肽LFRAR的HPLC图；
图4为实施例2中人工合成活性肽LFRAR的质谱图；
图5为实施例2中人工合成活性肽LFRAV的HPLC图；
图6为实施例2中人工合成活性肽LFRAV的质谱图；
图7为实施例2中人工合成活性肽LFRYF的HPLC图；
图8为实施例2中人工合成活性肽LFRYF的质谱图；
图9为实施例2中人工合成活性肽LFRNF的HPLC图；
图10为实施例2中人工合成活性肽LFRNF的质谱图；
图11为实施例2中人工合成活性肽LFREF的HPLC图；
图12为实施例2中人工合成活性肽LFREF的质谱图；
图13为实施例2中人工合成活性肽AFRAF的HPLC图；
图14为实施例2中人工合成活性肽AFRAF的质谱图；
图15为实施例2中人工合成活性肽MFRAF的HPLC图；
图16为实施例2中人工合成活性肽MFRAF的质谱图；
图17为实施例2中人工合成活性肽VFRAF的HPLC图；
图18为实施例2中人工合成活性肽VFRAF的质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明不局限于具体实施例。
实施例1
一种从高温芝麻饼粕中制备ACE抑制肽LFRAF的方法，其具体包括如下步骤：
1）芝麻原料蛋白提取：
将高温芝麻饼粕粉碎，采用索氏抽提器进行脱脂，选用溶剂为石油醚，萃取温度为80℃，脱脂6h。将脱脂后的高温芝麻饼粕与蒸馏水按1 g：20mL的料液比混合均匀，然后用6mol/L NaOH调节pH为11.0，室温搅拌60 min，在4℃条件下以5000 r/min离心20 min，收集上清液后用6 mol/L HCl将pH调至4.3，静置20min后离心，收集蛋白沉淀物，冷冻干燥并于4℃储存，即得芝麻原料蛋白；
2）低温亚临界水水解：
将步骤1）所得芝麻原料蛋白按料液比1 g：50mL加蒸馏水混匀获得蛋白溶液，并用6 mol/L HCl将溶液pH调至2，然后转移至高温高压反应釜中反应，温度设置为125 ℃，反应60 min后冷却至室温，将反应液调至中性后在4℃条件下以5000 r/min离心20 min，取上清液备用。
3）分离纯化：
将步骤2）所得上清液用截留分子量3 kDa的超滤膜进行超滤，然后将透过液采用NGC色谱系统进一步分离，色谱条件如下：流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈，流动相B为含0.1%三氟乙酸的超纯水； 0-50 min，45-50%A；流速7.5 mL/min，检测波长为220nm，色谱柱为Shim-pack GIS C18制备柱，内径250mm，柱长20cm，粒度10μm。使用收集器收集并筛选高ACE抑制活性洗脱峰对应的组分，即收集保留时间在5.23-5.47 min的组分（见图1，图中主要有5个洗脱峰，其中峰1的保留时间在5.23-5.47 min），浓缩后于-60℃冷冻干燥。将收集到的多肽样品使用Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱鉴定（见图2），鉴定到活性肽的序列为：Leu-Phe-Arg-Ala-Phe（LFRAF）。
实施例2
一种人工合成ACE抑制肽的方法，其采用本领域常规的固相合成法人工合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上了；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的多肽。该方法合成的五肽Leu-Phe-Arg-Ala-Phe（LFRAF）、Leu-Phe-Arg-Ala-Arg（LFRAR）、Leu-Phe-Arg-Ala-Val（LFRAV）、Leu-Phe-Arg-Tyr-Phe（LFRYF）、Leu-Phe-Arg-Asn-Phe（LFRNF）、Leu-Phe-Arg-Glu-Phe（LFREF）、Ala-Phe-Arg-Ala-Phe（AFRAF）、Met-Phe-Arg-Ala-Phe（MFRAF）、Val-Phe-Arg-Ala-Phe（VFRAF），其液相与质谱分析图见图3-18。所得高纯度合成肽的主要离子峰质荷比符合需要合成序列的分子量，说明固相合成成功。
上述采用固相合成法合成芝麻多肽的具体过程参见：①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年。），该芝麻多肽也可以委托相应的多肽生物公司进行合成，因其化学合成过程不是本申请的重点所在，故本申请此处不再对化学合成过程进行详细赘述。
抑制活性应用试验
ACE抑制活性的测定试验按照以下方法进行：
将多肽样品用蒸馏水溶解至适当浓度获得样液，用96孔板作为反应容器。将15μL样液（不添加多肽样品的反应液以蒸馏水代替）与30μL底物溶液混合，底物为4.66mmol/L马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL）的氯化钠磷酸缓冲液，然后加入30μL浓度 12.5mU/mL ACE酶液，于37℃水浴反应30min。反应结束后加入125μL 1.2 mol/L NaOH终止酶反应，接着加入30μL含2%邻苯二甲醛（OPA）的甲醇溶液，混合均匀后静置20min，加入40μL 6 mol/L HCl溶液终止衍生反应。对照液中以蒸馏水代替。将反应溶液稀释10倍后使用荧光光谱仪测定荧光吸收强度，测定条件为：激发波长340nm，发射波长455nm，狭缝宽度5nm。测定不同浓度下样品的ACE抑制率，以样品浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标，得到抑制率为50%时的样品浓度即为半数抑制浓度(IC50)，具体通过SPSS 13.0软件回归分析可计算得到。抑制剂即多肽样品在某一浓度下的ACE抑制率的计算公式如下：
ACE抑制率(%) = [1- (a-c)/(b-d)] × 100
式中：a为抑制剂与ACE都存在时的荧光吸收强度；b为抑制剂不存在而ACE存在时的荧光吸收强度；c为抑制剂存在而ACE不存在时的荧光吸收强度；d为抑制剂与ACE都不存在时的荧光吸收强度。
以ACE抑制活性的IC50值为指标进行多肽的ACE抑制活性应用试验，测试分析实施例1从芝麻蛋白中提取的芝麻活性肽LFRAF和实施例2采用人工合成的衍生多肽LFRAF、LFRAR、LFRAV、LFRYF、LFRNF、LFREF、AFRAF、MFRAF、VFRAF的ACE抑制活性，具体结果见下表1。
表1 实施例1和2所得五肽的ACE抑制活性结果
由表1可知：本发明实施例1及2合成所得多肽均具有强的ACE抑制活性，长期食用可达到预防、缓解、控制以及辅助治疗高血压的目的，可用于开发治疗高血压的保健品或药物。
综上可以看出：本发明ACE抑制肽不仅可以通过低温亚临界水水解、分离纯化获得，同时可以通过化学固相合成的方法进行人工合成。本发明通过测定ACE抑制活性发现：五肽LFRAF及其衍生多肽均具有强的ACE抑制活性，且分子量小，制备工艺简单，成本低，易于工业化生产，同时通过长期食用可以达到预防、缓解以及辅助治疗高血压的目的，在食品、医药、保健品等领域具有广阔的应用开发前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。凡依本发明申请专利范围所做的均等改变与修饰，都应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一类ACE抑制肽，其特征在于，所述ACE抑制肽的氨基酸序列为LFRAF、LFRAR、LFRAV、LFRYF、LFRNF、LFREF、AFRAF、MFRAF或VFRAF。
2.权利要求1所述ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，采用化学固相合成法人工合成。
3.权利要求1所述ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，当所述ACE抑制肽为LFRAF时，经下述步骤制备获得：
1）提取芝麻原料蛋白：将芝麻饼粕粉碎、脱脂，加蒸馏水混匀，用碱调节pH为10-12，搅拌50-70min后离心、取上清液，然后加酸将pH调至4-5，静置、离心，收集所得蛋白沉淀物并冷冻干燥，即为芝麻原料蛋白；
2）低温亚临界水水解：将步骤1）所得原料蛋白按料液比1g：20-100 mL加蒸馏水混匀获得蛋白溶液，调节pH为2-6，然后转移至反应釜中于100-150 ℃反应30-90 min，反应结束后冷却至室温，将pH调至中性后离心、取上清液，备用；
3）分离纯化：将步骤2）所得上清液进行超滤，然后将透过液采用NGC色谱系统分离，收集保留时间在5.23-5.47min的组分，浓缩后冷冻干燥即得。
4.如权利要求3所述ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤2）中转移至反应釜中于105-125 ℃反应40-80 min。
5.如权利要求3所述ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤1）和2）中，离心速度为4500-5000 r/min，离心时间为20-25 min。
6.如权利要求3所述ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤3）中，超滤选用3 kDa的超滤膜进行。
7.如权利要求3至6任一所述ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，步骤3）中，NGC色谱系统分离的条件为：流动相A为含0.1%三氟乙酸的乙腈，流动相B为含0.1%三氟乙酸的超纯水；流动相A由45%变化至50%，以梯度洗脱的方式洗脱50min，流速设置为7.5 mL/min；检测波长为220nm，色谱柱为Shim-pack GIS C18制备柱。
8.权利要求1所述ACE抑制肽在制备预防或治疗高血压药物中的应用。
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