CN117567562A - 南极磷虾ace抑制肽及其制备方法和应用 - Google Patents

南极磷虾ace抑制肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了南极磷虾ACE抑制肽及其制备方法和应用，属于生物活性肽技术领域。本发明利用脱脂南极磷虾粉制备南极磷虾ACE抑制肽，所获得的多肽具有优异的ACE抑制活性。通过质谱鉴定，共筛选得到了13种小分子多肽，且这13种多肽具有不同程度的ACE抑制活性。本发明制备获得的南极磷虾ACE抑制肽，其ACE抑制能力是目前已确认的南极磷虾ACE抑制肽的几十倍甚至上百倍，具有优异的ACE抑制效果。南极磷虾ACE抑制肽能够应用于食品、保健品、药品等领域。本发明对南极磷虾蛋白资源进行高值精准利用，能够有效提高资源利用率和产业价值，同时也为预防和治疗高血压提供新途径和新方法。

Description

南极磷虾ACE抑制肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及南极磷虾ACE抑制肽及其制备方法和应用。
背景技术
高血压是近年来影响我国居民健康的常见慢性疾病之一，其以动脉血压持续升高为主要临床特征，是导致冠心病、脑卒中、心力衰竭等心脑血管疾病的重要危险因素。在未使用降压药的情况下，非同日3次测量上肢血压，收缩压≥140mmHg或舒张压≥90mmHg，即考虑为高血压。
血管紧张素转化酶(Angiotensin-I converting enzyme，ACE，EC 3.2.1.41)在调节血压平衡中发挥重要作用，其通过将血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ(血管收缩剂)、使具有舒张血管作用的缓激肽失活、促进醛固酮分泌而引起血压升高，通过抑制ACE活性可以达到治疗高血压的效果。目前临床使用的降血压药物如卡托普利和依那普利等化学合成的ACE抑制剂具有明显治疗效果，但长期服用易引发肾脏损害、血管水肿、高血钾症等不良反应，寻找天然来源且安全可靠的ACE抑制剂显得尤为迫切。
生物活性肽具有多种生理学功能，可分为抗氧化肽、免疫活性肽、降压肽、降尿酸肽、抗菌肽等。与化学合成ACE抑制剂相比，食源性多肽类ACE抑制剂具有安全性高、易吸收、副作用小等优势，能够为预防和治疗高血压提供新的途径。
南极磷虾(Euphausia superβa)资源储量丰富，大力发展南极磷虾产业是打造我国第二个远洋渔业的重要选择。南极磷虾蛋白含量可达到干重的65％，富含人体所需的多种必需氨基酸，是极具开发价值的海洋优质蛋白。然而，产业目前针对南极磷虾的高值化利用仍集中于南极磷虾油等脂质类产品的开发，对其蛋白资源的利用明显不足。脱脂南极磷虾粉是南极磷虾粉经加工提取南极磷虾油后的副产物，具有高蛋白低脂肪的特点，是制备生物活性肽的良好原料，但目前通常作为养殖饲料进行低值化使用或直接被丢弃，造成资源浪费。科学利用脱脂南极磷虾粉中的优质蛋白质，开发多肽类ACE抑制剂，可为南极磷虾蛋白类功能制品和食源性多肽类降压药物的研制提供重要支撑。
发明内容
本发明的目的之一是提供南极磷虾ACE抑制肽及其制备方法，另一目的是提供其应用，以弥补现有技术的不足。
为达到以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种南极磷虾ACE抑制肽，该ACE抑制肽包括：GlGIF、或APGR、或VKGVF、或LFAGA、或LGGIF、或FGAGGL、或LSGAY、或FGGAL、或WLDAN、或RDWPEGR、或DWPEGR、或YLGGAL、或LGGLNQ其中的一种。
其中，GLGIF具体序列为SEQ No.1：Gly-Leu-Gly-Ile-Phe；
APGR具体序列为SEQ No.2：Ala-Pro-Gly-Arg；
VKGVF具体序列为SEQ No.3：Val-Lys-Gly-Val-Phe；
LFAGA具体序列为SEQ No.4：Leu-Phe-Ala-Gly-Ala；
LGGIF具体序列为SEQ No.5：Leu-Gly-Gly-Ile-Phe；
FGAGGL具体序列为SEQ No.6：Phe-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu；
LSGAY具体序列为SEQ No.7：Leu-Ser-Gly-Ala-Tyr；
FGGAL具体序列为SEQ No.8：Phe-Gly-Gly-Ala-Leu；
WLDAN具体序列为SEQ No.9：Trp-Leu-Asp-Ala-Asn；
RDWPEGR具体序列为SEQ No.10：Arg-Asp-Trp-Pro-Glu-Gly-Arg；
DWPEGR具体序列为SEQ No.11：Asp-Trp-Pro-Glu-Gly-Arg；
YLGGAL具体序列为SEQ No.12：Tyr-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu；
LGGLNQ具体序列为SEQ No.13：Leu-Gly-Gly-Leu-Asn-Gln。
优选的，一种南极磷虾ACE抑制肽，该ACE抑制肽包括：GLGIF、或APGR、或VKGVF、或LFAGA或LGGIF。
一种南极磷虾ACE抑制肽的制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理；
(2)酶解；
(3)高温灭酶；
(4)固液分离得到南极磷虾酶解上清液；
(5)将所述步骤(4)所得的南极磷虾酶解上清液进行脱盐处理，处理液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到南极磷虾酶解冻干粉，即南极磷虾ACE抑制肽混合物1；
(6)对所述步骤(5)所得的南极磷虾ACE抑制肽混合物1，使用去离子水复溶后进行纯化，选用超滤法，收集截留液，经喷雾干燥或冷冻干燥即得初步纯化后的南极磷虾ACE抑制肽混合物2；
(7)对所述步骤(6)所得的南极磷虾ACE抑制肽混合物2，使用去离子水复溶后进行再次纯化，选用凝胶过滤层析法，收集层析分离组分，经喷雾干燥或冷冻干燥即得南极磷虾ACE抑制肽混合物3；
(8)经液质联用技术对所述步骤(7)所得的南极磷虾ACE抑制肽混合物3进行鉴定，最终得到所述的13种南极磷虾ACE抑制肽。
作为优选的，所述步骤(1)中将脱脂南极磷虾粉按照料液比1:4～1:8g/mL加入缓冲液并混匀，通过湿法超微粉碎法使脱脂南极磷虾粉充分粉碎，粉碎时间1～10min；优选料液比1:6，粉碎时间2min。
作为优选的，所述步骤(2)进行酶解，调节缓冲液pH 2.0～12.0，根据底物质量加入200～8000U/g的蛋白酶启动酶解反应，酶解时间为1～6h，酶解温度为25～75℃；所述蛋白酶选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或多种；优选碱性蛋白酶，添加量4000U/g，酶解pH 7.5，酶解时间3.5h，酶解温度55℃。
作为优选的，所述步骤(3)中的灭酶温度为90～100℃，灭酶时间为10～20min；优选灭酶温度100℃，灭酶时间20min。
作为优选的，所述步骤(4)中的离心速度为3000～8000r/min，离心时间10～30min；优选离心速度为7500r/min，离心时间20min。
作为优选的，所述步骤(5)中的脱盐方法为：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200Da的纳滤膜进行脱盐，处理压力0.6～1.4MPa，循环处理1～5次；优选处理压力1.2MPa，循环处理3次。
作为优选的，所述步骤(6)中的超滤条件为：将南极磷虾ACE抑制肽混合物1使用去离子水复溶至质量浓度0.5～10g/L的溶液，采用截留分子量为1KDa或3KDa或5KDa的超滤膜进行超滤处理，处理压力0.5～1.5MPa，处理量0.5～10L/h；优选溶液质量浓度5g/L，超滤膜截留分子量为1KDa，处理压力1.0MPa，处理量3L/h。
作为优选的，所述步骤(7)中的凝胶过滤层析条件为：将南极磷虾ACE抑制肽混合物2使用去离子水复溶至质量浓度10～100mg/mL的溶液，采用AKTA蛋白分离纯化系统经葡聚糖凝胶Sephadex G-15进行纯化，上样量1～10mL，洗脱液为去离子水，洗脱流速为0.2～1.0mL/min；优选溶液质量浓度30mg/mL，上样量5mL，洗脱流速为0.5mL/min。
所述南极磷虾ACE抑制肽在制备抑制血管紧张素转化酶(ACE)制品中的应用；所述制品包括保健品、药品等。
所述南极磷虾ACE抑制肽在制备降血压功效制品中的应用；所述制品包括食品、保健品、药品等。
本发明的优点和有益效果：
本发明利用脱脂南极磷虾粉制备南极磷虾ACE抑制肽，所获得的多肽具有优异的ACE抑制活性。通过质谱鉴定，共筛选得到了13种小分子多肽：GLGIF、APGR、VKGVF、LFAGA、LGGIF、FGAGGL、LSGAY、FGGAL、WLDAN、RDWPEGR、DWPEGR、YLGGAL和LGGLNQ。这13种多肽具有不同程度的ACE抑制活性。
本发明制备获得的南极磷虾ACE抑制肽，其ACE抑制能力是目前已确认的南极磷虾ACE抑制肽的几十倍甚至上百倍，具有优异的ACE抑制效果。南极磷虾ACE抑制肽能够应用于食品、保健品、药品等领域。本发明对南极磷虾蛋白资源进行高值精准利用，能够有效提高资源利用率和产业价值，同时也为预防和治疗高血压提供新途径和新方法。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1实施例12凝胶过滤层析分离图谱。
图2实施例13中南极磷虾ACE抑制肽的液质总离子流图。
图3氨基酸序列为GLGIF的ACE抑制肽二级质谱图。
图4氨基酸序列为APGR的ACE抑制肽二级质谱图。
图5氨基酸序列为VKGVF的ACE抑制肽二级质谱图。
图6氨基酸序列为LFAGA的ACE抑制肽二级质谱图。
图7氨基酸序列为LGGIF的ACE抑制肽二级质谱图。
图8氨基酸序列为FGAGGL的ACE抑制肽二级质谱图。
图9氨基酸序列为LSGAY的ACE抑制肽二级质谱图。
图10氨基酸序列为FGGAL的ACE抑制肽二级质谱图。
图11氨基酸序列为WLDAN的ACE抑制肽二级质谱图。
图12氨基酸序列为RDWPEGR的ACE抑制肽二级质谱图。
图13氨基酸序列为DWPEGR的ACE抑制肽二级质谱图。
图14氨基酸序列为YLGGAL的ACE抑制肽二级质谱图。
图15氨基酸序列为LGGLNQ的ACE抑制肽二级质谱图。
图16南极磷虾ACE抑制肽制备工艺流程图。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，此处所描述的具体实例仅以解释本发明，并不仅限于此。
以下各实施例中，测定各样品的ACE抑制率的实验方法如下：
(1)溶液配制
0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.3，含0.3mol/L氯化钠)：称取1.730g硼酸，加热溶解后定容至100mL备用；称取1.907g硼砂(Na2B4O7·10H2O)加热溶解后定容至100mL备用；量取32.5mL上述硼酸溶液和17.5mL上述硼砂溶液，混匀，调节pH至8.3，再加入1.753g氯化钠，定容至100mL即可。
0.125U/mL ACE酶溶液：取0.5U ACE酶，用去离子水定容至4mL。
0.25mmol/L N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰基]-L-苯丙酰胺-甘氨酸-甘氨酸溶液(FAPGG)：称取5.0mg FAPGG粉末，用上述0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.3，含0.3mol/L氯化钠)溶解并定容至50mL。
(2)实验方法
移取550μL样品溶液，加入275μL上述FAPGG溶液，混匀，然后加入275μL上述ACE酶溶液，混匀后立即测定340nm下吸光值，然后于37℃孵育30min，反应结束后再次测定340nm处吸光值；以去离子水代替样品溶液做对照。
(3)计算公式
ACE抑制活性计算公式如下：
式中：A1表示样品组初始吸光值；A2表示样品组反应30min时吸光值；A3表示对照组初始吸光值；A4表示对照组反应30min时吸光值。
实施例1：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：适量脱脂南极磷虾粉，按照料液比1:6加入磷酸缓冲液，湿法超微粉碎2min；
(2)酶解：调节pH至7.5，加入碱性蛋白酶启动酶解反应，酶的添加量4000U/g，酶解温度55℃，酶解3.5h；
(3)高温灭酶：酶解反应结束后，酶解液于100℃沸水浴加热灭酶20min；
(4)固液分离：7500r/min离心20min，得到南极磷虾酶解上清液；
(5)脱盐：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200Da的纳滤膜进行脱盐处理，处理压力1.2MPa，循环处理3次，得到南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例2：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：适量脱脂南极磷虾粉，按照料液比1:6加入磷酸缓冲液，湿法超微粉碎2min；
(2)酶解：调节pH至8.0，加入胰蛋白酶启动酶解反应，酶的添加量4000U/g，酶解温度37℃，酶解3.5h；
(3)高温灭酶：酶解反应结束后，酶解液于100℃沸水浴加热灭酶20min；
(4)固液分离：7500r/min离心20min，得到南极磷虾酶解上清液；
(5)脱盐：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200Da的纳滤膜进行脱盐处理，处理压力1.2MPa，循环处理3次，得到南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例3：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：适量脱脂南极磷虾粉，按照料液比1:6加入磷酸缓冲液，湿法超微粉碎2min；
(2)酶解：调节pH至2.5，加入胃蛋白酶启动酶解反应，酶的添加量4000U/g，酶解温度40℃，酶解3.5h；
(3)高温灭酶：酶解反应结束后，酶解液于100℃沸水浴加热灭酶20min；
(4)固液分离：7500r/min离心20min，得到南极磷虾酶解上清液；
(5)脱盐：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200Da的纳滤膜进行脱盐处理，处理压力1.2MPa，循环处理3次，得到南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例4：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：适量脱脂南极磷虾粉，按照料液比1:6加入磷酸缓冲液，湿法超微粉碎2min；
(2)酶解：调节pH至7.0，加入中性蛋白酶启动酶解反应，酶的添加量4000U/g，酶解温度45℃，酶解3.5h；
(3)高温灭酶：酶解反应结束后，酶解液于100℃沸水浴加热灭酶20min；
(4)固液分离：7500r/min离心20min，得到南极磷虾酶解上清液；
(5)脱盐：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200Da的纳滤膜进行脱盐处理，处理压力1.2MPa，循环处理3次，得到南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例5：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：适量脱脂南极磷虾粉，按照料液比1:6加入磷酸缓冲液，湿法超微粉碎2min；
(2)酶解：调节pH至7.0，加入风味蛋白酶启动酶解反应，酶的添加量4000U/g，酶解温度50℃，酶解3.5h；
(3)高温灭酶：酶解反应结束后，酶解液于100℃沸水浴加热灭酶20min；
(4)固液分离：7500r/min离心20min，得到南极磷虾酶解上清液；
(5)脱盐：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200Da的纳滤膜进行脱盐处理，处理压力1.2MPa，循环处理3次，得到南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例6：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：适量脱脂南极磷虾粉，按照料液比1:6加入磷酸缓冲液，湿法超微粉碎2min；
(2)酶解：调节pH至6.5，加入木瓜蛋白酶启动酶解反应，酶的添加量4000U/g，酶解温度55℃，酶解3.5h；
(3)高温灭酶：酶解反应结束后，酶解液于100℃沸水浴加热灭酶20min；
(4)固液分离：7500r/min离心20min，得到南极磷虾酶解上清液；
(5)脱盐：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200Da的纳滤膜进行脱盐处理，处理压力1.2MPa，循环处理3次，得到南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例7：
本发明采用分光光度计法测定实施例1～6中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物的活性，结果如表1所示。测定结果表明，实施例1中采用碱性蛋白酶酶解得到的产物，其ACE抑制活性显著高于实施例2～6中采用其他条件得到的酶解产物；使用碱性蛋白酶酶解脱脂南极磷虾粉更有利于制备获得高活性的南极磷虾ACE抑制肽。
本发明方法制备的南极磷虾ACE抑制肽，具备优异的活性效果，可作为预防和治疗高血压的普通健康食品、保健食品或药物原料，有效的提高了脱脂南极磷虾粉的利用率和附加值，并且使用蛋白酶酶解的方法得到活性肽粉，经济环保，安全性高，应用前景良好。
表1实施例1～6中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物的ACE抑制率
实施例8：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法是对实施例1中南极磷虾ACE抑制肽混合物继续进行纯化，包括以下步骤：
(1)将实施例1中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物使用去离子水复溶至质量浓度5g/L的溶液；
(2)采用截留分子量为1KDa的超滤膜对南极磷虾ACE抑制肽混合物溶液进行超滤处理，处理压力1.0MPa，处理量3L/h，分别得到小于1KDa和大于1KDa的截留液，收集小于1KDa的截留液，经喷雾干燥或冷冻干燥即得初步纯化后的南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例9：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法是对实施例1中南极磷虾ACE抑制肽混合物继续进行纯化，包括以下步骤：
(1)将实施例1中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物使用去离子水复溶至质量浓度5g/L的溶液；
(2)采用截留分子量为3KDa的超滤膜对南极磷虾ACE抑制肽混合物溶液进行超滤处理，处理压力1.0MPa，处理量3L/h，分别得到小于3KDa和大于3KDa的截留液，收集小于3KDa的截留液，经喷雾干燥或冷冻干燥即得初步纯化后的南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例10：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法是对实施例1中南极磷虾ACE抑制肽混合物继续进行纯化，包括以下步骤：
(1)将实施例1中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物使用去离子水复溶至质量浓度5g/L的溶液；
(2)采用截留分子量为5KDa的超滤膜对南极磷虾ACE抑制肽混合物溶液进行超滤处理，处理压力1.0MPa，处理量3L/h，分别得到小于5KDa和大于5KDa的截留液，收集小于5KDa的截留液，经喷雾干燥或冷冻干燥即得初步纯化后的南极磷虾ACE抑制肽混合物。
实施例11：
本发明采用分光光度计法测定实施例1和实施例8、9、10中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物的活性，结果如表2所示。测定结果表明，实施例8中先采用碱性蛋白酶酶解、进一步采用截留分子量为1KDa的超滤膜进行超滤纯化而得到的产物，其ACE抑制活性显著高于实施例1和实施例9、10中得到的产物；使用碱性蛋白酶酶解脱脂南极磷虾粉，并对酶解产物超滤分离纯化得到相对分子质量小于1KDa的组分，更有利于制备获得高活性的南极磷虾ACE抑制肽。
本发明方法制备的南极磷虾ACE抑制肽，具备优异的活性效果，可作为预防和治疗高血压的普通健康食品、保健食品或药物原料，有效的提高了脱脂南极磷虾粉的利用率和附加值，并且使用蛋白酶酶解的方法得到活性肽粉，经济环保，安全性高，应用前景良好。
表2实施例1、8、9、10中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物的ACE抑制率
实施例12：
南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，该制备方法是对实施例8中南极磷虾ACE抑制肽混合物继续进行纯化，包括以下步骤：
(1)将实施例8中得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物使用去离子水复溶至质量浓度30mg/mL的溶液；
(2)将南极磷虾ACE抑制肽混合物溶液上样5mL至AKTA蛋白分离纯化系统，经葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析分离纯化，洗脱液为去离子水，洗脱流速为0.5mL/min，分别得到A、B、C、D四个组分(图1)；采用分光光度计法测定组分A、B、C、D的活性，结果如表3所示，收集目标高ACE抑制活性组分C，经喷雾干燥或冷冻干燥即得南极磷虾ACE抑制肽混合物。
表3实施例8和实施例12中凝胶过滤层析分离得到的各组分的ACE抑制率
测定结果表明，实施例12中先采用碱性蛋白酶酶解、再采用超滤处理分离回收相对分子质量小于1KDa的组分、进一步地采用葡聚糖凝胶Sephadex G-15层析分离得到的产物C，其ACE抑制活性显著高于实施例8中得到的产物；使用碱性蛋白酶酶解脱脂南极磷虾粉，并对酶解产物依次进行超滤和凝胶过滤层析纯化，更有利于制备获得高活性的南极磷虾ACE抑制肽。
实施例13：
采用液质联用技术鉴定南极磷虾ACE抑制肽，包括以下步骤：
(1)样品前处理：实施例12得到的南极磷虾ACE抑制肽使用Waters SEP-PAK C18固相取小柱进行脱盐处理，真空冷冻干燥后采用0.1％(v/v)甲酸溶液复溶，经0.45μm微孔滤膜过滤后进行检测。
(2)仪器检测条件：样品进样到C18毛细管捕获柱(100μm×20mm，5μm，Dr.MaischGmbH)后经过C18分离柱(75μm×150mm，3μm，Dr.Maisch GmbH)进行梯度分离；流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为80％(v/v)的乙腈溶液(含0.1％甲酸)；色谱柱以92％的流动相A充分平衡后进行梯度洗脱，0min A与B体积比92:8，98min A与B体积比为76:28，113min A与B体积比为63:37，117min A与B体积比为0:100，120min A与B体积比为0:100，125min A与B体积比为92:8，130min洗脱程序结束；流速为300nL/min；进样量1μL；检测模式：正离子模式。
多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(Full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)；扫描范围：400～1800m/z；一级分辨率：60000@m/z200，二级分辨率：150000@m/z200；碰撞能CE28eV。
(3)利用软件Proteome Discoverer 2.5对Uniprot蛋白质数据库进行检索分析，参数设置见表4，最后得到多肽鉴定结果。
表4Proteome Discoverer分析参数设置
南极磷虾ACE抑制肽的液质总离子流图如图2所示。质谱数据检索后采用FDR≤0.01为可信蛋白序列的筛选标准，共计鉴定得到733条肽段和65条蛋白序列，其中，高可信度肽段序列13条，具体为：GLGIF、APGR、VKGVF、LFAGA、LGGIF、FGAGGL、LSGAY、FGGAL、WLDAN、RDWPEGR、DWPEGR、YLGGAL和LGGLNQ；该13条肽链的二级质谱图如图3-图15所示。
实施例14：
将实施例13中得到的13条多肽进行固相合成及活性验证，包括以下步骤：
(1)肽段GLGIF、APGR、VKGVF、LFAGA、LGGIF、FGAGGL、LSGAY、FGGAL、WLDAN、RDWPEGR、DWPEGR、YLGGAL和LGGLNQ均由南京杰肽生物科技有限公司采用Fmoc固相合成方法合成。
(2)将合成多肽配制成质量浓度0.035～0.1mg/mL的溶液，采用分光光度计法测定合成多肽的体外ACE抑制活性，结果如表5所示。测定结果表明，多肽GLGIF、APGR、VKGVF、LFAGA和LGGIF在0.1mg/mL或更低浓度0.04mg/mL或0.035mg/mL下具有更高的ACE抑制活性。
表5实施例14中13条多肽的肽段信息和ACE抑制率
进一步地，对以上GLGIF、APGR、VKGVF、LFAGA和LGGIF等5条多肽配制成质量浓度为0.01～1mg/mL的溶液，采用分光光度计法测定不同浓度下合成多肽的体外ACE抑制率，计算其IC50值，结果如表6所示。测定结果表明，GLGIF、APGR、VKGVF、LFAGA和LGGIF等5条多肽均具有优异的ACE抑制活性，其中氨基酸序列为GLGIF的肽段表现出最高的ACE抑制效果。值得注意的是，实施例1中制备得到的南极磷虾ACE抑制肽混合物，其IC50值为0.336mg/mL，即经本发明制备得到的多肽，ACE抑制活性可提高28倍，技术提升效果明显，产物应用前景良好。
表6实施例14中5条多肽的肽段信息与ACE抑制活性IC50值
肽段 分子量(Da) IC50(mg/mL)
GLGIF 505.60 0.012
APGR 399.43 0.020
VKGVF 548.67 0.060
LFAGA 477.53 0.073
LGGIF 505.60 0.106
上述实施例1-14的整体制备方法流程如图16所示。
实施例15：
实施例1～14中得到的南极磷虾ACE抑制肽的应用，具体包括：
实施例1～14中得到的南极磷虾ACE抑制肽，可应用于预防和治疗高血压的普通健康食品、保健食品、药品等领域，产品制剂可采用固体饮料、胶囊、压片糖果、凝胶糖果、液体饮品等形式。
以上所述实施例仅为本发明较佳的实施方式，并不构成对权利要求范围的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种南极磷虾ACE抑制肽，其特征在于，该ACE抑制肽包括：GLGIF、或APGR、或VKGVF、或LFAGA、或LGGIF、或FGAGGL、或LSGAY、或FGGAL、或WLDAN、或RDWPEGR、或DWPEGR、或YLGGAL、或LGGLNQ；
GLGIF具体序列为SEQ No.1：Gly-Leu-Gly-Ile-Phe；
APGR具体序列为SEQ No.2：Ala-Pro-Gly-Arg；
VKGVF具体序列为SEQ No.3：Val-Lys-Gly-Val-Phe；
LFAGA具体序列为SEQ No.4：Leu-Phe-Ala-Gly-Ala；
LGGIF具体序列为SEQ No.5：Leu-Gly-Gly-Ile-Phe；
FGAGGL具体序列为SEQ No.6：Phe-Gly-Ala-Gly-Gly-Leu；
LSGAY具体序列为SEQ No.7：Leu-Ser-Gly-Ala-Tyr；
FGGAL具体序列为SEQ No.8：Phe-Gly-Gly-Ala-Leu；
WLDAN具体序列为SEQ No.9：Trp-Leu-Asp-Ala-Asn；
RDWPEGR具体序列为SEQ No.10：Arg-Asp-Trp-Pro-Glu-Gly-Arg；
DWPEGR具体序列为SEQ No.11：Asp-Trp-Pro-Glu-Gly-Arg；
YLGGAL具体序列为SEQ No.12：Tyr-Leu-Gly-Gly-Ala-Leu；
LGGLNQ具体序列为SEQ No.13：Leu-Gly-Gly-Leu-Asn-Gln。
2.一种南极磷虾ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）原料预处理；
（2）酶解；
（3）高温灭酶；
（4）固液分离得到南极磷虾酶解上清液；
（5）将所述步骤（4）所得的南极磷虾酶解上清液进行脱盐处理，处理液经喷雾干燥或冷冻干燥，得到南极磷虾酶解冻干粉，即南极磷虾ACE抑制肽混合物1；
（6）对所述步骤（5）所得的南极磷虾ACE抑制肽混合物1，使用去离子水复溶后进行纯化，选用超滤法，收集截留液，经喷雾干燥或冷冻干燥即得初步纯化后的南极磷虾ACE抑制肽混合物2；
（7）对所述步骤（6）所得的南极磷虾ACE抑制肽混合物2，使用去离子水复溶后进行再次纯化，选用凝胶过滤层析法，收集层析分离组分，经喷雾干燥或冷冻干燥即得南极磷虾ACE抑制肽混合物3；
（8）经液质联用技术对所述步骤（7）所得的南极磷虾ACE抑制肽混合物3进行鉴定，最终得到13种南极磷虾ACE抑制肽。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中将脱脂南极磷虾粉按照料液比1:4~1:8 g/mL加入缓冲液并混匀，通过湿法超微粉碎法使脱脂南极磷虾粉充分粉碎，粉碎时间1~10 min。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）进行酶解，调节缓冲液pH2.0~12.0，根据底物质量加入200~8000 U/g的蛋白酶启动酶解反应，酶解时间为1~6 h，酶解温度为25~75℃；所述蛋白酶选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或多种混合。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶选择碱性蛋白酶，添加量4000 U/g，酶解pH 7.5，酶解时间3.5 h，酶解温度55℃。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的脱盐方法为：将南极磷虾酶解上清液使用截留分子量为200 Da的纳滤膜进行脱盐，处理压力0.6~1.4 MPa，循环处理1~5次。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中的超滤条件为：将南极磷虾ACE抑制肽混合物1使用去离子水复溶至质量浓度0.5~10 g/L的溶液，采用截留分子量为1 KDa或3 KDa或5 KDa的超滤膜进行超滤处理，处理压力0.5~1.5 MPa，处理量0.5~10 L/h。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中的凝胶过滤层析条件为：将南极磷虾ACE抑制肽混合物2使用去离子水复溶至质量浓度10~100 mg/mL的溶液，采用AKTA蛋白分离纯化系统经葡聚糖凝胶Sephadex G-15进行纯化，上样量1~10 mL，洗脱液为去离子水，洗脱流速为0.2~1.0 mL/min。
9.南极磷虾ACE抑制肽GLGIF、或APGR、或VKGVF、或LFAGA、或LGGIF、或FGAGGL、或LSGAY、或FGGAL、或WLDAN、或RDWPEGR、或DWPEGR、或YLGGAL、或LGGLNQ在制备抑制血管紧张素转化酶ACE制品中的应用；所述制品包括食品、保健品、药品。
10.南极磷虾ACE抑制肽GLGIF、或APGR、或VKGVF、或LFAGA、或LGGIF、或FGAGGL、或LSGAY、或FGGAL、或WLDAN、或RDWPEGR、或DWPEGR、或YLGGAL、或LGGLNQ在制备降血压功效制品中的应用；所述制品包括食品、保健品、药品。
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