CN101143891A - 鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：(1)将鱼精多肽溶解在双蒸水中，取上清液；(2)上清液上样、收集组分、冻干得冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和分离纯化；(3)分离纯化、洗脱，然后以线形梯度为0－0.35M NaCl的20mM，pH8.3 Tris－HCl缓冲液洗脱，收集冻干；(4)冻干粉溶解、脱盐柱处理，收集冻干；(5)最高活性组分通过分离柱分离纯化，用含0.1％三氟乙酸的3％乙腈洗脱，在280nm下检测，收集冻干；(6)最高活性组分通过反相柱分离、洗脱，收集冻干，用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。其可明显清除羟自由基活性，而且有效降低MRC－5胞内自由基的含量，从而保护细胞避免氧化损伤。

Description

鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺

技术领域

本发明涉及一种鱼精多肽成分的分离纯化工艺，特别涉及一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺。

背景技术

鱼精蛋白(Protamine)也称精蛋白，是一种碱性蛋白质，主要存在于鱼类(鲑鱼、鲱鱼、鳟鱼)的成熟精子细胞中。其分子量较小，一般在10KDa左右。人们已将它作为天然防腐剂应用于食品保鲜和储藏。同时，鱼精蛋白是目前体外循环心脏手术中唯一用于拮抗肝素的药物，对其作用机理和手术中的不良反应都有大量的报道。另外，发现鱼精蛋白对肿瘤血管的形成有抑制作用，通过阻止毛细血管内皮细胞的移动从而影响血管形成；也能抑制血管炎症的发生。

紫外线，离子辐射，化学反应等过程产生的活性氧自由基能引起一系列的病理反应，如DNA损伤，癌变和细胞降解等。在需氧生物体内，自由基的产生不可避免。其中超氧阴离子自由基和羟自由基是两种最具代表性的自由基。它们很不稳定，能与体内的各种物质发生反应，从而导致细胞或组织损伤和死亡。抗氧化剂具有清除自由基和延缓脂质过氧化反应的发生。另外，抗氧化剂也能通过保护脂质成分的氧化降解来保留食物的质量。因此，寻找抗氧化剂，特别是食物来源的天然氧化剂具有非常重要的意义。

近些年来，来源于食物蛋白酶解产物的生物活性肽受到越来越多的关注。目前许多来自食物蛋白酶解产物的自然活性肽具有抗氧化作用。Chen等人发现大豆多肽能有效延缓脂质过氧化反应，且这些多肽的一级结构与它们的活性间有重要的联系。Li等人从猪胶原酶解产物中获得了具有抗氧化和自由基清除活性的多肽序列。另外，人们从鱼业加工副产品中提取获得很多具有抗氧化活性的多肽，如黄鳍金枪鱼鱼皮明胶酶解产物，黄鳍金枪鱼骨架蛋白酶解产物，阿拉斯加雪鱼鱼皮明胶酶解产物以及cod frame蛋白酶解产物。鱼精是一种主要由鱼精蛋白和DNA组成的混合物，在渔业加工过程中一般作为副产物而丢弃。其中鱼精蛋白是一种阳离子多肽，在医学中可用作注射用胰岛素的载体，肝素拮抗剂等。近来，鱼精蛋白经常被用作食品的抗菌成分。随着经济的发展和资源的不断匮乏，鱼精蛋白和鱼精蛋白酶解产物受到越来越多的重视。

由于鱼精蛋白(Protamine)来源于鱼白--这种渔业加工过程中通常被抛弃的副产物，被胰酶酶解后形成鱼精多肽(Protamine hydrolysate)。目前，对于酶解形成的多肽及其多肽产品，其中大多有效成分不明确，作用机理不清楚，包括其特定的生物学功能、水解后各种多肽片断的分子量和氨基酸残基数等。相关的研究报道都非常少。因此，如何深入研究其机理并提供一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，用以开发新品适应市场需求，充分利用天然资源造福于人类，是该领域科研技术人员不断研究开发的新课题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种工艺简便，提纯效果显著的鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺。

为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：

一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：

(1)取鱼精多肽，即鱼精蛋白酶解产物0.25-0.5g溶解在5-10ml双蒸水中，10000rpm离心8-10min，取上清液；

(2)上清液上样到Sephadex G-35柱26×450mm，双蒸水以0.6ml/min流速洗柱；在254nm下监测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，视收集样品和出峰时间的时间差，且根据出峰时间再延期3-6秒收集；收集完成后，各收集管中样品合并，立即放在-80℃冷冻保存；-80℃下的样品迅速放入也预冷的冷冻干燥器中，冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(3)将最高抗氧化活性的组分收集、冻干，过程与步骤(2)相同，进一步利用Macro-Prep High Q柱16×150mm分离纯化，柱子先用20mMTris-HCl缓冲液pH8.3、以0.8ml/min流速，预处理1h；上样后，柱子用20mMTris-HCl缓冲液pH8.3以0.8ml/min流速洗脱30min，然后以线形梯度为0-0.35M NaCl的Tris-HCl缓冲液20mM，pH8.3洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；每个组分根据洗脱峰被收集、冷冻干燥；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(4)冻干粉溶解成较高浓度，用5ml注射器上样，然后用5ml Hi-Trap脱盐柱处理，在254nm检测，根据洗脱峰收集，收集冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(5)最高羟自由基清除活性的多肽组分通过具有二级管阵列(PDA)Waters 2695 HPLC系统进一步分离纯化，分离柱为10×250mm、C4的反相柱YMC-Pack PROTEIN-RP；用含0.1％三氟乙酸的3％乙腈洗脱，在280nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(6)活性组分被收集浓缩，最高活性组分进一步通过3.9×150mm的反相分离柱Symmetry Shield^TM RP18分离，用含0.1％三氟乙酸的线形梯度5-15％乙腈以0.8ml/min速度洗脱，在254nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。

本发明的有益效果是：经研究，鱼精多肽(Protamine hydrolysate)是鱼精蛋白由酶水解作用后形成的多肽片段，其氨基酸组成的最大特点就是碱性氨基酸占有较大比例，因此其碱性很强，可溶于水和稀酸，热稳定性较好。同时还具有低抗原性和免疫原性等特点。鱼精多肽不仅具有鱼精蛋白中和肝素等作用，还具有很高的营养价值和多种生理功能，易消化吸收，在抗氧化、抗疲劳、性功能都有明显作用。

鲑鱼或鲱鱼、鳟鱼等鱼精多肽不仅在体外具有较强的羟自由基、DPPH和超氧阴离子清除活性，而且也能明显提高Wistar大鼠的抗疲劳和抗氧化能力。通过凝胶色谱、离子交换色谱和反相HPLC等色谱分离方法，我们最终获得了一系列抗氧化性的多肽组分。根据液质联用和NCBI数据库搜寻，具有最高抗氧化活性的多肽被鉴定为Pro-Arg，处于鱼精蛋白序列中1-2和16-17残基部位。这个合成的新二肽不仅具有强的清除羟自由基活性，而且能明显降低胞内氧自由基(ROS)的产生，从而保护人二倍体成纤维细胞免受氧化损伤。通过体内体外抗氧化模型，筛选活性多肽有效组分或成分，揭示其作用机理。

其目的意义在于：

(1)为开发新产品打下坚实的基础，为开发一系列新的多肽产品提供思路和方法，同时为研究和开发多肽的新功效作用提供数据；

(2)通过其作用机理的研究，不仅在研究理论角度揭示了活性多肽的作用机理，而且也为宣传和推销公司产品提供理论依据，将为市场营销带来明显的经济效应；

(3)也将为活性肽的研究提供数据和理论依据，推动多肽产品的研究和开发，有助于满足人们日益提高的生活水平需要。

通过D-gal诱导的亚急性衰老的大鼠模型，我们研究发现鱼精多肽除具有基本营养功能外，在体内具有明显的抗氧化活性。鱼精多肽能明显提高大鼠血清，脑和肝组织中的SOD活力，并明显降低MDA的含量。在这项研究中，我们研究了鱼精多肽在对于羟自由基，DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除活性，并通过层析方法并主要以羟自由基作为筛选指标分离获得具有抗氧化活性的多肽，通过液质联用、NCBI数据库搜索和蛋白序列分析，对其一级结构进行了分析和鉴定。

总之，本发明工艺简单，制备成本低，应用范围广；对今后开发利用鱼精多肽中的抗氧化二肽提纯物质进行药品、保健品及化妆品等各种产品的大规模生产奠定了基础。

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：

实施例1

一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：

(1)取鲑鱼或鲱鱼、鳟鱼等鱼精多肽(鱼精蛋白酶解产物)0.25-0.5g溶解在5-10ml双蒸水中，10000rpm离心8-10min，取上清液；

(2)上清液上样到Sephadex G-35柱(26×450 mm)，双蒸水以0.6ml/min流速洗柱；在254nm下监测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，因为收集样品和出峰时间有一定时间差，故根据出峰时间再延期3-6秒收集；收集完成后，各收集管中样品合并，立即放在-80℃冷冻保存；-80℃下的样品迅速放入也预冷的冷冻干燥器中，冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(3)具最高抗氧化活性的组分被收集、冻干(过程和前面一致)，进一步利用Macro-Prep High Q柱(16×150mm)分离纯化，柱子先用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)以0.8ml/min流速，预处理1h；上样后，柱子用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)以0.8ml/min流速洗脱30min，然后以线形梯度为0-0.35M NaCl的Tris-HCl缓冲液(20mM，pH8.3)洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；每个组分根据洗脱峰被收集、冷冻干燥；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(4)冻干粉溶解成较高浓度，用5ml注射器上样，然后用5ml Hi-Trap脱盐柱处理，在254nm检测，根据洗脱峰收集，收集冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(5)最高羟自由基清除活性的多肽组分通过具有二级管阵列(PDA)Waters 2695 HPLC系统进一步分离纯化，分离柱为10×250mm、C₄的反相柱YMC-Pack PROTEIN-RP；用含0.1％三氟乙酸的3％乙腈洗脱，在280nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(6)活性组分被收集浓缩，最高活性组分进一步通过3.9×150mm的反相分离柱Symmetry Shield^TM RP18分离，用含0.1％三氟乙酸的线形梯度5-15％乙腈以0.8ml/min速度洗脱，在254nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。

实施例2

体内和体外研究都证明鱼精多肽都具有明显的抗氧化活性，因此我们基于抗氧化功能，进行进一步分离纯化的研究。

进行凝胶过滤分离

例如：取0.25-0.5g粗鱼精多肽用双蒸水溶解至5-10ml，10000rpm离心8-10min去掉水不溶物。采用滴定管将样品小心加到G35凝胶柱顶端。用双蒸水进行洗脱，速度为0.6ml/min，检测波长为254nm，自动分部收集器收集洗脱的样品，每5min收集1管。经G35凝胶分离后共获得G1，G2和G3三个组分，具有很好的分离效果。与标准蛋白相比，G3的分子量确定为小于1400Da。收集这三个组分后，进行羟自由基清除实验。结果表明，在1mg/ml浓度下，G3具有最高的清除活性。三个组分的IC₅₀值分别为2.3、3.47、0.86mg/ml。因此G3作为具有最强活性的组分，进行进一步的阴离子交换层析。

进行离子交换层析

将G3溶液冷冻干燥后，用少量pH8.3的20mM Tris-HCl缓冲液溶解后上样到Macro-Prep High Q柱，阴离子交换柱事先用pH8.3的20mM Tris-HCl缓冲液平衡充分平衡。上样量为27mg，上样体积为约0.8ml，流速为0.8ml/min。上样完成后，用上样缓冲液进行洗涤，待出现流穿峰出现后，采用0-0.35MNaCl的缓冲液梯度洗脱，出现Q1，Q2和Q3三个组分。收集这三个组分后，冷冻干燥后，用少量蒸馏水溶解后，过Hi-Trap^TM Desalting柱脱盐，测定浓度后进行羟自由基清除率测定。结果表明，在400μg/ml浓度下，Q3具有最强的羟自由基清除活性。三个组分的IC₅₀值分别为0.484，1.167和0.418mg/ml。因此收集Q3后进行HPLC分离。

进行HPLC分离纯化

高效液相作为一种精细的分离纯化方法，具有分离效率高，选择性强，良好的生物活性回收率和质量回收率，操作微量和简便的特点。目前已成为蛋白质和多肽分离和分析的一种主要分析技术，广泛应用于天然蛋白和多肽的开发以及制药工业中蛋白药物的分析。

将Q3脱盐后测定其浓度，然后进行RP-HPLC分离。分离柱采用YMC-Pack PROTEIN-RP反相柱。每次进样50μl，含量约为3mg。流动相为含0.1％TFA的3％乙腈，采用等度洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长为280nm。例如，共检测到6个组分，分别命名为P1，P2，P3，P4，P5和P6。测定各个组分的羟自由基清除活性，结果表明在40μg/ml浓度下，P5的羟自由基活性最高。收集P5后再次对其进行分离，采用Symmetry Shield^TMRP18反相柱，流动相为含0.1％TFA的3％乙腈，等度洗脱。如只检测到一个大的洗脱峰(另一峰非常小)，将其命名为PHP。羟自由基清除实验显示PHP在40μg/ml浓度时，对羟自由基的清除活性为21.04％。至此，我们通过凝胶过滤，离子交换和反相HPLC分离获得具有最高抗氧化活性的肽段，接下来对其结构和性质进行了鉴定。

对活性多肽的特性分析

多肽或蛋白的氨基酸序列分析是结构鉴定的一个最重要部分。起初，肽序列分析采用的Edman降解法，与质谱法相比较，有费时和灵敏度低的特点。串联质谱采用软件进行迭代算法来解析肽序列，目前在肽结构解析领域应用广泛。在这个研究中，我们采用电喷雾ESI-MS和串连质谱MS/MS进行PHP的序列解析。通过在NCBI数据库中查阅鱼精多肽序列，质荷比m/z为272.8的片段确定为序列Pro-Arg，是鱼精多肽序列的第1-2和16-17位残基。

但单电荷离子272.8的MS/MS的结果并没有含有这个序列的全面信息，这种情况可能是由于碰撞能量的增加，导致断裂位点不在肽键部位，而是其他一些键的位点，使得解析变得困难。

胰酶中含有的蛋白酶主要是胰蛋白酶(trypsin)，其作用位点是碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸形成的肽键。由于鱼精蛋白结构比较特定，因此采用胰蛋白酶水解后会生产一些特定结构的肽序列，如Pro-Arg，Ser-Ser-Ser-Arg，Pro-Ile-Arg，Val-Ser-Arg and Gly-Gly-Arg等。

-Ramos等人报道乳清蛋白酶解产物中，具有最高抗氧化活性的组分的分子量较小，且其抗氧化活性的作用与肽片段中的组氨酸和疏水氨基酸有关。也有报道认为某些氨基酸具有抗氧化活性，如组氨酸，脯氨酸，酪氨酸，赖氨酸等，富含这些氨基酸的多肽在具有良好抗氧化活性。L-精氨酸也被证明能预防ROS引起的氧化损伤。Chen等人研究了28种合成的肽片段，发现N端Pro的存在能显著提高Pro-His-His的抗氧化活性。这个实验中鉴定的具有抗氧化活性的二肽PHP的序列为Pro-Arg，因此我们预测PHP的抗氧化活性可能与肽的大小及肽键有关，特别是Pro和Arg的存在。

自由基的存在可以破坏有机体内细胞膜、DNA、酶和蛋白的结构，从而导致一些疾病。氧化应激反应在许多衰老疾病中具有重要作用，如动脉粥样硬化等，造成这些疾病的因素包括脂质过氧化反应及氧化反应后期产生的一些小分子物质。从大豆、鸡蛋清蛋白和鱼蛋白酶解产物中得到的天然抗氧化剂不仅具有丰富的营养功能，而且能有效抑制和清除体内的自由基。这些天然抗氧化剂目前正成为食品和医学领域的研究热点。我们的研究表明，来源于渔业副产品的鱼精蛋白酶解产物(Protamine hydrolysate)，在体内和体外都具有良好的抗氧化活性。本发明为鱼精多肽在食品和保健食品中应用提供了科学而详细的证据，也为鱼白的广泛利用提供了支持。

合成的新的二肽在体外不仅有明显的清除羟自由基活性，而且明显降低MRC-5胞内自由基的含量，从而保护细胞避免氧化损伤。

上述参照实施例对该鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据限定范围举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：

(1)取鱼精多肽，即鱼精蛋白酶解产物0.25-0.5g溶解在5-10ml双蒸水中，10000rpm离心8-10min，取上清液；

(2)上清液上样到Sephadex G-35柱26×450mm，双蒸水以0.6ml/min流速洗柱；在254nm下监测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，视收集样品和出峰时间的时间差，且根据出峰时间再延期3-6秒收集；收集完成后，各收集管中样品合并，立即放在-80℃冷冻保存；-80℃下的样品迅速放入也预冷的冷冻干燥器中，冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(3)将最高抗氧化活性的组分收集、冻干，过程与步骤(2)相同，进一步利用Macro-Prep High Q柱16×150mm分离纯化，柱子先用20mMTris-HCl缓冲液pH8.3、以0.8ml/min流速，预处理1h；上样后，柱子用20mMTris-HCl缓冲液pH8.3以0.8ml/min流速洗脱30min，然后以线形梯度为0-0.35M NaCl的Tris-HCl缓冲液20mM，pH8.3洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；每个组分根据洗脱峰被收集、冷冻干燥；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(4)冻干粉溶解成较高浓度，用5ml注射器上样，然后用5ml Hi-Trap脱盐柱处理，在254nm检测，根据洗脱峰收集，收集冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(5)最高羟自由基清除活性的多肽组分通过具有二级管阵列(PDA)Waters 2695 HPLC系统进一步分离纯化，分离柱为10×250mm、C₄的反相柱YMC-Pack PROTEIN-RP；用含0.1％三氟乙酸的3％乙腈洗脱，在280nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；

(6)活性组分被收集浓缩，最高活性组分进一步通过3.9×150mm的反相分离柱Symmetry Shield^TM RP18分离，用含0.1％三氟乙酸的线形梯度5-15％乙腈以0.8ml/min速度洗脱，在254nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。