KR101680644B1 - 여왕벌 유래 엔-글라이칸 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Hex3HexNAc3dHex1 (1282.5 m/z) 또는 Hex4HexNAc3dHex1 (1485.6, m/z)의 당쇄 구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 및 이를 포함하는 분획물; Hex8 (1377.5 m/z)의 당쇄 구조를 가지는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan); 및 상기 N-글라이칸(N-glycan) 또는 이를 포함하는 분획물을 유효성분으로 함유하는 소염 또는 관절염 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 및 이를 포함하는 분획물은 그의 생물학적 활성이 알려짐에 따라 의약품, 화장품 및 기능성식품 소재로 사용할 수 있어 제약 및 기능성 분자로서의 가치를 가지며, 특히 소염 또는 관절염 치료효과가 있어, 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 의약품 개발을 가능케함으로써, 양봉사육농가 소득 보전 및 국민보건향상에 기여할 수 있다.

Description

여왕벌 유래 엔-글라이칸 및 이의 용도{N-Glycan Purifed from Queen Bees and Use Thereof}

본 발명은 특정 당쇄구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 또는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 및 이의 용도에 관한 것이다.

글라이코자미노글라이칸(Glycosaminoglycan, GAG)은 반복하는 이당류 단위를 가진 음이온성 이형다당류로서, 산성당(uronic acid)과 아미노당(N-acetylglucoamine, N-acetylgalactosamine)의 결합을 통해 사슬이 무수히 반복되는 구조를 가지고 있으며, 당 잔기에 황산기(SO^3-) 혹은 카르복실기(COO-)를 가져 음전하를 띠고, 당 잔기들 간의 결합 형태와 sulfate의 수와 위치에 따라 그 특성이 분류된다. GAG는 황산기의 유무에 따라 황산화 다당과 비황산화 다당으로 크게 나누어지며, 대표적인 GAG는 hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparin/heparan sulfate와 keratan sulfate를 들 수 있다.

Hyaluronic acid를 제외한 GAG는 당단백질과는 다른 프로테오글리칸으로 존재하며, 음이온기가 많은 chondroitin sulfate와 keratan sulfate(또는 dermatan sulfate)의 콘드로이틴군(chondroitin family)과 헤파린군(heparin family)은 결합 부위에 중심단백질을 가지는 특징이 있다.

또한, 세포막에 존재하는 당단백질은 N-glycan과 O-glycan으로 나뉘어지며 그 중 N-glycan은 asparagine의 NH₂ 잔기에 N-acetylglucosamine이 결합하는 것을 시작으로 당쇄가 형성되며 N-X(아무 아미노산도 가능)-S(serine) /T(threonine의 아미노산 서열을 가지는 경우의 Agr만 N-글라이칸(N-glycan)의 아미노산 부착이 가능하다. N-글라이칸(N-glycan)은 High mannose로 ER에서 미성숙형태로 합성되어, hybrid로 Golgi로 이동 후 성숙한 형태의 complex가 되는데, mannose에 다시 N-glycosamine이 결합된 다양한 형태로 복잡하게 합성된 성숙한 형태로 되어간다. 이 과정은 매우 특이성이 높은 당전이효소들에 의해 조절되며 당쇄의 사소한 변화와 미묘한 차이에 의해 세포기능이 조절되고 변화할 수 있다.

최근 GAG 또는 N-글라이칸(N-glycan)의 여러 가지 생물학적 활성이 알려짐에 따라 의약품, 화장품 및 기능성식품 소재로 사용하고 있어 제약 및 기능성 분자로서의 가치가 증가하고 있으며, 특히 성장 인자와 사이토카인 생성을 조절하고, 조직의 결합이나 특수한 조직의 성숙에 영향을 미치며, 생물학적인 필터로서 역할을 수행하고 콜라겐 섬유 합성과 피부의 인장강도를 조절하며 암세포의 성장과 침윤에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

이의 주원료로 사용되고 있는 소, 돼지, 닭 등의 축육은 광우병, 돼지 인플루엔자, 콜레라, 구제역, 조류독감 등의 여러 가지 질병으로 인해 원료로서의 안전성 확보가 어렵고, 상어연골과 껍질, 고래, 참치와 같은 다랑어류는 개체수의 감소로 인해 멸종 방지를 위한 여러 가지 국제적 협약들이 맺어져 있으며, 이로 인해 연간 생산량이 한정되어 있다. 이 같은 자원 확보의 어려움 때문에 새로운 대체자원이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 신규 GAG 공급원으로 곤충을 선택하였으며, 여왕벌의 알콜추출잔사에서 프로테오글라이칸을 제조 후, 단백질 부분을 N-Glycosidase F처리하고, 당 이외 불순물을 다공성탄소흑연 카트리지를 이용하여 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)분리한 다음, MS 및 MS/MS를 통한 당 서열 및 구조를 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 하나 이상의 Hex, dHex 및/또는 HexNAc로 구성된 특정 당쇄구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 또는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 및 이를 포함하는 분획물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 N-글라이칸(N-glycan) 또는 상기 분획물을 유효성분으로 함유하는 소염 또는 관절염 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Hex3HexNAc3dHex1 (1282.5 m/z) 또는 Hex4HexNAc3dHex1 (1485.6, m/z)의 당쇄 구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 및 이를 포함하는 분획물을 제공한다.

본 발명은 또한 Hex8 (1377.5 m/z)의 당쇄 구조를 가지는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 N-글라이칸(N-glycan) 또는 상기 분획물을 유효성분으로 함유하는 소염 또는 관절염 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 하나 이상의 Hex 및/또는 HexGlcNAc로 구성된 특정 당쇄 구조를 가지는 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 및 이를 포함하는 글라이코자미노글라이칸은 그 생물학적 활성이 알려짐에 따라 의약품, 화장품 및 기능성식품 소재로 사용할 수 있어, 제약 및 기능성 분자로서의 가치를 가지며, 특히 소염 또는 관절염 치료효과가 있어, 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 의약품 개발을 가능케함으로써, 양봉사육농가 소득 보전 및 국민보건향상에 기여할 수 있다.

도 1은 조(crude) 글라이코자미노글라이칸에 대해 이온교환크로마토그라피(Sephadex DEAE A-25) 크로마토그램 결과이다(A: 호박벌 여왕벌; B: 서양뒤영벌 여왕벌).
도 2는 정제된 글라이코자미노글라이칸의 순도를 확인하기 위한 SAX-HPLC 결과이다.
도 3은 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)의 MALDI-TOF MS/MS 크로마토그래피 결과(A); Hex4HexNAc3dHex1 (1485.6, m/z)의 당쇄 구조(B); 및 Hex3HexNAc3dHex1 (1282.5 m/z)의 당쇄 구조(C)의 분석 결과이다.
도 4는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)의 MALDI-TOF MS/MS 크로마토그래피 결과(A); 및 Hex8 (1377.5 m/z)의 당쇄 구조 분석결과(B)이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

최근 N-글라이칸(N-glycan)의 여러 가지 생물학적 활성이 알려짐에 따라 의약품, 화장품 및 기능성식품 소재로 사용하고 있어, 제약 및 기능성 분자로서의 가치를 가지며, 공급원 확보의 어려움 때문에 새로운 대체자원이 필요한 실정이다. 이에 본 발명자들은 신규 GAG 공급원으로 여왕벌을 선택하였으며, 이로부터 정제된 GAG의 N-글라이칸(N-glycan) 당 서열을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 일 관점에서, Hex3HexNAc3dHex1 (1282.5 m/z)의 당쇄 구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, Hex4HexNAc3dHex1 (1485.6, m/z)의 당쇄 구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 글라이코자미노글라이칸으로부터 N-글라이칸(N-glycan)을 정제하는데 있어서, 이온교환크로마토그라피(ion exchange chromatography) 과정에서 용출 시 사용되는 염화나트륨의 농도는 0.5 M인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 있어서, 상기 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)의 구조는 Hex, dHex 및 GlcNAc로 구성되며, 보다 상세하게는 Hex4HexNAc3dHex1 (1485.6, m/z) 또는 Hex3HexNAc3dHex1 (1282.5 m/z)의 당쇄 구조를 특징으로 하고, 구체적으로 도 3B 및 도 3C의 구조를 가지며, 이의 분획물에는 Hex3HexNAc2dHex1, Hex3HexNAc3, 및 Hex3HexNAc6의 당쇄 구조를 가지는 N-글라이칸(N-glycan)이 혼합된 특징이 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, Hex3HexNAc2dHex1, Hex3HexNAc3, Hex3HexNAc3dHex1 (1282.5 m/z), Hex4HexNAc3dHex1 (1485.6, m/z), 및 Hex3HexNAc6의 N-글라이칸(N-glycan) 당쇄 구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 글라이코자미노글라이칸을 포함하는 0.5 M 분획물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, Hex8 (1377.5 m/z)의 당쇄 구조를 가지는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 글라이코자미노글라이칸으로부터 N-글라이칸(N-glycan)을 정제하는데 있어서, 이온교환크로마토그라피(ion exchange chromatography) 과정에서 용출 시 사용되는 염화나트륨의 농도는 0.5 M인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)은 도 4B에 나타난 바와 같이, Hex로 구성된 선형 구조를 가지는 특징으로 하며, 이의 분획물에는 Hex7, Hex3HexNAc3dHex2, Hex4HexNAc3Pen1, Hex9 및 Hex5HexNAc3dHex2의 당쇄 구조를 가지는 N-글라이칸(N-glycan)이 혼합된 특징이 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, Hex7, Hex8 (1377.5 m/z), Hex3HexNAc3dHex2, Hex4HexNAc3Pen1, Hex9, 및 Hex5HexNAc3dHex2의 N-글라이칸(N-glycan) 당쇄 구조를 가지는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 글라이코자미노글라이칸을 포함하는 0.5 M 분획물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어 '크로마토그래피(chromatography)'는 다공성 흡착제 입자를 충전시킨 일정한 길이의 관(column)에 용질이 들어 있는 혼합물을 통과시켜 흡착제 입자에 대한 용질의 흡착 특성의 차이를 근거하여 분리하는 방법이다. 크로마토그래피 공정은 이동상(mobile phase) 및 고정상(stationary phase)로 이루지면, 고정상은 흡착제, 이온교환수지, 다공성 물질 또는 겔을 사용할 수 있다. 다성분 혼합시료의 분리 분석에 유용한 액체 크로마토그래피는 고압액체 크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography) 및 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로 대표적으로 분류될 수 있으며, 본 발명에서는 이온 또는 전기적으로 전화를 띠는 화합물, 즉 곤충의 N-글라이칸(N-glycan)의 극성이 크다는 점을 이용하여, 전기적 힘에 의하여 충진제와의 흡착원리를 이용한 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서의 용어 '용출'은 '용리(elution)과 혼용될 수 있으며,이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)에 사용된 이온교환수지에 결합된 N-글라이칸(N-glycan)의 극성이 서로 다르다는 점을 활용하여 염 구배에 의하여 염 농도를 달리한 버퍼를 사용하여 산성당(uronic acid) 함량이 높은 분획물을 수득하는 과정이다.

본 발명의 여왕벌 N-글라이칸(N-glycan) 또는 분획물을 수득하기 위해서는 염화나트륨을 사용한 염 구배 용출을 수행하며, 각 곤충별 산성당(uronic acid) 함량이 높은 분획의 염 농도는 각각 0.5 M인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 N-글라이칸(N-glycan)은 (a) 여왕벌에 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸알콜, 에틸알콜, 프로판올, 부탄올, 아세토니트릴, 클로로포름 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용매에 1 내지 4일간 침지하여 지방류를 제거하고, (b) 이로부터 단백질을 제거한 다음, (c) 침전과 투석과정을 통해 산성당이 포함된 N-글라이칸(N-glycan) 분획을 수집하여, (d) 이온교환크로마토그라피(ion exchange chromatography) 과정에서의 염화 나트륨을 이용한 염구배 용출과정을 통해, 정제되는 것을 특징으로 한다.

상기 (b) 단계에서의 단백질 제거는 바실러스 유래(Bacillus licheniformis 등) 단백분해효소인 알카라제, Aspergillus oryzae 유래 protease 등을 포함하는 단백분해제를 사용하여 수행할 수 있으며, 이 때 단백분해에 필요한 소요 시간은 3 ~ 7일로, 실온 이상에서 단백질 분해를 촉진할 수 있고, 44℃ 가온 시 반응을 촉진할 수 있다. 상기 단백분해제를 2 ~ 5중량% 사용함으로써, 벌의 껍질의 단백질을 효과적으로 제거할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 이온교환크로마토그라피(ion exchange chromatography)는 Sephadex DEAE A-25를 충전제로 사용하며, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 N-글라이칸(N-glycan)을 유효성분으로 함유하는 소염 또는 관절염 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 분획물을 유효성분으로 함유하는 소염 또는 관절염 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 곤충 N-글라이칸(N-glycan) 또는 상기 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 상기 질환 외에도 혈관신생 억제, 및 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 등에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물의 유효성분인 N-글라이칸(N-glycan) 또는 이를 포함하는 분획물은 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 또는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래인 것을 특징으로 하며, 단독 또는 혼합의 조성으로 구성될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 또는 이의 분획물에 대해 추가로 귀뚜라미(Gryllus bimaculatus), 매미눈꽃동충하초(Isaria sinclairii), 강랑(Catharsius molossus), 맹충(Tabanus bivittatus), 또는 광대노린재(Poecilocoris lewisi) 유래의 N-글라이칸(N-glycan) 또는 이를 포함하는 글라이코자미노글라이칸을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물 또는 기능성식품은 투여를 위해서 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 제제화 할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 용매, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제를 부가적으로 첨가할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적절한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 제약상 적합한 부형제인 고상, 준고상 또는 액상희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형보조물을 첨가하여 제제화 가능하며, 바람직한 제형으로는 정제, 피복정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제(pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제, 시럽, 즙, 점적제, 주사 가능한 액제, 서방출형 제제 및 분무제 등이 포함된다.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 통상의 부형제, 예를 들면 (a) 충진제 및 중량제(예: 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코오스, 만니톨과 규산) (b) 결합제(예: 카르복시메틸 셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈) (c) 흡습제(예: 글리세롤), (d) 붕해제(예: 한천, 탄산칼슘 및 탄산나트륨), (e) 용해지연제(예: 파라핀) (f) 흡수촉진제(예: 4급 암모늄 화합물), (g) 습윤제(예: 세틸알코올 및 글리세롤모노스테아레이트), (h) 흡착제(예:고령토 및 벤토나이트), 및, (i) 윤활제(예: 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 마그네슘 스타레이트 탈크 및 고체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 상기(a) 내지 (i)에서 기재한 물질의 혼합물 이외에 유효화합물 또는 화합물들을 함유할 수 있다. 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 피막을 입힐 수 있으며, 장관 특정부위에 유효화합물만 방출시키도록 할 수 있으며, 필요한 경우 고분자 등을 사용하여 서방형으로 제제화할 수도 있고 미세캡슐화할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 주사제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등이 포함된다. 좌제는 유제화합물 이외에 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 카카오지방 등의 지방, 고급에스테르(예: C16-지방산을 갖는 C14-알코올), 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 라우린지 및 글리세롤젤라틴 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

연고제, 페이스트제, 크림제 및 겔제는 유효화합물 이외 통상의 부형제, 락토오스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분제, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제로는 통상의 포사제, 예를 들면 클로로풀루오로히드로카본을 더 함유할 수 있으며, PEG-4000과 글리세린을 함유하는 비강 분무제로도 제제화할 수 있다.

액제 및 에멀젼제는 유효 성분 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 물, 에칠알콜, 이소프로필 알코올, 에틸카보네이트, 에칠아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포롬아미드 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유, 글리세롤, 테티라히드로푸로푸릴 알코올, 포리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 액제 및 에멀젼제는 혈액과 등장성인 멸균형태로 제제할 수 있다.

현탁제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상희석제(예: 물, 에틸알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜) 및 현탁제(예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및/또는 소르비탄 에스테르), 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

상기 제형들은 또한 발색제, 방부제 및 냄새나 맛을 개선시키는 첨가제, 예를 들면 박하유 및 유칼리유 및 감미제(예: 사카린)를 함유할 수 있으며, 본 발명에 의한 화합물 이외에 다른 제약상의 유효한 화합물을 함유할 수 있다.

상기 제형은 공지된 방법, 예를 들면 유효성분을 부형제와 혼합하는 통상의 방식으로 제조된다. 유효성분은 상기 제형에 있어서 전체 혼합물의 약 0.1 내지 99.5 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 95 중량%의 양으로 함유된다.

본 발명의 약학 조성물은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각 N-글라이칸(N-glycan) 또는 이를 포함하는 분획물의 양을 기준으로 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 1일 0.1 mg/kg ~ 900 mg/kg의 범위 내에서 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

이 때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

[ 실시예 1] 여왕벌 글라이코자미노글라이칸의 제조

1. 여왕벌 유래 조(crude) 글라이코자미노글리칸의 제조

농촌진흥청 국립농업과학원에서 입수한 ① 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌, 및 ② 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌을 각각 ① 2 kg, 및 ② 1 Kg을 마쇄 후 동량 이상의 부피의 에탄올 또는 아세톤에 3일간 침지하여 지방류를 제거한 다음, 여과하여 걸러지지 않는 잔사(곤충껍질 등)를 건조시켰다. 건조된 잔사를 분쇄기(ball mill 또는 hammer mill)로 분쇄(100~300메쉬)하고, 바실루스 유래(bacillus lichenformis)의 시그마 알카라제(pH 9.0)를 2.5% 중량으로 첨가하여 44℃에서 4일간 효소처리로 단백질을 분해시켰다.

냉장보관한 50% 트리클로로아세트산 (Trichloroacetic acid)의 최종농도가 5%가 되도록 상기 효소처리액에 첨가하여 4℃에서 3시간 동안 반응시켜 단백질을 침전시킨 다음, 원심분리(8000 rpm)방법으로 수득된 잔사 부피에 대해 2배의 에탄올(100%)과 potassium acetate로 당을 공침시키고, 다시 침전물을 배량의 cetylpyridinium(5 중량%)에 침전시킨 후, 다시 침전물을 2 배량의 에탄올에 침전시킨 후, 증류수로 분자 량3500 이상의 투석막을 사용하여 투석하고, 동결건조하여 각각 ① 2.21 g, 및 ② 4.89g의 여왕벌 유래 조(crude) 글라이코자미노글라이칸을 수득하였다.

2. 벌 N-글라이칸(N-glycan) 분획의 제조

상기 과정을 반복하여 추출된 조(crude) 글라이코자미노글라이칸에 대해 이온교환크로마토그라피(Sephadex DEAE A-25)를 사용하여 염 경사(salt gradient; 0, 0.1, 0.5, 1, 2.5 M NaCl in phosphate buffer)로 정제하였으며, 산성당(Uronic acid)을 가지는 분획물을 수집한 후, 분자량 3500 cutoff 투석 막(dialysis)을 사용 염분을 제거한 후 동결건조후 당쇄 분석 대상으로 선택하였다(도 1).

순도 확인은 글라이칸 분해효소(헤파리나제I,II,III, 콘드로이친 ABCase) 처리 후 저분자하여 SAX(강이온교환, 페노멕스, 250x 10 mm)-HPLC, 232 nm를 실시하여 단일 Peak가 검출되는지를 확인함으로써 순도를 확인하였다(도 2).

[실시예 2] 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)의 당서열 분석

1. 여왕벌 N-글라이칸(N-glycan) 농축

여왕벌 엑기스의 추출 후, 조추출물로부터 분리한 프로테오글라이칸으로부터 글리칸(N-glycan)만을 방출시켜, 이들의 당서열을 분석하기 위하여 다음의 과정을 수행하였다.

상기 프로테오글리칸에 denaturing 버퍼를 혼합하여 100℃ 10분간 끓여 단백질부분을 불활성화하고 2 ㎕ N-glycosidase F(1000 U, 제조사, 국가)를 사용하여 37℃에서 20시간동안 처리하여 당과 단백질을 연결이 절단되도록 하여, 단백질 부분을 제거한 다음, 최종적으로 수득된 N-글라이칸(N-glycan)을 진공건조하여 보관하였다.

N-글라이칸(N-glycan)을 분리하기 위하여, 다공성탄소흑연 카트리지(porous carbon graphite cartridge, PGC(제품명; Extract-clean columns carbograph, 제조사 ; Grace)를 80% acetonitirle/0.1% trifluoroacetic acid(v/v) 혼합 용액으로 세척한 후, 초순수로 조건을 맞추고, 상기 N-글라이칸(N-glycan)을 상기 카트리지에 로딩하고, 10분 동안 대기한 다음, 4 mL의 초순수로 세척하고 염과 완충액을 제거하였다.

그 후, 40% acetonitirle/0.05% trifluoroacetic acid를 사용하여 용출한 후, 과메칠레이션(permethylation)시키고, 진공 건조 후 50% acetonitrile 10 ㎕에 10 mg/ml의 농도로 혼합된 2,5-dihydroxybenzoic acid(DHB) 함유 용액에 용해시킨 다음 Matrix assisted laser ionization(MALDI) Time of flight(TOF) analyzer(AXIMA Resonance, Shimadzu), positive polarity를 실시하였으며, 상기 MALDI-TOF의 분석 조건은 표 1에 나타난 바와 같으며, 600~3500 m/z 범위에서 피크 유무를 확인하였다.

Mass spectrophotometer
Mode	MS	MS/MS
Ionization mode	MALDI	MALDI
Polarity	Positive	Positive
Analyze type	Time of flight(TOF) analyzer	TOF analyzer
Mass range	m/z 800 - 3000	m/z 500-2000

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, MS로 분자량 패턴을 확인한 후, MS/MS를 실시하고, 이로부터 수득된 데이터에 대해 glycan data base library program을 실시하여 당서열분석을 확인하였으며, 이를 근거로 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan)의 당서열 및 구조를 동정하였다(표 2, 도 3 내지 도 4).

곤충	분획 염농도	Mass chromatography
		MS/MS	MS
호박벌 여왕벌	0.5 M	m/z1282.5, Hex3HexNAc3dHex1 m/z1485.6, Hex4HexNAc3dHex1	Hex3HexNAc2dHex1, Hex3HexNAc3, Hex3HexNAc3dHex1, Hex4HexNAc3dHex1, Hex3HexNAc6
서양뒤영벌 여왕벌	0.5 M	m/z 1377.5, Hex8	Hex7, Hex8, Hex3HexNAc3dHex2, Hex4HexNAc3Pen1, Hex9, Hex5HexNAc3dHex2

Claims (9)

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2. Hex3HexNAc2dHex1, Hex3HexNAc3, Hex3HexNAc3dHex1 (1282.5 m/z), Hex4HexNAc3dHex1 (1485.6, m/z), 및 Hex3HexNAc6 각각의 당쇄 구조를 가지는 호박벌(Bombus ignitus) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 혼합물;
   또는,
   Hex7, Hex8 (1377.5 m/z), Hex3HexNAc3dHex2, Hex4HexNAc3Pen1, Hex9, 및 Hex5HexNAc3dHex2 각각의 당쇄 구조를 가지는 서양뒤영벌(Bombus terrestris) 여왕벌 유래 N-글라이칸(N-glycan) 혼합물;
   중 선택되는 한가지 혼합물을 유효성분으로 함유하는 염증 개선용 건강기능식품.
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