CN1307198C - 眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法 - Google Patents

眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种眼镜蛇蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法，可同时分离眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素，提高了眼镜蛇毒的综合利用效率。本发明先使用丙酮处理眼镜蛇蛇毒原液，以除去蛇毒原液中的脂溶性成分，以酸调节蛇毒丙酮粉水溶液的pH，离心除去蛇毒中的中酸性蛋白和多肽，再以PAA特异吸附并沉淀蛇毒中的碱性蛋白和碱性多肽，离心分离PAA-碱性蛋白/多肽复合物，除去水溶性成分；利用pH变化使PAA-碱性蛋白/多肽解吸附，用氯化钙除去PAA；以Sephadex G-50(超细颗粒)凝胶柱分离纯化眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素，产品含盐量低，可直接冷冻干燥。

Description

眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，涉及眼镜蛇蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法。
背景技术
眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的一种天然毒蛋白，其化学成分非常复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性。随着现代生物技术的发展，眼镜蛇毒的许多组分已得到分离纯化和序列测定，各种成分广泛应用于生物化学、分子生物学、毒理学和药物学理论研究和临床应用。
自1933年Monaelesser和Taguet首次报道眼镜蛇毒对癌组织压迫神经引起疼痛的病例的显著疗效经来，眼镜蛇毒的镇痛作用得到了深入的研究，其中眼镜蛇毒神经毒素(neurotoxin，NTX)显示了独特的镇痛作用，NTX的镇痛机理与吗啡类似，镇痛效果大于吗啡，持续时间长，无麻醉作用，无成瘾性和耐药性，但起效较吗啡慢；同时NTX还能戒除吗啡毒瘾，所以在癌痛或戒毒等方面具有独特的治疗作用。
眼镜蛇毒细胞毒素(cytotoxin，CTX)是眼镜蛇毒的重要活性成分之一，约占蛇毒总蛋白的40％～50％，同一种眼镜蛇毒含有多种CTX，它们对体外培养的多种动物和人的肿瘤细胞具有溶解作用，能够强烈破坏游离细胞，尤其是恶性肿瘤细胞，是一种很有潜力的抗肿瘤药物。
获得单一成分的CNT和CTX是理化性质分析、药理活性研究和临床应用的前提。CNT和CTX分离纯化的国内外报道较多(Chang，et al.Biochem Biophys Res Commun，2002，294(3)：574；Lin，et al.J Protein Chem，2002，21(2)：81；李范珠等，中国药师，2004，7(9)：659；张明芳等，福建医科大学学报，2004，38(1)：1)，也有相关的专利技术(WO01/03710和CN1102570A)，但都是使用SP-Sephadex、CM-Sephadex、Sephadex和Mono Q等不同介质进行离子交换层析和分子筛层析分离纯化，虽能得到较高纯度的单一组分，但提取率较低，还需要昂贵的蛋白质纯化设备，增加了药物的成本，阻碍了这类药物的进一步推广使用。
发明内容
本发明设计了一种全新的NTX和CTX分离纯化方法，从眼镜蛇毒中同时高效提取高纯度NTX和CTX。
本发明提供的眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法包括以下步骤：
(1)按重量份1份眼镜蛇毒原液使用10份丙酮研磨、洗涤，操作时，先取适量丙酮研磨眼镜蛇毒原液成匀浆，以滤纸过滤匀浆，再用剩余丙酮洗涤，室温放置使丙酮挥发，即得眼镜蛇毒丙酮粉；
(2)眼镜蛇毒丙酮粉按1∶10(W/V)溶解于蒸馏水中，用50％的乙酸溶液调节pH至4.0～5.0，10000rpm 4℃低温离心5～10min，取上清液；
(3)按上清液体积计，加入25％的聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)至终浓度为3～5％(W/V)，记录PAA加入量，4℃放置30～50min，2000rpm 4℃低温离心3～5min，取沉淀溶解于适量蒸馏水中，用0.5mol/L碳酸钠溶液调pH至9.5～10.0，加氯化钠至终浓度为4～5％(W/V)，以已加入的PAA：氯化钙溶液为1∶35(W/V)加入20％的氯化钙溶液并混匀，室温放置30min，以盐酸调节pH至4.0～5.0，室温放置30～50min，10000rpm 4℃低温离心5～10min，取上清液；
(4)上清液用超细颗粒Sephadex G-50凝胶柱分离，以5～10mmol/L pH 7.0～7.5含0.2～0.3mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，第一个洗脱主峰为神经毒素，第二个洗脱主峰为细胞毒素，收集各级分溶液冻干，即分别为眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素。
本发明所述的NTX，是从眼镜蛇毒中分离纯化的多肽类物质，其特征是：由61～62个氨基酸残基组成的碱性多肽，分子量为7300～7500Da，等电点pH(PI)为10.0左右，小鼠热板法结果显示，腹注1/4LD50和1/2LD50的NTX，小鼠痛阈比对照组平均升高43％和54％，并有剂量一效应关系。
本发明所述的CTX，是从眼镜蛇毒中分离纯化的多肽类物质，其特征是：由60个氨基酸残基组成的碱性多肽，分子量为6600～7100Da，等电点pH(pI值)为11.0左右；大鼠体外心脏标本收缩试验表明CTX使大鼠体外心脏标本收缩幅度减小、挛缩，最后停搏于收缩期。
本发明具有的下列优点：
1.本发明可同时分离眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素，提高了眼镜蛇毒的综合利用效率。
2.本发明用丙酮制备眼镜蛇蛇毒丙酮粉，以除去粗蛇毒中的脂溶性成分。
3.本发明以酸调节蛇毒丙酮粉水溶液的pH至4.0，离心除去蛇毒中的中酸性蛋白和多肽。
4.本发明以PAA特异吸附并沉淀蛇毒中的碱性蛋白和碱性多肽，离心分离PAA-碱性蛋白/多肽复合物，除去水溶性成分；利用pH变化使PAA-碱性蛋白/多肽解吸附，用氯化钙除去PAA。
5.本发明以Sephadex G-50(超细颗粒)凝胶柱分离纯化眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素，产品含盐量低，可直接冷冻干燥。
本发明制品使用PAA吸附法，同时提取眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素，综合利用效率和提取效率高；产品纯度高、含盐量低，可直接冷冻干燥，应用前景广。
具体实施方式
实施例1
(1)取浙江产眼镜蛇蛇毒原液2.5g，分析纯25ml丙酮。将蛇毒原液置于研钵中，加5ml丙酮研磨成匀浆，以滤纸过滤匀浆，并用剩余的20ml丙酮洗涤，室温放置使丙酮挥发，即得蛇毒丙酮粉。
(2)将蛇毒丙酮粉溶解于25ml蒸馏水中，用50％的乙酸溶液调节pH至4.5，10000rpm离心5min(4℃)，取上清液，记录体积。
(3)根据上清液体积，加入25％的聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)至终浓度为4％，记录PAA加入量，4℃放置40min，2000rpm离心3min(4℃)，取沉淀溶解于适量蒸馏水中，用0.5mol/L碳酸钠溶液调pH至9.7，加氯化钠至终浓度为4％(W/V)，以已加入的PAA：氯化钙溶液为1∶35(W/V)加入20％的氯化钙溶液并混匀，室温放置40min；以盐酸调节pH至4.0，10000rpm离心7min(4℃)，取上清液。
(4)上清液用Sephadex G-50(超细颗粒)凝胶柱分离，以5mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0，含0.2mol/L氯化钠)洗脱，第一个洗脱主峰为神经毒素，第二个洗脱主峰为细胞毒素，收集各级分溶液冻干，即得眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素。经BCA法测定，其中NTX为195mg，CTX为385mg；SDS-PAGE电泳显示NTX分子量为7400Da，CTX分子量为6900Da左右；等电聚焦电泳表明NTX的等电点pH(pI)为9.8～10.2，CTX的等电点pH(pI值)为11.0～11.3；小鼠热板法证明腹注1/4LD50的NTX，小鼠痛阈比对照组平均升高42％；大鼠体外心脏标本收缩试验证明CTX使大鼠体外心脏标本收缩幅度减小、挛缩，最后停搏于收缩期。
实施例2
(1)取浙江产眼镜蛇蛇毒原液4.0g，分析纯40ml丙酮。将蛇毒原液置于研钵中，加7ml丙酮研磨成匀浆，以滤纸过滤匀浆，并用剩余的33ml丙酮洗涤，室温放置使丙酮挥发，即得蛇毒丙酮粉。
(2)将蛇毒丙酮粉溶解于40ml蒸馏水中，用50％的乙酸溶液调节pH至4.0，10000rpm离心8min(4℃)，取上清液。
(3)同实施例1步骤(3)，但PAA终浓度为5％。
(4)上清液用Sephadex G-50(超细颗粒)凝胶柱分离，以8mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5，含0.3mol/L氯化钠)洗脱，第一个洗脱主峰为神经毒素，第二个洗脱主峰为细胞毒素，收集各级分溶液冻干，即得眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素。经BCA法测定，其中眼镜蛇毒神经毒素为310mg，眼镜蛇毒细胞毒素为620mg。
实施例3
(1)取浙江产眼镜蛇蛇毒原液4.0g，分析纯40ml丙酮。将蛇毒原液置于研钵中，加7ml丙酮研磨成匀浆，以滤纸过滤匀浆，并用剩余的33ml丙酮洗涤，室温放置使丙酮挥发，即得蛇毒丙酮粉。
(2)将蛇毒丙酮粉溶解于40ml蒸馏水中，用50％的乙酸溶液调节pH至5.0，10000rpm离心10min(4℃)，取上清液。
(3)同实施例1步骤(3)，但PAA终浓度为3.2～3.5％。
(4)上清液用Sephadex G-50(超细颗粒)凝胶柱分离，以10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5，含0.3mol/L氯化钠)洗脱，第一个洗脱主峰为神经毒素，第二个洗脱主峰为细胞毒素，收集各级分溶液冻干，即得眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素。经BCA法测定，其中眼镜蛇毒神经毒素为307mg，眼镜蛇毒细胞毒素为614mg。

Claims (1)

1、眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法，其特征在于以下步骤：
(1)按重量份1份眼镜蛇毒原液使用体积份10份丙酮研磨、洗涤，操作时，先取适量丙酮研磨眼镜蛇毒原液成匀浆，以滤纸过滤匀浆，再用剩余丙酮洗涤，室温放置使丙酮挥发，即得眼镜蛇毒丙酮粉；
(2)眼镜蛇毒丙酮粉按1∶10(W/V)溶解于蒸馏水中，用50％的乙酸溶液调节pH至4.0～5.0，10000rpm4℃低温离心5～10min，取上清液；
(3)按上清液体积计，加入25％的聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)至终浓度为3～5％(W/V)，记录PAA加入量，4℃放置30～50min，2000rpm4℃低温离心3～5min，取沉淀溶解于适量蒸馏水中，用0.5mol/L碳酸钠溶液调pH至9.5～10.0，加氯化钠至终浓度为4～5％(W/V)，以已加入的PAA∶氯化钙溶液为1∶35(W/V)加入20％的氯化钙溶液并混匀，室温放置30min，以盐酸调节pH至4.0～5.0，室温放置30～50min，10000rpm4℃低温离心5～10min，取上清液；
(4)上清液用超细颗粒Sephadex G-50凝胶柱分离，以5～10mmol/L pH7.0～7.5含0.2～0.3mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱，第一个洗脱主峰为神经毒素，第二个洗脱主峰为细胞毒素，收集各级分溶液冻干，即分别为眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素。
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