CN107098956B - 眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用 - Google Patents

眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107098956B
CN107098956B CN201710148111.0A CN201710148111A CN107098956B CN 107098956 B CN107098956 B CN 107098956B CN 201710148111 A CN201710148111 A CN 201710148111A CN 107098956 B CN107098956 B CN 107098956B
Authority
CN
China
Prior art keywords
buffer solution
peak
hsc
ctx
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201710148111.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107098956A (zh
Inventor
张学荣
孙林
罗小玲
廖明
班建东
蔡凤桃
陈缨
农君
王秀南
余雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Medical University
Original Assignee
Guangxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Medical University filed Critical Guangxi Medical University
Priority to CN201710148111.0A priority Critical patent/CN107098956B/zh
Publication of CN107098956A publication Critical patent/CN107098956A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107098956B publication Critical patent/CN107098956B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种眼镜蛇毒细胞毒素‑4N的纯化制备方法，先采用DEAE‑SepharoseCL‑6B阴离子交换柱然后再利用SephadexG‑50凝胶层析柱、Macro‑prep High S阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取眼镜蛇毒细胞毒素‑4N活性最高的峰作为下步分离的样品。研究表明，应用本发明可以获得电泳纯度的CTX‑4N，其纯度高，活性高；HSC‑T6增殖抑制和凋亡实验证明，CTX‑4N对HSC‑T6细胞有杀伤作用，提示肝纤维化发展过程CTX‑4N会有抗肝纤维化的作用，具有重要的药用价值。

Description

眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法及其应用
技术领域
本发明属于眼镜蛇毒细胞毒素领域，尤其涉及一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N(CTX-4N)的纯化制备方法及其应用。
背景技术
眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的毒液，其化学成分复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物活性。眼镜蛇细胞毒素(Cytotoxin，CTX)又称眼镜蛇心脏毒素(Cardiototxin)，是眼镜蛇毒的重要活性物质之一，约占蛇毒蛋白25％～40％，具有心脏毒、抑制骨吸收、引起可兴奋组织去极化、抗菌等生物活性，并诱导多种肿瘤细胞凋亡，不同区域不同蛇种蛇毒中含有组分的生物效应不尽相同。
从眼镜蛇中分离纯化CTX是研究其理化性质、毒性反应、药理作用、作用机制等的必要前提。在分离纯化CTX方面，国内外学者大都采用阳离子交换柱层析和凝胶过滤相结合的方法进行分离纯化，据此发现了CTX-I，CTX-II，CTX-III，CTX-IV(SEQ.ID.No.2)，CTX-V等细胞毒素，然而，此种方法中，由于柱效的影响因素繁多，且很难加以控制，故重复性差，分离纯化后所得产品中往往含有其他蛋白物质，从而将影响细胞毒素生物活性的研究。
肝纤维化是慢性肝病损伤后，肝脏自我修复的一个过程`，造成肝纤维化的原因是大量的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝脏内沉积，改变了肝脏的结构，破坏了肝脏的生理功能；而使ECM过多的在肝脏累积的原因是肝星状细胞HSC的激活，激活的HSC细胞会产生大量的ECM；过多的ECM会使肝脏发生纤维化，继续发展为肝硬化，肝功能衰竭等疾病。因此在肝纤维化的过程中HSC细胞有至关重要的作用，如何抑制其激活或者使其发生凋亡在抗肝纤维化过程中有着重大关联。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、可控的眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
眼镜蛇毒细胞毒素-4N在制备抗肝纤维化药物中的应用。
上述眼镜蛇毒细胞毒素-4N按以下方法制备：先采用DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱然后再利用SephadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取眼镜蛇毒细胞毒素-4N活性最高的峰作为下步分离的样品。
选取眼镜蛇毒细胞毒素-4N活性最高的峰采用CCK-8实验方法，通过对HSC-T6细胞增殖抑制作用，用超纯水对所收集的各峰稀释后进行检验。
眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法，包括以下步骤：
(1)DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱洗脱分离；
(2)SephadexG-50凝胶层析柱洗脱分离；
(3)Macro-prep High S阳离子交换柱洗脱分离。
步骤(1)按以下操作进行：将DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱用A液平衡12h，将蛇毒样品上样于平衡好的DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱中，采用B液按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用；A液为0.05M的TRIS-HCL pH8.5缓冲液；B液为0.05M的TRIS-HCL pH8.5+0.5M NaCl的缓冲液。
样品的配制按以下操作进行：称眼镜蛇毒粗毒1g，加入10ml A液溶解，将其放在4℃冰箱中待其全部溶解后，10000rpm，4℃离心，20min；用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用。
步骤(2)按以下操作进行：将步骤(1)中得到的冻干蛋白粉末，加10ml 0.02M PBSpH7.5的缓冲液使其全部溶解，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2阳滤器过滤，待用；SephadexG-50凝胶层析柱用0.02M PBS pH7.5的缓冲液平衡12h，将前述蛋白样品上样于平衡好的SephadexG-50柱中，采用0.02M PBS pH7.5按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用。
步骤(3)按以下操作进行：将步骤(2)中得到的冻干蛋白粉末，加1ml PB缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤器后，上样于PB缓冲液平衡好的Macro-prep High S柱，采用缓冲液B按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干，-20℃冰箱保存备用；平衡用的PB缓冲液为0.02M的磷酸二氢钠和0.02M的磷酸氢二钠按比例137∶63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液pH为6.5；缓冲液B为0.02M PBpH6.5+0.5M NaCl；溶解用的PB缓冲液pH4.0。
针对目前眼镜蛇毒细胞毒素-4N制备存在的问题，发明人建立了一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法，先采用DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱然后再利用SephadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱依次进行分离，每次分离后选取眼镜蛇毒细胞毒素-4N活性最高的峰作为下步分离的样品。其中，通过CTX-4N对HSC-T6细胞的增值抑制作用，发明人发现了眼镜蛇毒分离纯化过程中CTX-4N活性最强峰，蛋白质质谱法鉴定确认为CTX-4N。通过实验，发明人还确定了CTX-4N作用HSC-T6细胞随着浓度增加其对增殖抑制作用越强，呈剂量-效应关系，并计算出IC50为12.836±0.045μg/ml。细胞凋亡实验证明，CTX-4N对HSC-T6细胞有凋亡作用，使其发生凋亡的最小浓度为4μg/ml。研究表明，应用本发明可以获得电泳纯度的CTX-4N，其纯度高，活性高；HSC-T6增殖抑制和凋亡实验证明，CTX-4N对HSC-T6细胞有杀伤作用，提示肝纤维化发展过程CTX-4N会有抗肝纤维化的作用，具有重要的药用价值。
附图说明
图1是DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱分离纯化结果。
图2是DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱分离纯化后收集各峰蛋白对HSC-T6细胞的增殖抑制率。
图3是Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化结果。
图4是Sephadex G-50凝胶层析柱分离纯化后收集各峰蛋白对HSC-T6细胞的增殖抑制率。
图5是Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化结果。
图6是Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化后收集各峰蛋白对HSC-T6细胞的增殖抑制率。
图7是SDS-PAGE电泳鉴定结果。
图8是pH4.3缓冲系统非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果。
图9是CCK-8检测CTX-4N作用HSC-T6细胞的增殖抑制率。
图10是PE Annexin V Apoptosis DetectionKit I检测CTX-4N作用HSC-T6细胞的凋亡率，图中：A：空白对照组，B：CTX-4N(1μg/ml)，C：CTX-4N(2μg/ml)，D：CTX-4N(4μg/ml)，E：CTX-4N(8μg/ml)，F：CTX-4N(16μg/ml)。
具体实施方式
1.材料与方法
1.1仪器与试剂
电子分析天平(英国Sartotius)，
Figure BDA0001244637790000031
start层析系统(GE公司)，L18-4584-01系统(美国PharmaciaBiotech公司)，YC-2层析实验冷柜(北京博医康实验仪器有限公司)，LGJ-18冷冻干机(北京松源华兴科技发展公司)，酶标仪(美国Biotek公司)，细胞培养箱(Thermo公司)，大鼠肝星状细胞HSC-T6(中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库)，DMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)，CCK-8试剂(日本同仁公司)，PE AnnexinV Apoptosis DetectionKit I(美国BD公司)，广西眼镜蛇毒冻干粉末(广西医科大学蛇毒所提供，眼镜蛇为爬行纲有鳞目蛇亚目眼镜蛇科眼镜蛇属，舟山眼镜蛇，拉丁名为najaatra)，其余试剂均为国产分析纯。
1.2实验方法
1.2.1HSC-T6细胞培养
将HSC-T6细胞用含有10％的胎牛血清的DMEM培养基培养，放置5％CO2，37℃的培养箱中培养。取生长状态良好的HSC-T6细胞接种于96孔板中，每孔细胞量为1000个，待用。
1.2.2样品配制
称取眼镜蛇毒粗毒粉末1g，加入10ml 0.05M TRIS-HCL pH8.5缓冲液溶解，放置4℃待其完全溶解后，10000rpm，4℃离心20min，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用。
1.2.3分离纯化方法
(1)DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱洗脱分离
将DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱用A液平衡12h，将蛇毒样品上样于平衡好的DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱中，采用B液按表1设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测HSC-T6细胞增殖抑制。选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用。A液为0.05M TRIS-HCL pH8.5的缓冲液，B液为0.05M TRIS-HCL pH8.5+0.5M NaCl的缓冲液。
(2)Sephadex G-50凝胶层析柱洗脱分离
将步骤(1)中得到的冻干蛋白粉末，加10ml 0.02M PBS pH7.5的缓冲液使其全部溶解，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用。Sephadex G-50凝胶层析柱用0.02MPBS(pH7.5)的缓冲液平衡12h，将蛋白样品上样于平衡好的Sephadex G-50柱中，采用0.02MPBS(pH7.5)按表2设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，做CCK-8实验方法检测HSC-T6细胞增殖抑制。选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干备用。
(3)Macro-prep High S阳离子交换柱洗脱分离
将步骤(2)中得到的冻干蛋白粉末，加1ml 0.02M PB缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤器后，上样于PB缓冲液平衡好的Macro-prep High S柱，采用缓冲液B按表3设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测HSC-T6细胞增殖抑制。选择抑制率比较显著的峰进行脱盐透析，冻干，-20℃冰箱中保存备用。平衡所用PB缓冲液为0.02M的磷酸二氢钠(NaH2PO4)和0.02M的磷酸氢二钠(Na2HPO4)按比例137∶63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液pH为6.5。缓冲液B为0.02M PB(pH6.5)+0.5M NaCl。溶解所用PB缓冲液pH4.0。
1.2.4HSC-T6细胞增殖抑制实验
收集各蛋白峰，分别按1，5，10，20μg/ml的浓度去作用于HSC-T6细胞24h后，用CCK-8试剂去检测。CCK-8实验方法检测心脏毒素-4N作用HSC-T6细胞后增殖抑制，观察其对细胞的增殖抑制的影响。
1.2.5SDS-PAGE电泳
将Macro-prep High S阳离子交换柱最后分离纯化后的最强活性CTX-4N峰冻干粉末，用超纯水溶解配成浓度为4mg/ml，取16μl，加上4μl蛋白上样缓冲液(厂家：碧云天；货号：P0015L)混匀，置于沸水中水浴10min，上样于12％的SDS-PAGE胶中，其中浓缩胶部分所用电压为80V，分离胶部分所用电压为120V，当蛋白上样缓冲液的蓝色条带跑至距分离胶底1cm处时，停止电泳。考马斯亮蓝R-250染色1h后脱色。
1.2.6pH4.3缓冲系统非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
将Macro-prep High S阳离子交换柱最后分离纯化后的最强活性CTX-4N峰冻干粉末，用超纯水溶解配成浓度为4mg/ml，取16μl，加上4μl蛋白上样缓冲液(取蒸馏水7.3ml，pH6.7缓冲液1.2ml，甘油1.0ml，0.5％(W/V)甲基绿溶液0.5ml，混匀，4℃保存；pH6.7缓冲液：取冰醋酸2.87ml，加水稀释，用1mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至6.7，加水稀释至100ml，4℃保存。)上样于12％的SDS-PAGE胶中，其中浓缩胶部分所用电压为80V，分离胶部分所用电压为120V，当绿色甲基绿接近胶板底部时，停止电泳。考马斯亮蓝R-250染色1h后脱色。
1.2.7蛋白质质谱法鉴定蛋白
将电泳后的蛋白质条带切割下来，送至苏州普泰生物技术有限公司，用Nano-LC-ESI-MS/MS方法进行鉴定。
1.2.8CTX-4N对HSC-T6细胞的增殖抑制作用
取生长状况良好的HSC-T6细胞，向96孔板内加入100μl细胞液，每孔细胞数量为1000个，每组设置5个复孔，在37℃，5％CO2的细胞培养箱内培养12h使细胞贴壁。细胞贴壁后取出96孔板，吸掉培养基，用1×PBS洗2两次后，按照实验分组设计分别加入不同浓度的CTX4N作用细胞，终浓度为0，1，2，4，8，16，32μg/ml。在培养箱中培养24h后，吸掉培养基，用1×PBS洗2两次，加入CCK-8试剂，继续孵育1h，测定A450OD值，根据公式算抑制率。抑制率＝[(对照组-实验组)/(对照组-空白组)]×100％(对照组：含有细胞的培养基、CCK-8、没有CTX4N，实验组：含有细胞的培养基、CCK-8、CTX4N，空白组：不含细胞和CTX4N的培养基、CCK-8)
1.2.9CTX-4N对HSC-T6细胞的凋亡作用
取生长状态良好的HSC-T6细胞，以2×105/孔的细胞密度接种于6孔板，放入5％CO2，37℃细胞培养箱，过夜培养待其贴壁后弃掉培养基，用1×PBS洗一次，加入含有CTX-4N的细胞培养去作用HSC-T6细胞，加入的CTX-4N的浓度为0，1，2，4，8，16μg/ml，每组设置3个复孔，在细胞培养箱中作用24h后，用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I试剂盒方法用流式细胞仪去检测。具体是用0.25％的胰酶(不含EDTA)消化细胞，2000rpm离心5min，去除上清液，用预冷的1×PBS洗2次，2000rpm离心5min，加入1Xbindingbuffer 200μl轻轻吹打均匀细胞使其成为单细胞悬液，每组细胞样本浓度约为1×106个/ml，取100μl细胞悬液加入到流式管中，加入5μl AnnexinV-PE和5μ17-AAD与细胞悬液轻轻混匀，避光孵育15min。孵育结束后每管加入400μl 1Xbinding buffer混匀，并且在1h内完成流式细胞仪检测。凋亡试剂染料加入细胞设置对照：(1)只加5μl AnnexinV-PE，(2)只加5μ17-AAD，(3)两者都不加。
2结果
2.1分离纯化结果
DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱分离结果如图1和对HSC-T6细胞的增殖抑制实验结果如图2所示，作用HSC-T6细胞后，第I峰具有最强的抑制活性；Sephadex G-50凝胶层析柱分离结果如图3和对HSC-T6细胞的增殖抑制实验结果如图4所示，作用HSC-T6细胞后，第III峰具有最强的抑制活性；Macro-prep High S阳离子交换柱分离结果如图5和对HSC-T6细胞的增殖抑制实验结果如图6所示，作用HSC-T6细胞后，第IV峰具有最强的抑制活性。
2.2电泳结果
Macro-prep High S阳离子交换柱分离得到的CTX-4N活性，经SDS-PAGE电泳，从图4的结果中可以确定其纯度已达到电泳纯度，分子量大约为10KDa。经pH4.3缓冲系统非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从图5的结果中可以确定其纯度已达到电泳纯度。
2.3蛋白质谱鉴定
将电泳后的蛋白条带切割下来，送至苏州普泰生物技术有限公司，用Nano-LC-ESI-MS/MS方法进行分析鉴定。经分析比较与文献(Long-Sen Chang S-KL andCC.Molecular Cloning and Evohtion of the Genes Encoding the Precursors ofTaiwan Cobra Cardiotoxin and Cardiotoxin-Like Basic Protein[J].BiochemicalGenetics 2004，Vol.42，Nos.11/12)报道一致，确定蛋白质为CTX-4N(SEQ.ID.No.1)，分子量约为9.605KD。
2.4对HSC-T6细胞增殖抑制的影响
表4结果其中1μg/ml浓度作用HSC-T6细胞的增殖抑制率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；2，4，8，16，32μg/ml浓度作用HSC-T6细胞的增殖抑制率与对照组相比差异具有统计意义(P＜0.01)。从表4和图9的结果可以确定CTX-4N作用HSC-T6细胞随着浓度增加对其增殖抑制作用越强，呈剂量-效应关系，并计算出IC50为12.836±0.045ug/ml。
2.5对HSC-T6细胞凋亡的影响
CTX-4N作用HSC-T6细胞凋亡率检测显示，不同浓度的CTX-4N作用HSC-T6细胞24h后，细胞存在不同浓度的凋亡如图10所示，空白对照细胞的凋亡率为4.05±0.09％，当CTX-4N浓度为1，2μg/ml，细胞凋亡率为4.22±0.11％和7.16±0.18％，与空白对照组相比差异没有统计学意义(P＞0.05)；当CTX-4N为4，8，16μg/ml时，凋亡率分别为：15.23±0.29％，22.21±0.74％，40.39±1.13％，与空白对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。从而得出CTX-4N使HSC-T6细胞发生凋亡的最小浓度为4μg/ml。
3结论
发明人建立一种从眼镜蛇毒分离纯化具有电泳纯度，活性高的细胞毒素-4N的方法并为其在抗肝纤维化中药理作用提供实验基础。
表1 DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱洗脱程序
Figure BDA0001244637790000071
表2 Spehadex G-50凝胶柱洗脱程序
Figure BDA0001244637790000081
表3 Macro-prep High S阳离子交换柱洗脱程序
Figure BDA0001244637790000082
表4 CCN-8检测不同浓度的CTX-4N作用HSC-T6细胞的增殖抑制率
Figure BDA0001244637790000083
SEQUENCE LISTING
<110> 广西医科大学
<120> 眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法及其应用
<130> 眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 81
<212> PRT
<213> naja atra
<400> 1
Met Lys Thr Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Val Thr Ile Val Cys Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Tyr Thr Arg Lys Cys Asn Lys Leu Val Pro Leu Phe Tyr
20 25 30
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Lys Asn Leu Cys Tyr Lys Met Phe Met Val
35 40 45
Ser Asn Leu Thr Val Pro Val Lys Arg Gly Cys Ile Asp Val Cys Pro
50 55 60
Lys Ser Ser Leu Leu Val Lys Tyr Val Cys Cys Asn Thr Asp Arg Cys
65 70 75 80
Asn
<210> 2
<211> 81
<212> PRT
<213> naja atra
<400> 2
Met Lys Thr Leu Leu Leu Thr Leu Val Val Val Thr Ile Val Cys Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Tyr Thr Arg Lys Cys Asn Lys Leu Val Pro Leu Phe Tyr
20 25 30
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Lys Asn Leu Cys Tyr Lys Met Phe Met Val
35 40 45
Ser Asn Leu Thr Val Pro Val Lys Arg Gly Cys Ile Asp Val Cys Pro
50 55 60
Lys Asn Ser Ala Leu Val Lys Tyr Val Cys Cys Asn Thr Asp Arg Cys
65 70 75 80
Asn

Claims (2)

1.眼镜蛇毒细胞毒素-4N在制备抗肝纤维化药物中的应用，其特征在于：所述眼镜蛇毒细胞毒素-4N为序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
2.一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的纯化制备方法，其特征在于所述眼镜蛇毒细胞毒素-4N为序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，该方 法包括以下步骤：
(1)DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱洗脱分离；
(2)SephadexG-50凝胶层析柱洗脱分离；
(3)Macro-prep High S阳离子交换柱洗脱分离；
步骤(1)按以下操作进行：将DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱用A液平衡12h，将蛇毒样品上样于平衡好的DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱中，采用B液按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择具有抑制作用的峰进行脱盐透析，冻干备用；所述A液为0.05M的TRIS-HCL pH8.5缓冲液；所述B液为0.05M的TRIS-HCL pH8.5+0.5M NaCl的缓冲液；
所述样品的配制按以下操作进行：称舟山眼镜蛇毒粗毒1g，加入10ml A液溶解，将其放在4℃冰箱中待其全部溶解后，10000rpm，4℃离心，20min；用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用；
步骤(2)按以下操作进行：将步骤(1)中得到的冻干蛋白粉末，加10ml 0.02M PBSpH7.5的缓冲液使其全部溶解，用0.45μm的滤器过滤，再用0.2μm滤器过滤，待用；SephadexG-50凝胶层析柱用0.02M PBS pH7.5的缓冲液平衡12h，将前述蛋白样品上样于平衡好的SephadexG-50柱中，采用0.02M PBS pH7.5按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择抑制率显著的峰进行脱盐透析，冻干备用；
步骤(3)按以下操作进行：将步骤(2)中得到的冻干蛋白粉末，加1ml PB缓冲液充分溶解后，10000rpm离心15min，取上清液，过0.22μm滤器后，上样于PB缓冲液平衡好的Macro-prep High S柱，采用缓冲液B按设置的洗脱程序进行洗脱，分别收集各蛋白峰，用CCK-8实验方法检测各峰对HSC-T6细胞的增殖抑制，选择抑制率显著的峰进行脱盐透析，冻干，-20℃冰箱保存备用；所述平衡用的PB缓冲液为0.02M的磷酸二氢钠和0.02M的磷酸氢二钠按比例137:63混合配制而成的缓冲液，混合后缓冲液pH为6.5；缓冲液B为0.02M PB pH6.5+0.5MNaCl；所述溶解用的PB缓冲液pH4.0。
CN201710148111.0A 2017-03-13 2017-03-13 眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用 Expired - Fee Related CN107098956B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710148111.0A CN107098956B (zh) 2017-03-13 2017-03-13 眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710148111.0A CN107098956B (zh) 2017-03-13 2017-03-13 眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107098956A CN107098956A (zh) 2017-08-29
CN107098956B true CN107098956B (zh) 2021-02-09

Family

ID=59675937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710148111.0A Expired - Fee Related CN107098956B (zh) 2017-03-13 2017-03-13 眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107098956B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109799335B (zh) * 2019-01-31 2022-04-01 陕西慧康生物科技有限责任公司 重组人溶菌酶中毕赤酵母宿主蛋白残留量的检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1740192A (zh) * 2005-09-08 2006-03-01 浙江大学 眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法
CN101717439A (zh) * 2009-12-04 2010-06-02 广州医学院 用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途
CN101717441A (zh) * 2009-12-04 2010-06-02 广州医学院 用于镇痛的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途
CN102552881A (zh) * 2012-03-02 2012-07-11 广西医科大学 眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用
CN104327176A (zh) * 2014-10-24 2015-02-04 张庆宇 一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物
CN105566482A (zh) * 2014-10-10 2016-05-11 贵州益佰制药股份有限公司 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺
CN105732796A (zh) * 2016-04-27 2016-07-06 广西医科大学 眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001245490A1 (en) * 2000-03-07 2001-09-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 26886, a novel carnitine acyltransferase family member and uses therefor

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1740192A (zh) * 2005-09-08 2006-03-01 浙江大学 眼镜蛇毒神经毒素和细胞毒素的分离纯化方法
CN101717439A (zh) * 2009-12-04 2010-06-02 广州医学院 用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途
CN101717441A (zh) * 2009-12-04 2010-06-02 广州医学院 用于镇痛的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途
CN102552881A (zh) * 2012-03-02 2012-07-11 广西医科大学 眼镜蛇毒神经生长因子在制备预防和治疗肝纤维化和肝硬化的药物中的应用
CN105566482A (zh) * 2014-10-10 2016-05-11 贵州益佰制药股份有限公司 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺
CN104327176A (zh) * 2014-10-24 2015-02-04 张庆宇 一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物
CN105732796A (zh) * 2016-04-27 2016-07-06 广西医科大学 眼镜蛇毒神经生长因子纯化制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Long-Sen Chang等.Molecular cloning and evolution of the genes encoding the precursors of taiwan cobra cardiotoxin and cardiotoxin-like basic protein.《Biochem Genet》.2004,第42卷 *
Molecular cloning and evolution of the genes encoding the precursors of taiwan cobra cardiotoxin and cardiotoxin-like basic protein;Long-Sen Chang等;《Biochem Genet》;20041231;第42卷;摘要，第432页第3段 *
眼镜蛇属(NaJa)毒液的主要功能组分研究进展;张迎征等;《延安大学学报》;20160331;第35卷(第1期);第1.1-1.5小节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107098956A (zh) 2017-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lestourgeon et al. Contractile proteins: major components of nuclear and chromosome non-histone proteins
Erlanson et al. Purification and characterization of two proteins with co-lipase activity from porcine pancreas
FOHLMAN et al. Taipoxin, an extremely potent presynaptic neurotoxin from the venom of the Australian snake taipan (Oxyuranus s. scutellatus) Isolation, characterization, quaternary structure and pharmacological properties
Jost et al. Annexin II contains two types of Ca2+-binding sites
Sidler et al. The primary structure of Bacillus cereus neutral proteinase and comparison with thermolysin and Bacillus subtilis neutral proteinase
JPH0662677B2 (ja) アンギオゲニン活性を有する精製蛋白及びその製造方法
Lechler et al. In vitro reconstitution of cortical actin assembly sites in budding yeast
Nascimento et al. Ocellatins: new antimicrobial peptides from the skin secretion of the South American frog Leptodactylus ocellatus (Anura: Leptodactylidae)
CN101914561B (zh) 一种具有抗菌和修复功能的融合蛋白及其生产方法和应用
Angulo et al. Differential susceptibility of C2C12 myoblasts and myotubes to group II phospholipase A2 myotoxins from crotalid snake venoms
Bonnet et al. Characterization of a human seminal plasma glycosaminoglycan-bearing polypeptide
Moon et al. Partial purification of neurofilament subunits from bovine brains and studies on neurofilament assembly.
CN110791517A (zh) 成纤维细胞生长因子21的制备、纯化及其结晶
CN107098956B (zh) 眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用
US8618051B2 (en) Vesiculins
KR20130128382A (ko) 보체 인자 ｈ의 정제 방법
CN109207460B (zh) 重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m2及制备方法
Grant et al. Rat liver prothrombin precursors: purification of a second, more basic form
Schoentgen et al. Main structural and functional features of the basic cytosolic bovine 21 kDa protein delineated through hydrophobic cluster analysis and molecular modelling
Schocher et al. Composition of purified mucopeptide from the wall of Aerobacter cloacae
Gedamu et al. Identification and isolation of protamine messenger ribonucleoprotein particles from rainbow trout testis
Lin et al. Expression and purification of a novel mannose-binding lectin from Pinellia ternata
CN112457377B (zh) 美洲大蠊多肽及其应用
Molugu et al. Separation of E. coli chaperonin groEL from β-galactosidase without denaturation
JPH06135996A (ja) アンジオジェニンの単離方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210209

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee