JPH0662677B2 - アンギオゲニン活性を有する精製蛋白及びその製造方法 - Google Patents

アンギオゲニン活性を有する精製蛋白及びその製造方法

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JPH0662677B2
JPH0662677B2 JP61502329A JP50232986A JPH0662677B2 JP H0662677 B2 JPH0662677 B2 JP H0662677B2 JP 61502329 A JP61502329 A JP 61502329A JP 50232986 A JP50232986 A JP 50232986A JP H0662677 B2 JPH0662677 B2 JP H0662677B2
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    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は、脈管形成因子及びその製造に関するものであ
る。さらに詳細には、本発明は新規な脈管形成性蛋白及
び細胞培養培地からのその製造に関するものである。
［従来の技術］ 脈管形成、すなわち血液脈管網の発達過程は充実性腫瘍
の成長に必須であり、かつ通常の傷治癒及び成長過程の
成分である。さらに、これは発育不全症、関節炎及び糖
尿性網膜症の病理生理学にも関与している。これは特定
の刺戟に向けられた新たな毛細血管の成長を特徴とす
る。内皮細胞の移動によって媒介されるこの成長は、内
皮細胞の有糸分裂とは独立して進行する。
脈管形成過程の原因となる分子メッセンジャが古くから
研究されている。グリーンブラット及びシュビック［J.
Natl.Cancer Inst、第41巻、第111〜124頁（1968）］
は、腫瘍誘発性の新脈管形成が拡散性物質によって媒介
されると結論している。その後、新脈管形成の誘発には
各種の可溶性媒介物が関与している。これらはプロスタ
グランジン［オイエルバッハ、「リンホカイン」、ピッ
ク・アンド・ランディー編、第69〜88頁、アカデミック
プレス社、ニューヨーク（1981）］と、ヒトウロキナー
ゼ［ベルマン等、Invest.Opthalm.Vis.Sci、第22巻、第
191〜199頁（1982）］、銅［ラジュ等、J.Natl.Cancer.
Inst、第69巻、第1183〜1188頁（1982）］、及び各種の
「脈管形成因子」を包含する。
脈管形成因子は腫瘍細胞、外傷液［バンダ等、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、第79巻、第7773〜7777頁（1982）；バ
ンダ等に係る米国特許第4,503,038号］、及び網膜細胞
［ダモア、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第78巻、第3068〜
3072頁（1981）］から誘導されている。腫瘍由来の脈管
形成因子は一般にその特性化が貧弱である。ホルクマン
等［J.Exp.Med.、第133巻、第275〜288頁（1971）］
は、ウォーカー256ラットの腹水腫瘍から腫瘍脈管形成
因子を単離した。この因子は毛細血管内皮細胞に関し有
糸分裂性であり、かつＲＮアーゼによって失活される。
チュワン等［バイオケミストリー、第12巻、第3159〜31
65頁（1973）］は、ウォーカー256腫瘍の非ヒストン蛋
白における有糸分裂活性かつアンギオゲニン活性を見出
した。この活性フラクションは、蛋白と炭水化物との混
合物であった。各種の動物及びヒト腫瘍は脈管形成因子
を生成することが示されているが［フィリップス及びク
マール、Int.J.Cancer、第23巻、第82〜88頁（197
9）］、この因子の化学特性は決定されなかった。ウォ
ーカー256腫瘍からの低分子量非蛋白成分もアンギオゲ
ニン性かつ有糸分裂性であることが示されている［ワイ
ス等、Br.J.Cancer、第40巻、第493〜496頁（197
9）］。400〜800ダルトンの分子量を有する脈管形成因
子がフェンセロー等によって均質性となるまで精製され
たが［ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第
256巻、第9605〜9611頁（1981）］、それ以上は特性化
されなかった。ヒト肺腫瘍細胞は高分子量のキャリヤと
低分子量の恐らく非蛋白の活性成分とからなる脈管形成
因子を分泌することが示されている［クマール等、Int.
J.Cancer、第32巻、第461〜468頁（1983）］。バレー等
［エキスペリエンチア、第41巻、第１〜15頁（1985）］
は、ウォーカー256腫瘍からの３種のフラクションに関
連するアンギオゲニン活性を見出した。トルバート等
［米国特許第4,229,531号］はヒト腺癌細胞ラインＨＴ
−29からの脈管形成因子の生成を開示しているが、この
物質は部分的にしか精製されずかつ化学的に特性化され
なかった。
脈管形成因子の単離は高性能液体クロマトグラフィー
［バンダ等、上記］；溶剤抽出［フォークマン等、上
記］；シリカゲル上でのクロマトグラフィー［フェンセ
ロー等、上記］；ＤＥＡＥセルロース［ワイス等、上
記］、又はセファデックス［チュワン等、上記］、及び
親和性クロマトグラフィー［ワイス等、上記］を使用し
ている。
脈管形成因子は傷治癒において重要な役割を演じ［レツ
ラ等、ＦＡＳＥＢアブストラクトNo.4309、第61回年次
総会、シカゴ（1977）］、かつ悪性腫瘍に対するスクリ
ーニング試験の開発に用途を有するので［クラグスバー
ン等、キャンサー・リサーチ、第36巻、第110〜114頁
（1976）、及びブレム等、サイエンス、第195巻、第880
〜881頁（1977）］、充分特性化された脈管形成因子の
均質調製物を得ることが明らかに有利であろう。
［発明の開示］ 簡単に言って、本発明はアンギオゲニン活性を有するヒ
ト起源のほほ純粋な蛋白を開示する。アンギオゲニン活
性を有しかつ12,500ダルトン〜17,500ダルトン（好まし
くは14,000〜15,000ダルトン）の分子量と9.5より大き
い等電点とを特徴とするほぼ純粋な蛋白についても開示
する。好適具体例おいて、この蛋白はヒト腺癌ＨＴ−29
細胞から誘導され、さらにアミノ酸配列分析により決定
して約14,193ダルトンの分子量と慣用の分析法により決
定して３Ｔ３細胞に対する有糸分裂活性の欠如とを特徴
とする。
関連する面において、本発明はアンギオゲニン活性を有
しかつ12,500ダルトン〜17,500ダルトン（好ましくは1
4,000〜15,000ダルトン）の分子量及び9.5より大きい等
電点を特徴とするほぼ純粋な蛋白と、医薬上許容しうる
キャリヤとからなる治療用組成物を開示する。
さらに、本発明の他の面は、アンギオゲニン活性を有し
かつ12,500ダルトン〜17,500ダルトンの分子量と9.5よ
り大きい等電点とを特徴とするほぼ純粋な蛋白からなる
診断用組成物をも開示する。
さらに本発明の他の面は、状態調節した細胞培養培地か
らアンギオゲニン活性を有するほぼ純粋な蛋白を得る方
法をも開示する。この方法は、（ａ）培地を処理して高
分子量の蛋白を除去し、（ｂ）処理された培地の１部を
陽イオン交換マトリックスに結合させ、（ｃ）結合した
部分をマトリックスから溶出させて溶出物を得、（ｄ）
溶出物を高性能液体クロマトグラフィーによって分画
し、かつ（ｅ）蛋白を含有するフラクションを回収する
ことからなっている。
本発明の他の面は、以下の詳細な説明及び添付図面を参
照して明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明 第１図はカルボキシメチルセメロースカラムから溶出し
た物質の高性能液体クロマトグラフィーの経過を示して
いる。溶出された物質は、0.08％のＴＦＡを含有するイ
ソプロパノール／アセトニトリル／水（５：５：４ ｖ
／ｖ／ｖ）の濃度勾配を用いる逆相高性能能液体クロマ
トグラフィーにより分画した。フラクションＣ及びＤは
脈管形成分析において、活性であった。
第２図はアンギオゲニンのアミノ酸配列を示している。
［発明を実施するための最良方式］ 本発明を説明する前に、以下で使用する幾つかの用語に
つき定義するのが有益であろう。
アンギオゲニン活性：これは組織における血液脈管発育
の化学刺戟である。これは一般に、各種の細胞種類によ
って産生される拡散性物質に関連する。アンギオゲニン
活性は、雛の胚芽絨網尿膜分析［ナイトン等、Br.J.Can
cer、第35巻、第347〜356頁（1977）、その開示全体を
参考のためここに引用する］及び（又は）ウサギ角膜移
植分析［ランガー及びフォークマン、ネィチャー、第26
3巻、第797〜800頁（1976）、その開示全体を参考のた
めここに引用する］における陽性反応によって特性化す
ることができる。
有糸分裂活性：これは細胞分裂の化学刺戟である。この
活性は、３Ｔ３細胞中へのＨ３−チミジン組み込みの刺
戟によって特性化される［クルガスバーン等、Exp.Cel
l.Res、第105巻、第99〜108頁（1977）、その開示全体
を参考のためここに引用する］。
リボヌクレアーゼ活性：これは、たとえば28Ｓ及び18Ｓ
リボソームＲＮＡのような大型ＲＮＡ分子から低分子量
のものへの分解によって特性化される。
上記したように、脈管形成因子は各種の原料から誘導さ
れているが、従来はまだ同質性まで精製されておらずか
つその化学組成及び物理的性質についても特性化されて
いない。本明細書で説明する新規な多段階法を使用する
ことにより、腫瘍細胞は分子量約12,500〜17,500ダルト
ン及び9.5より大きい等電点を有しかつアンギオゲニン
活性を有する蛋白を産生することが突き止められた。こ
の方法により得られるアンギオゲニン性物質は慣用の分
析法により決定して単一の均質蛋白成分より実質的にな
り、治療用及び診断用組成物に使用するのに適してい
る。
腫瘍細胞が本発明のアンギオゲニン性蛋白の好適原料で
あるが、たとえば網膜細胞などの正常な細胞も脈管形成
因子を産生することが知られている。特に好適な細胞ラ
インはヒト腺癌細胞ラインＨＴ−29である［フォー及び
トレンペ、「インビトロにおけるヒト腫瘍細胞」、フォ
ー編、第115〜160頁、プレナム出版、ニューヨーク（19
75）］。詳細にはこの細胞ラインの分離株はＡＴＣＣ
ＨＴＢ38として及びＡＴＣＣ ＣＲＬ8905として寄託さ
れている。これらの細胞は公知方法にしたがって、たと
えばダルベッコの改変イーグル培地又はその他の適する
培地における単層培養物として培養することができる。
好適培地は、２mMのＬ−グルタミンと５％の加熱失活さ
せたウシ胎児血清とを補充したダルベッコの改変イーグ
ル培地（ＤＭＥ／５）である。この培地を定期的に交換
し、かつ細胞を公知方法にしたがって継代培養する。
細胞培地からのアンギオゲニン性蛋白の単離を容易化す
るため、これら細胞を融合性成長（confluent growth）
に達した後に血清を含有しない保持培地に移すのが好適
である。好適保持培地は、血清を含有しないが５mMの濃
度のＬ−グルタミンを含有するＤＭＥ／５である。
細胞が培養されており或いは保持されている状態調節培
地として知られる培地を次いで細胞から除去し、かつ好
ましくは濾過して細胞残骸を除去し、次いで高分子量
（一般に50,000ダルトンより大）の蛋白を除去すべく処
理する。好適な処理方法は、たとえば５％（ｖ／ｖ）の
濃度までの氷酢酸の添加による酸性化に続く遠心分離で
ある。さらに、この濾過されかつ酸性化された培地をそ
の後の精製工程の前に濃縮するのが望ましい。
次いで、濾過されかつ処理された培地を陽イオン交換マ
トリックスでクロマトグラフにかける。この種の好適な
陽イオン交換マトリックスはカルボキシメチルセルロー
ス（ＣＭセルロース）である。酸性化されかつ状態調節
された培地を凍結乾燥し、0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（pH6.6）で再構成しかつマトリックスに施こすのが
好適である。これらの条件下において、脈管形成因子は
マトリックスに結合し、かつ好ましくは１ＭのＮａＣｌ
を含有する同じ緩衝液で溶出させる。
陽イオン交換マトリックスからの溶出液を、さらに逆相
高性能能液体クロマトグラフィーによって分画する。こ
の溶出物を凍結乾燥し、たとえば水中の0.1％トリフル
オロ酢酸（ＴＦＡ）のような適する溶媒で再構成し、か
つ所定濃度勾配の第２溶媒をカラムに施こして溶出させ
る。0.08％ＴＦＡを含有する直線的濃度勾配のイソプロ
パノール／アセトニトリル／水（５：５：４ ｖ／ｖ／
ｖ）が好適である。ＨＰＬＣカラムから溶出された物質
を次いで透析して溶媒を除去し、凍結乾燥しかつ再構成
する。
好適具体例において、陽イオン交換マトリックスからの
溶出物を凍結乾燥し、たとえば0.01ＭトリスpH8.0のよ
うな適当な溶媒で再構成しかつ陽イオン交換ＨＰＬＣカ
ラムに施こす。次いで、結合した物質を、たとえば0.01
ＭトリスpH8.0における直線的濃度勾配のＮａＣｌを加
えることによりカラムから溶出させて、第２の溶出物を
生成させる。この第２の溶出物を次いで上記と同様な逆
相ＨＰＬＣによって分画する。
他の好適具体例においては、再構成したＨＰＬＣカラム
の溶出液を第２の陽イオン交換クロマトグラフィー工程
によって精製する。好適クロマトグラフィーマトリック
スは、上記の条件下で使用されるＣＭセルロースであ
る。マトリックスから溶出した物質を凍結乾燥しかつ水
で再構成する。
ＨＰＬＣカラムからの或いは第２の陽イオン交換クロマ
トグラフィー工程からの再構成溶出液を、次いで生物学
的活性につき分析して活性フラクションを同定する。ア
ンギオゲニン活性のための幾つかの分析法は当業界で周
知されており、ニワトリ胚絨網尿膜分析［ナイトン等、
Br.J.Cancer、第35巻、第347〜356頁（1977）］及び角
膜移植分析［ランガー及びフォークマン、ネィチャー、
第263巻、第797〜800頁（1976）］を包含する。
ＨＴ−29細胞を出発物質として使用した場合、２種の活
性フラクションがＨＰＬＣカラムから得られた。一方の
フラクションはＭｒ〜16,000の多量蛋白成分と少量のＭ
ｒ〜14,000の蛋白とを含有する。第２のフラクションは
アンギオゲニンと呼ばれているＭｒ〜14,000の単一の蛋
白物質を含有する。他の分析において、アンギオゲニン
は9.5より大きい等電点と、アミノ酸配列分析により約1
4,193ダルトンの分子量とを有することが判明した。驚
くことに、従来記載された大抵の脈管形成因子と異な
り、アンギオゲニンは慣用の分析において有糸分裂性で
ない。アンギオゲニンのアミノ酸配列をも決定し、これ
はパンクレアチンリボヌクレアーゼに対し35％相同であ
ることが判明した。さらに、アンギオゲニンは高度に特
異的なリボヌクレアーゼ活性を有することも示された。
遺伝子の多形質性により或いは蛋白自身若しくはその先
駆体のインビボ修飾により他の種類のアンギオゲニンも
存在しうることが了解されよう。さらに、本発明による
アンギオゲニン性蛋白はインビトロの方法によって修飾
することもでき、依然としてアンギオゲニン活性を保持
することができる［バレー等、上記］。たとえば、リボ
ヌクレアーゼに対する相同性に基づき、アンギオゲニン
のジスルフィド結合（Ｃｙｓ−26〜Ｃｙｓ−81、Ｃｙｓ
−39〜Ｃｙｓ−92、Ｃｙｓ−57〜Ｃｙｓ−107）と、位
置13及び114におけるヒスチジンと、位置40におけるリ
ジンとを単独で或いは組み合せて化学的に修飾して、分
子の生物学的活性を変化させることもできる。生物学的
活性の増大は、より低レベルの投与量の使用を可能にす
る。アンギオゲニン活性の低下した或いはアンギオゲニ
ン活性を全く持たないが或る種の構造上の特徴を保持す
る分子は外皮細胞又はその他の細胞上のリセプタに結合
することができ、かつ作用部位を遮蔽することによって
天然アンギオゲニンの作用に対する拮抗剤を形成し、ア
ンギオゲニンに関連する病的状態の処置方法を与えるこ
ともできる。この種の改変された種類のアンギオゲニン
も本発明の範囲内である。詳細には、殆ど又は全くアン
ギオゲニン活性を持たないがＣｙｓ−２６；Ｃｙｓ−３
９；Ｃｙｓ−５７；Ｃｙｓ−８１；Ｃｙｓ−９２；Ｃｙ
ｓ−１０７；Ｈｉｓ−１３；Ｈｉｓ−１１４又はＬｙｓ
−４０の１つ若しくはそれ以上に対する修飾以外は実質
的に第２図に示したすべての配列を保持する蛋白質も本
発明の範囲内にある。
本発明にしたがって生成されたアンギオゲニン性蛋白を
使用して、これらを適するキャリヤと組合せることによ
り治療用若しくは診断用組成物を製造することができ
る。これら治療用組成物を使用して、たとえば哺乳動物
における血液脈管網の発育を促進し、心臓発作の後の側
副循環を誘起させ、或いはたとえば関節若しくはその他
の部位における外傷治癒を促進することができる。好ま
しくは、本発明による治療用組成物は静脈内或いは外傷
部位に対する直接的な局部塗布によって投与される。た
とえば、しばしばスポーツ関連の外傷若しくは骨関節炎
に見られるように膝若しくは肩の半月に外傷が生じた場
合、この外傷の部位におけるアンギオゲニン蛋白の注射
は、引裂かれ又は外傷を受けた繊維軟骨物質の治癒を促
進することができる。有効投与量は、状態の症状及び目
標組織に応じて変化する。さらに、アンギオゲニン性蛋
白は、この蛋白を用いて抗体の存在を分析し或いは免疫
診断試薬として使用するための抗体を生成させることに
より、悪性腫瘍の存在をスクリーニングする診断用途を
も有する。この蛋白を含有する診断用組成物は、抗原−
抗体複合物を生成させるのに適する条件下で生物学的試
料と共に培養することができる。複合体の形成（すなわ
ち試料中の抗体の存在）を次いで検出する。この種の分
析技術は当業界で周知されており、たとえば酵素結合免
疫吸着分析［フォラー等、「酵素結合免疫吸着分析」、
ダイナテク・ラボラトリース社（1979）］又はウェスタ
ンブロット分析［たとえばトービン等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、第76巻、第4350頁（1979）］がある。同様
に、アンギオゲニン性蛋白に対する抗体を含む診断用組
成物を生物学的試料における蛋白の存在を分析するため
に使用することができる。さらに、アンギオゲニン性蛋
白を使用して、脈管形成に関連する障害を処置するのに
有用な脈管形成阻止剤を開発することもできる。
実験 以下の実施例は例示の目的であって、限定を意味するも
のでない。
材料及び方法 ＣＭ−セルロース（ＣＭ−52級）はワットマン・リミテ
ッド社の製品とした。透析は全て分子量6,000〜8,000の
切断チューブ（Spectra/Por）を用いて行なった。脱イ
オンされた無菌水はミリＲＯ−20逆浸透／ミリＱ水精製
装置によって供給した［ミリポア・コーポレーション社
・レッドフォード・マサチューセッツ州］。ＨＰＬＣ級
の水はＪ．Ｔ．ベーカー・ケミカル社から得られた。ペ
プスタチンＡ及び鶏卵−卵白リゾチームはシグマ・ケミ
カル・カンパニー社［セントルイス・ミズリー州］から
のものとした。アセトニトリル［Ｊ．Ｔ．ベーカー・ケ
ミカル・カンパニー社］及びイソプロパノール［ミリポ
ア・ウォーター・アソシエーツ社］はＨＰＬＣ級のもの
とした。
配列分析試薬はベックマン・インストロメンツ社から得
たものとし、かつ配列決定溶剤はブルディック・アンド
・ジャクソン・ラボラトリース社・ムスケゴン・ミシガ
ン州からのものとした。
蛋白溶液を取り扱うために使用したガラス器具は、常に
ジクロルジメチルシラン［シグマ・ケミカル・カンパニ
ー社］で処理して常にシリコーン処理した。
脈管形成はナイトン等（上記）のニワトリ胚絨網尿膜
（ＣＡＭ）法を用い、前記のように改変［バレー等、エ
キスペリエンチア、第411巻、第１〜15頁（1985）］し
て日常的に分析した。陰性若しくは陽性［すなわち典型
的「スポークホイール」パターンの出現（フォークマ
ン、キャンサー・リサーチ第34巻、第2109〜2113頁（19
74））］の反応を１日後、２日後及び３日後に顕微鏡分
析し、試料の希釈につき生存する卵個数当りの陽性アン
ギオゲニン反応の数として記録した。統計分析は、２日
目のデータに基づいて行なった。評価は陽性若しくは陰
性としてのみ行なったので、解析はベルヌーリ試験を構
成し、二項分布として解析することができる［ケンダル
及びスチュアート「進歩した統計理論、第Ｉ巻、第３
版、第120頁、ハフナー、ニューヨーク（1969）］。一
連の1,834個の対照における陽性反応の頻度は0.0676で
あり（124個が陽性かつ1,710個が陰性）、標準偏差は0.
0059であり［ケンダール及びスチュアート「進歩した統
計理論、第II巻、第３版、ハフナー、ニューヨーク（19
73）］、上側及び下側の0.1％信頼限界は0.0857及び0.0
495である。特記しない限り、上限値0.0857をＮ個の卵
の試験群に関する陽性結果を得る確率として使用した。
この決定は試料を実際に活性であるのに不活性として分
類するチャンスを増大させる一方、不活性試料を活性と
見るチャンスを減少させる。Ｎ＝２〜Ｎ＝30に対する陽
性結果を示す累積確率の表を0.0857を陽性結果の確率と
して用いることにより作成し、試験結果をこれらの表に
基づいて解釈した。30より大きいＮの値については、不
完全ベータ関数［ケンダール及びスチュアート、1969、
上記］を用いて評価した。得られた確率を卵１個当りに
施こした試料の重量に対しプロットして、同様な投与量
反応曲線を作成した。しかしながら、これらのプロット
は定量的意味では解釈できず（すなわち所定投与量から
50％反応が生じうる）、寧ろ陽性反応が有意となる範囲
及び下限値を与えるものと解釈される。５％の有意レ
ベルが、活性と見られる試料につき得られねばならな
い。累積確率は個別的事象を意味するので、これら自身
も個別的であり、したがって一般に不等式のみが特定さ
れる。
さらにウサギ角膜においても、エルバックスペレットの
代りにメチルセルロースを移植物として用いる確立され
た方法の変法［ランガー及びフォークマン、上記］を用
いてアンギオゲニン活性を評価した。５日毎に立体顕微
鏡観察を行なって、角膜縁部から試料移植物の方向へ延
びる侵潤性血管を検出した。
陽イオン交換ＨＰＬＣは、20ｍＭリン酸ナトリウム（pH
7.0）で平衡化したシンクロパックＣＭ300カラム（250
×4.1mm、シンクローム・インコーポレーション社）を
0.8ml/minの流速で用いた。溶出は、上記緩衝液におけ
る直線的濃度勾配のＮａＣｌを用いて行なった。使用し
た標準はリボヌクレアーゼＡ（ｐＩ＝9.5）、チトクロ
ームｃ（ｐＩ＝10.2）及びリゾチーム（ｐＩ＝10.5）と
した。
分析等電点評価は、予備成形プレート（ＰＡＧプレー
ト、pH範囲3.5〜9.5；ＬＫＢ）を用いてＬＫＢ2117マル
チフォール装置で行なった。ゲルは製造業者の推奨にし
たがってクーマシー青で染色した。使用した標準はリボ
ヌクレアーゼＡ、チトクロームｃ及びリゾチームとし
た。
蛋白濃度は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として
用いるブラッドフォードの染料結合法によって決定した
［アナリチカル・バイオケミストリー、第72巻、第248
〜254頁（1976）］。
６Ｍグアニジン塩酸塩を含有するＰＢＳで平衡化したＬ
ＫＢウルトロパックＴＳＫ−Ｇ3000ＳＷカラム（300×
7.5mm）にて0.5ml/minの流速でゲル濾過ＨＰＬＣを行な
った。カラム流出物を206nmにて監視した。ＢＳＡ（Ｍ
ｒ＝25,000）、リゾチーム（Ｍｒ＝14,400）及びインシ
ュリン（Ｍｒ＝6,000）を標準として使用した。
実施例 １：アンギオゲニンの精製 ヒト結腸直腸腺癌ラインＨＴ−29［ホッシュ・アンド・
トレンペ、上記］からの細胞をＴ−フラスコ［コスター
社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州］における単層
培養物として37℃で日常的に増殖させ、その際２mMのＬ
−グルタミンと５％の熱失活したウシ胎児血清（ＦＭ
Ｓ）とを補充した4.5g／のグルコースと50mg／のゲ
ンタマイシンと500g／のフンギゾーン（ＤＭＥ）とを
含有するダルベッコの改変イーグル培地［Ｍ．Ａ．バイ
オプロダクツ社、ウォーカースビル、ミズーリ州］（Ｄ
ＭＥ／５）を用いて、7.5％ＣＯ２（空気中）の湿潤雰
囲気中で行なった。培地を２〜３日毎に交換し、かつ細
胞を標準トリプシン処理法を用いて継代培養した。
ＤＭＥ／５培養物からの細胞１×10８個を、次いで1.5
のＤＭＥ／５を含有する細胞工場［バンガード・イン
ターナショナル・インコーポレーション社、ネプチュー
ン、ニュージャーシー州］に接種し、かつ空気雰囲気内
の湿潤化した7.5％ＣＯ２にて37℃で融合するまで付着
繁殖させた。次いで、ＤＭＥ／５を、ＦＢＳを含有しな
いが５mMのＬ−グルタミン濃度を有するＤＭＥよりなる
1.5の血清を含まない保持培地で交換した。この保持
培地を２〜３日間隔で交換し、かつ７日後に行なった全
ての回収物を下記するように処理した。
細胞残骸を、血清を含有しない状態調節培地からワット
マン40濾紙及びワットマン934−ＡＨガラスマイクロ繊
維フィルタに順次に通過させて除去した。濾液に５％
（ｖ／ｖ）の濃度となるまで氷酢酸を添加した。血清を
含まない状態調節された酸性化培地をペプスタインＡ
（５mg／）で処理し、凍結させ、−20℃で貯蔵し、次
いで解凍させかつワットマン934−ＡＨマイクロ繊維フ
ィルタで濾過して清澄化させた。次いで、濾液をＨＰ２
（2,000の分子量切断物）中空繊維フィルタ［アミコン
・コーポレーション社、レキシントン・マサチューセッ
ツ州］を装着したモデルＤＣ２型中空繊維透析器／濃縮
器装置で200倍濃縮し、水に対して透析し、そして凍結
乾燥した。
この血清を含有しない状態調節された凍結乾燥の酸性化
培地を100mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.6）に溶解
させかつこれに対して１晩透析し、濾過し、かつフェッ
テ等により記載されたＣＭセルロースカラム［バイオケ
ミストリー、第24巻、第965〜975頁（1985）］に施し
た。典型的な実験は6.3mgの出発蛋白を使用し、そこか
ら3.2mgのフラクションＣＭ１（未結合）と2.3mgのフラ
クションＣＭ２（結合しかつ１Ｍ ＮａＣｌで溶出）を
得た。両フラクションを徹底的に水に対して透析しかつ
凍結乾燥した。
ＣＭ２フラクションからのアンギオゲニン物質の精製
は、モデル440吸光検出器（254nm）とＬＫＢ2138検出器
（206nm）と２種のモデル6000溶剤供給装置とＷＩＳＰ7
10Ａ自動試料供給器とデータモジュール及びシステム制
御装置とよりなるウォータース・アソシエーツ社の液体
クロマトグラフィー装置を用いる逆相ＨＰＬＣによって
行なった。分画はオクタデシルシランのシンクロパック
ＲＰ−Ｐカラム（粒子寸法10μｍ、250×4.1mm）［シン
クロム・インコーポレーション社、リンデン、インジア
ナ州］を用いて、１ml／minの流速にて室温で行なっ
た。カラム流出液を206nm及び254nmにて監視した。分画
すべき凍結乾燥した調製物（ＣＭ２）を水中の0.1％
（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（溶媒Ａ）で再
構成し［マホニー・アンド・ハーモドソン、ジャーナル
・バイオロジカル・ケミストリー、第255巻、第11199〜
11203頁（1980）］、そして自動試料注入器によってカ
ラムに施した。これらカラムを、0.08％のＴＦＡを含有
するイソプロパノール／アセトニトリル／水（５：５：
４ ｖ／ｖ／ｖ）（溶媒Ｃ）を最終緩衝液として使用す
ることにより、直線濃度勾配で120分間溶出させた。こ
れらの条件下でアンギオゲニン活性は試料注入後約80分
間で溶出した（全有機濃度〜30％）。溶出の後、プール
したフラクションを水に対して透析し、凍結乾燥し、か
つ生物学的分析用に再構成した。カラム溶出液につき直
接に化学分析を行なった。
それぞれ29％及び30％の全有機濃度にて溶出したプール
Ｃ及びＤからの物質（第１図参照）を、積層ゲルを省略
した以外は実質的にレムリにより記載された15％ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させた［ネィーチ
ャー、第227巻、第680〜685頁（1970）］。これらのゲ
ルを市販キット［ビオーラド・ラボラトリース社、リッ
チモンド、カリホルニア州］を用いて銀染色した。プー
ルＤは、見掛けＭｒ〜14,000を有する単一物質を含有す
ることが判明した。この物質をアンギオゲニンと命名し
た。プールＣはＭｒ〜16,000の多量蛋白成分と少量のＭ
ｒ〜14,000の物質とを含有した。プールＤにおけるアン
ギオゲニンの収量は状態調節培地１当り〜0.5μｇで
あった。
同様な投与量−反応分析をニワトリ胚ＣＡＭ分析により
２種の活性フラクションについて行なった。５μｇのプ
ールＣ若しくはＤ（＋20μｇのキャリヤとしてのリゾチ
ーム）を上記と同様に15％ゲルで操作した。比較レーン
は20μｇのリゾチームのみを含有した。電気泳動の後、
ゲルをそれぞれＰＢＳにおける20ｖ／ｖ％イソプロパノ
ールで15分間づつ２回洗浄してＳＤＳを除去し［ブラン
ク等、アナリチカル・ケミストリー、第120巻、第267〜
275頁（1982）］、次いで滅菌水により10分間づつ３回
洗浄してイソプロパノールを除去した。ゲルスライス物
（2.5mm）を、0.02％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含有する５m
Mのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）200μｌにおいて7
2時間培養し、次いで上清をアンギオゲニン活性につき
ＣＡＭで直接に分析した。酵素的に決定されたリゾチー
ムに対する抽出効率は20％であった。アンギオゲニン
（プールＤ）は290ng／卵１個〜0.5ng／卵１個の範囲
（すなわち20ｐモル〜35ｆモル／卵１個）の範囲のレベ
ルにて0.01％ｐ５％で再現性をもって活性であり、
反応に対する主たる変化は1.4ng／卵１個未満で生じ
た。
さらに、保存物Ｃは活性であったが、プールＤよりも低
い活性であった。すなわちプールＣは５％の有意レベ
ルで僅かに40ng／卵１個より高い値に達した。これらの
データは、プールＣにおけるアンギオゲニン活性がこの
領域内で検出されるＭｒ〜14,000の物質に基づいている
ことを示唆している。
さらに、アンギオゲニンは、ウサギ角膜のポケットに移
植すると新たな血管の成長を誘発した。縁部から試料移
植の領域方向及び領域内への新たな血管の相当な外部成
長を見ることができる。均等量のリゾチームを用いる比
較実験では血管成長が観察されなかった。陽性アンギオ
ゲニン反応が、〜50ng（3.5ｐモル）のレベルにてウサ
ギ角膜内で再現的に観察される。
有意レベル＜0.2％におけるＣＡＭアンギオゲニン活性
は、アンギオゲニン／リゾチーム混合物の15％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥの後、Ｍｒ〜14,000に相当するゲルスライス物
の電気泳動領域から溶出した。リゾチームのみを含有す
る隣接比較レーンからは、これらスライス物から活性
（有意レヘゲル＞50％）が溶出されなかた。
さらに、リボヌクレアーゼ活性につきアンギオゲニンを
分析した。上記のように精製した物質を、フェッテ等
（上記）により記載されたようなＣＭセルロースにてさ
らに精製工程にかけた。結合したフラクションを溶出さ
せ、凍結乾燥しかつ水で再編成した。再構成したアンギ
オゲニンの１部を、30mMＮａＣｌを含有する30mMトリス
pH7.5におけるＨＴ−29細胞ＲＮＡ［チャーグウィン
等、バイオケミストリー、第18巻、第5294頁（1979）の
方法により単離］に加えた。この混合物を37℃にて１時
間培養し、かつ反応を約４倍容量の26mMのＭＯＰＳと6.
5mMの酢酸ナトリウムと1.3mMのＥＤＴＡと65％のホルム
アミドと８％のホルムアルデヒドとの添加によって停止
させた。これら試料を、レーラッハ等［バイオケミスト
リー、第16巻、第4743頁（1977）］の方法を用いて1.1
％アガロースゲルでの電気泳動により分析した。ＲＮＡ
を臭化エチジウム染色によって可視化した。アンギオゲ
ニンを含有しない比較試料は、28Ｓ及び18Ｓのリボソー
ムＲＮＡに相当する２つの主たるＲＮＡバンドを含有し
た。増加量のアンギオゲニンを含ませると、287Ｓ及び1
8Ｓバンドのレベルが低下しかつより低い分子量の物質
の増加が観察された。少なくとも１個の新しい個々のバ
ンドをアンギオゲニンと共に長時間培養した。これらの
結果は、アンギオゲニンが28Ｓ及び18Ｓの両リボソーム
ＲＮＡにおいて極く少数の切断物（恐らく＜５）しか作
成しえないリボヌクレアーゼであることを示している。
細胞ラインＨＴ−29からの分離株をアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに寄託して、受託番号ＡＴ
ＣＣNo.ＣＲＬ8905を得た。
実施例 ２：アンギオゲニンの化学的特性化 アンギオゲニンの分子量を、グアニジン塩酸塩の存在下
におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥとゲル濾過ＨＰＬＣとの両者
で測定した。両者は14,000のＭｒを与えた。アミノ酸配
列分析のため、蛋白をｎ−プロパノールにおける0.25Ｍ
重炭酸ナトリウムにおけるトリブチルホスフィン（水中
50％）で還元し、かつ１，３−プロパンスルホン［シグ
マ・ケミカル・カンパニー社］によりルエグ・アンド・
ルジンガーの方法にしたがってアルキル化した［Int.J.
Pept.Prot.Res、第６巻、第447〜456頁（1974）］。ア
ルキル化した試料を、水中17.9％（ｖ／ｖ）のアセトニ
トリルと17.9％（ｖ／ｖ）のイソプロパノールと0.1％
（ｖ／ｖ）のＴＦＡとにおいてＩ−125ＨＰＬＣカラム
（ウォータース・アソシエーツ社）でのクロマトグラフ
ィーによって脱塩した。モーアにしたがって過蟻酸酸化
を行なった［ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第238巻、第235〜237頁（1963）］。凍結乾燥した
試料を６Ｎ塩酸及び0.1％フェノールにより110℃にて減
圧下に20時間加水分解した［サンガー・アンド・トンプ
ソン、Biochem.Biophys.Acta、第71巻、第468〜471頁
（1963）］。加水分解物を減圧下に25〜35℃にて乾燥さ
せ、クエン酸緩衝液（pH2.2）中に再溶解させかつニン
ヒドリンを試薬として用いることによりデュラムＤ−50
0アミノ酸分析器で分析した。定量にはヒューレット・
パッカード3390Ａ型積算装置を使用した。
ベックマン890Ｃ型配列分析装置を用いかつベックマン
プログラム121078による0.1Ｍクワドロール結合緩衝剤
を用いて上記したように［フェッテ等、上記］、300〜
3,000ｐモルの蛋白につき自動化エドマン分解を行なっ
た。無水ヒドラジン［ピアス・ケミカル・カンパニー
社、ロックフォード・イリノイ州］により80℃で減圧下
に18時間ヒドラジン分解し［アカボリ等、日本化学会
誌、第25巻、第214〜218頁（1952）］、次いでこの加水
分解物を「ピコ−タグ」法の直接的分析［ウォタース・
アソシェーツ社、ビドリングマイヤー等、ジャーナル・
クロマトグラフィー、第336巻、第93〜104頁（1984）］
によって200ｐモルの蛋白につきカルボキシ末端測定を
行なった。
天然又は過蟻酸酸化した蛋白につき行なった６サイクル
のエドマン分解は遊離末端基を示さなかった。単一のカ
ルボキシル末端アミノ酸プロリンのみがヒドラジン分解
後に見られた。さらに、２−メルカプトエタノールの存
在下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
ってアンギオゲニンを検査した際、より低分子量のサブ
ユニットは見られなかった。これらのデータを総合する
と、アンギオゲニンは一本鎖ポリペプチドであることが
示される。アミノ酸分析は、アンギオゲニンのＭｒ値が
〜14,400であることを示した。
等電点分析（ＩＥＦ）及び陽イオン交換ＨＰＬＣは、ア
ンギオゲニンが極めて塩基性であることを示した。これ
はＩＥＦの際に前線まで移動し、9.5より大きい等電点
を示す。さらに、アンギオゲニンは陽イオン交換ＨＰＬ
Ｃにおいてリゾチーム（ｐＩ＝105）の後に溶出する。
この性質は使用した条件下でＣＭセルロースに対するそ
の結合に符合し、高含有量の塩基性アミノ酸と一緒に側
鎖カルボキシル基の多くがアミド化されることを示唆し
ている。
トリプシン分解ペプチドの単離 12〜66μｇのロットにおけるアンギオゲニンを、ＨＰＬ
Ｃ精製したトリプシン［チタニ等、アナリチカル・バイ
オケミストリー、第123巻、第408〜412頁（1982］によ
り100μｌの0.1Ｍ Ｎ−エチルモルホリン緩衝液（pH8.
5）中で２〜３重量％まで窒素雰囲気下に35℃にて18〜2
0時間消化した。次いで、トリプシン分解物からの大き
い方のペプチドをアルテックス・ウルトラポアＣ３カラ
ム［ベックマン、インスツルメンツ社］でのクロマトグ
ラフィーによって単離した。通過フラクションをアルテ
ックス・ウルトラスフェアーＩＰ［ベックマン・インス
ツルメンツ社］カラムで再びクロマトグラフにかけ、そ
の際揮発性緩衝液（0.1％ＴＦＡ）又は不揮発性緩衝液
（0.1Ｍ過塩素酸−0.1％リン酸塩、pH2.5）を用いた
［ミーク、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第77巻、第1632〜
1636頁（1980）］。後者の場合、ペプチドは溶剤として
0.1％ＨＦＢＡ及びアセトニトリルを用いるＩＢＭ５−
μｍＣ18カラムでのクロマトグラフィーにより配列分析
する前に脱塩せねばならなかった。溶剤として0.1％Ｔ
ＦＡ及びアセトニトリルを用いて、Ｃ18カラムでの逆相
クロマトグラフィーによりペプチドＮＴ１を脱塩した。
これらペプチドを上記と同様にアミノ酸組成につき分析
した。
トリプシン分解ペプチドの配列 第１表は、上記のように単離した各ペプチドのエドマン
分解から得られた配列を示している。ペプチドＮＴ３
ａ、ＮＴ４ａ、ＮＴ４ｂ、ＮＴ５、ＮＴ６、ＮＴ７、Ｎ
Ｔ８及びＮＴ12につき独特の配列が見られ、したがって
これらは純粋であると思われる。ペプチドＮＴ（１＋1
3）の分析は配列Ａｒｇ−Ａｒｇを与えた。これは、そ
の組成と共に、ＮＴ（１＋13）がＡｒｇ−ＡｒｇとＮ−
遮蔽されたアミノ末端ペプチドＮＴ１との混合物である
ことを示した。脱塩したペプチドＮＴ１をＦＡＢ質量分
光分析法によって分析し、602のＭＨ＋を有することが
判明し、これは＜Ｇｌｕ（ピログルタミン酸）、Ａｓ
ｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ及びＡｒｇの存在を示す。ペプチド
ＮＴ２は、第１分解サイクルにてＡｒｇを与えたが、そ
の後は何も与えなかった。その組成、すなわちＡｒｇ＋
Ｐｒｏ並びにアンギオゲニンのカルボキシ末端残基がＰ
ｒｏであると言う事実は、ＮＴ２の配列をＡｒｇ−Ｐｒ
ｏとして同定し、かつこれをアンギオゲニンのカルボキ
シ末端に位置決定した。ペプチドＮＴ３ｂは第１サイク
ルにてＡｒｇとＩｌｅの両者を与えたが、その後はＳｅ
ｒとＬｙｓとのみを示した。したがって、ＮＴ３ｂは恐
らくトリペプチドＩｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓプラス遊離ア
ルギニンである。ＮＴ９及びＮＴ10の両者は、恐らく各
場合にジスルフイド結合によって結合された２種のペプ
チド（ＮＴ９′プラスＮＴ９″及びＮＴ10′プラスＮＴ
10″と呼ぶ）の混合物であることが判明した。ＮＴ11も
混合物である。この場合、その配列とＮＴ４ｂ及びＮＴ
12の配列との比較は、ＮＴ11がジスルフイド結合により
結合されたこれら２種のペプチドよりなっていることを
示した。
総合すると、これらのペプチドはアンギオゲニンの全ア
ミノ酸組成にほぼ近いものとなる。
還元しかつＳ−スルホプロピル化したアンギオゲニン70
0ｐモルのサーモリシン消化物は、６種の純ペプチドの
単離を可能にし、そのアミノ酸組成を決定した（第２
表）。これらのうち３種は、トリプシン分解ペプチドに
対するオーバーラップを提供するのに役立つ。
トリプシン分解ペプチドの整合 エドマン分解はアンギオゲニンのアミノ末端がブロック
されていることを示し、かつ質量分析の証明はＮＴ１が
Ｇｌｕを含有することを示すので、これはＮ−末端残基
でなければならないと思われる。したがって、140μｇ
の完全蛋白をピログルタミナーゼで切断して、アミノ末
端をエドマン分解にかけうるようにした。次いで、逆相
ＨＰＬＣによって単離した生成物を次いで40サイクルの
分解によって処理した。予想通り、消化した蛋白のアミ
ノ末端はもはやブロックされなかった。最初の36サイク
ルのうち35サイクルを同定し、これらはＮＴ１の配列を
与え、次のペプチドとしてＮＴ７を整合し、かつＮＴ９
のＮＴ９′成分の配列とＮＴ10のＮＴ10′成分における
配列の１部とを供給すると共に、これらをアミノ末端配
列に整合させた。ＮＴ10′の配列の残部をＮＴ10の分析
によって決定した。さらに、ＮＴ10′を、ＮＴ10の還元
及びアルキル化の後にＨＰＬＣによって単離した。これ
は次の組成を有した：ＣｙｓＣＭ0.46（１）、Ｇｌｕ0.
4、Ｓｅｒ1.08（１）、Ｇｌｙ1.39（１）、Ａｒｇ0.3
2、Ｔｈｒ1.13（１）、Ａｌａ0.32、Ｐｒｏ1.27
（１）、Ｌｅｕ0.95（１）、Ｌｙｓ0.80（１）を有し、
これは与えた配列と一致する。さらに、ペプチドＮＴ13
及び恐らくＮＴ３ｂの遊離Ａｒｇも、アンギオゲニンの
全配列における位置32及び33に一致するであろう。
アミノ末端配列は、単一のメチオニンが位置30を占める
ことを示している。その箇所における連鎖の臭化シアノ
ゲン切断は、Ｍｅｔ−30に続く最初の８個の残基のうち
７個につきその配列の延長を可能にした。
順序３ａ−４ｂにおけるペプチドＮＴ３ａ及びＮＴ４ｂ
のオーバーラップはサーモリシンペプチドＬ６（Ｉｌ
ｅ、Ｌｙｓ及びＡｌａ）によって与えられ、これはサー
モリシン特異性［フェダー・アンド・シャック、バイオ
ケミストリー、第9巻、第2784〜2791頁（1970）］によ
り配列Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａを持たねばならない。さ
らに、サーモリシン特異性は、Ｌ６のＡｌａがＮＴ６の
部分ではありえないことを示している。さらに、Ｌ６の
この位置はペプチドＬ４の配列と一致し、その生成はペ
プチドＮＴ８におけるＰｈｅからＬｙｓ−Ａｒｇカルボ
キシ末端を介しＮＴ３ａのＳｅｒまで延びることを示し
ている。したがって、これはＮＴ８−３ａ−４ｂをその
順序で整合する。
それぞれペプチドＮＴ４ａ及びＮＴ12におけるアンギオ
ゲニンの２つのＡｓｎ−Ｇｌｙ配列の存在は、ボルンシ
ュタインのヒドロキシルアミン法（1970）によるこれら
２つの位置におけるポリペプチド連鎖の化学的切断の機
会を与える。ヒドロキシルアミン切断物をモレキュラシ
ーブＨＰＬＣによって脱塩し、かつ蛋白ピークを直接に
配列決定した。33個の残基のうち22個の単一の明確な配
列が得られ、ペプチドＮＴ４ａ−５−３ｂ−９″−10″
のこの順序における整列を可能にし（第４ｃ図）、これ
により35個の残基の追加ブロックを配列中に入れた。ヒ
ドロキシルアミン切断物の塩含有フラクションを逆相ク
ロマトグラフィーによって再分画し、１つの純粋ペプチ
ドであるヒドロキシルアミン−２を単離した。このアミ
ノ酸組成は次の通りであった：Ａｓｐ1.17（１）、Ｇｌ
ｕ1.12（１）、Ｓｅｒ0.99（１）、ＧＬＹ1.10（１）、
ＨＩＳ0.84（１）、Ａｒｇ2.05（２）、Ｐｒｏ2.11
（２）、Ｔｙｒ0.22、Ｖａｌ0.97（１）、Ｉｌｅ0.81
（１）、Ｌｅｕ1.77（２）及びＰｈｅ1.02（１）。これ
らのアミノ酸は、ＮＴ１２及びＮＴ２のその順序におけ
る整列を可能にするオーバーラップを形成する。
ペプチドＬ５（Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｘ）は、トリプシ
ン分解ペプチドの２種の異なる組合せ、すなわちアミノ
末端Ａｓｘを与えるＮＴ８若しくはＮＴ12及びカルボキ
シ末端Ｐｈｅ−Ａｒｇ配列を与えるＮＴ６とから生じう
る。実際の組合せＮＴ６−12を、ナショナル・バイオメ
ジカル・リサーチ・フアンデーションの蛋白配列データ
バンクにおける蛋白配列と前記領域との比較により決定
されるように、１群のパンクレアチンリボヌクレアーゼ
に対する相同性に基づいて推定した。他の３種のテルモ
リシンペプチド（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）はペプチドＮＴ
12、ＮＴ９″及びＮＴ７にて同定された配列に一致す
る。
最後に、カルボキシル末端ペプチドとしてのペプチドＮ
Ｔ２の同定は、プロリンがアンギオゲニンのカルボキシ
ル末端アミノ酸残基であると言う事実に一致する。
アンギオゲニンのアミノ酸配列分析（第２図に示す）
は、蛋白が14,193ダルトンの分子量を有することを示し
た。
以上、本発明を特定具体例につき例示の目的で説明した
が、これらのみに限定されることなく本発明の思想及び
範囲内において各種の改変をなしうることが了解されよ
う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アンギオゲニン活性を有しかつ9.5より大
    きい等電点を特徴とする蛋白質であって、 ３Ｔ３細胞に対する有糸分裂活性を示さず、アミノ末端
    ピログルタミン酸残基とカルボキシル末端プロリン残基
    とを有し、 式： のアミノ酸配列を有する上記の蛋白質。
  2. 【請求項２】ヒト腺癌ＨＴ−２９細胞ＡＴＣＣNo.ＨＴ
    Ｂ３８若しくはＡＴＣＣNo.ＣＲＬ８９０５から得られ
    る請求の範囲第１項記載の蛋白質。
  3. 【請求項３】リボヌクレアーゼ活性を有する請求の範囲
    第１項記載の蛋白質。
  4. 【請求項４】状態調節したヒト腺癌細胞培養培地からア
    ンギオゲニン活性を有しかつ9.5より大きい等電点を特
    徴とする蛋白質であって、 ３Ｔ３細胞に対する有糸分裂活性を示さず、アミノ末端
    ピログルタミン酸残基とカルボキシル末端プロリン残基
    とを有し、 式： のアミノ酸配列を有する蛋白質を得る方法であって、 前記培地を処理して高分子量蛋白質を除去し、 処理された培地の１部を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
    液中でＣＭセルロース陽イオン交換マトリックスに結合
    させ、 この結合した部分を前記マトリックスから１ＭＮａＣｌ
    を含む同緩衝液を用いて溶出させて溶出液を生成させ、 この溶出液を0.08％ＴＦＡを含有するイソプロパノール
    ／アセトニトリル／水（５：５：４ｖ／ｖ／ｖ）よりな
    る溶媒を用いる逆相高性能液体クロマトグラフィーによ
    り分画し、かつ 前記蛋白質を含有するフラクションを回収することを特
    徴とする、 上記の蛋白質を得る方法。
  5. 【請求項５】処理工程が、培地を酸性化し、次いで遠心
    分離して高分子量蛋白質を処理培地から分離することを
    含む請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】分画工程が、前記溶出液をイオン交換カラ
    ムにおける高性能液体クロマトグラフィー（０．０１Ｍ
    トリス緩衝液使用）により分画して第２の溶出液を生成
    させかつこの第２の溶出液を前記の逆相高性能液体クロ
    マトグラフィーによって分画することを含む請求の範囲
    第４項記載の方法。
  7. 【請求項７】血清を含有せずかつ外生蛋白質を含有しな
    い培地にて細胞を培養することにより状態調節培地を作
    成する請求の範囲第４項記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞がヒト腺癌ＨＴ−２９細胞であり、か
    つアンギオゲニン活性を有する蛋白質がリボヌクレアー
    ゼ活性を有することを特徴とする請求の範囲第７項記載
    の方法。
  9. 【請求項９】状態調節した細胞培養培地を濾過して処理
    工程前に細胞残骸を除去する請求の範囲第４項記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】蛋白質を含有するフラクションの１部を
    ＣＭセルロース陽イオン交換マトリックスに結合させて
    第２の結合蛋白質を生成させ、かつこの第２の結合蛋白
    質を前記マトリックスから１ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ
    リン酸ナトリウム緩衝液で溶出させる工程をさらに含む
    請求の範囲第４項記載の方法。
  11. 【請求項１１】状態調節されたヒト腺癌細胞培養培地か
    らアンギオゲニン活性を有しかつ9.5より大きい等電点
    を特徴とする蛋白質であって、 ３Ｔ３細胞に対する有糸分裂活性を示さず、アミノ末端
    ピログルタミン酸残基とカルボキシル末端プロリン残基
    とを有し、 式： のアミノ酸配列を有する上記の蛋白質を得る方法であっ
    て、 前記培地を濾過して細胞残骸を除去し、 濾過された培地を酸性化して高分子量蛋白質を沈澱さ
    せ、 酸性化された濾過培地を遠心分離して処理培地を生成さ
    せ、 この処理培地の１部を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
    中でＣＭセルロース陽イオン交換マトリックスに結合さ
    せ、 結合部分を前記マトリックスから１ＭＮａＣｌを含む同
    緩衝液を用いて溶出させて第１溶出液を生成させ、 この第１溶出液をイオン交換カラムでの高性能液体クロ
    マトグラフィー（０．０１Ｍトリス緩衝液使用）により
    分画して第２溶出液を生成させ、 この第２溶出液を0.08％ＴＦＡを含有するイソプロパノ
    ール／アセトニトリル／水（５：５：４ｖ／ｖ／ｖ）よ
    りなる溶媒を用いる逆相高性能液体クロマトグラフィー
    によって分画し、 前記蛋白質を含有するフラクションを集め、 前記蛋白質を含有する前記フラクションの１部を０．１
    Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中でＣＭセルロース陽イオン
    交換マトリックスに結合させて第２の結合蛋白質を生成
    させ、かつ この第２結合蛋白質を前記マトリックスから１ＭＮａＣ
    ｌを含む同緩衝液を用いて溶出させることを特徴とする
    上記の蛋白質を得る方法。
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