CN105566482A - 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺 - Google Patents
一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105566482A CN105566482A CN201410529341.8A CN201410529341A CN105566482A CN 105566482 A CN105566482 A CN 105566482A CN 201410529341 A CN201410529341 A CN 201410529341A CN 105566482 A CN105566482 A CN 105566482A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cobratide
- phosphoric acid
- acid buffer
- post
- peak
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药提取技术领域，具体涉及一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺。该方法采用SephadexG-50柱将处理后的蛇毒原液按不同相对质荷比的分子由大至小一一分开，分离筛分出目标E峰,再用阳离子CM-32交换层析柱对目标E峰进行分离纯化，冷冻干燥，得到科博肽；该方法工艺简单，易于操作，质量较好控制，大大缩短了生产周期，降低了生产成本；最终产物纯度大于97%，更适合于工业大生产。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药提取技术领域，特别是涉及一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺。
背景技术：
蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，主要成份是毒性蛋白质，约占干重的90%至95%。酶类和毒素约含二十多种。此外，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具特点。就眼镜蛇蛇毒而言，含有细胞毒素（Cytotoxin，CTX）、神经毒素(neurotoxin，NT)，神经生长因子(Nervegrowthfactor，NGF)和多种酶类等。神经毒素(neurotoxin，NT)在蛇毒中含量较高，一般在5％～10％之间，毒性极强，是该类毒蛇咬伤致死的主要成分之一。
蛇毒神经毒素种类多、活性强、性质稳定、结构相对简单，因此一直备受人们的关注。近年来随着生化技术的发展及分子生物学方法的应用，已经从不同的蛇毒中分离纯化出许多的神经毒素。其中仅突触后神经毒素就有100多种。蛇毒神经毒素根据作用机制可分为四类：突触前神经毒素(presynaptically—actingneurotoxin或βα-neurotoxin)、突触后神经毒(postsy-naptically—actingneurotoxin或a—neurotoxin)、抗胆碱酯酶类神经毒素(anticholinesteraseneurotoxin)和离子通道型神经毒素(ion—channelneurotoxin)。目前发现的镇痛成分几乎都是突触后神经毒素。
科学研究表明，突触后神经毒素是一条由60～80个氨基酸残基组成的多肽链，氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性，分子量约为6000～8000道尔顿。突触后神经毒索有长链和短链之分，短链含60～62个氨基酸，四个二硫键．长链含66~74个氨基酸，五个二硫键。分子中的二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出三个肽链环就象三个手指，故其又被形象地称为三指蛋白(three—ringerprotein)。突触后神经毒素几乎全部是碱性蛋白，等电点在9～10之间。由于分子量很小但二硫键很多，这类毒素的理化性质十分稳定，对热及化学试剂都有抗性。
目前，获取眼镜蛇蛇毒中的神经毒素主要是通过捕蛇或养蛇取毒，对粗毒进一步纯化提取而得到，主要利用离子交换层析和凝胶层析。现有技术中，中国专利申请CN101845089A（公开日期2010年9月29日)公开了“一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法”，该方法将蛇毒层析洗脱后再过分子量为3K的超滤膜最后采用过氧化氢修饰神经毒素，步骤较繁琐，容易引入杂质，在实际生产中，蛇毒神经毒素在层析洗脱后仍存在一部分分子量大于神经毒素的至敏物质，且采用过氧化氢修饰神经毒素后对眼镜蛇神经毒素的长期稳定性并未作考察，规模化生产出的成品距离产品实际运用中仍然需要一定的考察时间。李范珠等在文献“浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究”（中国药师，2004年09期,P659～661）中公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化方法为将蛇毒直接进行三次柱层析，耗时长，提取成本高，神经毒素的收率较低。专利申请CN101381408A（公开日期2009年3月11日）公开了“科博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽以及包含该科博肽的制剂”，该方法先将硫酸铵预处理眼镜蛇蛇毒原液，以除去蛇毒中的部分其它成分；通过超滤、透析或凝胶层析除盐浓缩，浓缩后用阳离子柱进行进行梯度洗脱纯化，该方法操作繁琐，并且引入了盐，易对目标产物的质量造成影响，脱盐会导致有效成分损失，生产过程质量较难控制。
以上几种工艺获得NT的成本高，生产周期长，质量难以控制，收率较低，获得纯品技术难度较大，并且由于天然蛇毒含有理化性质与神经毒素较为接近的其他大分子毒素如磷脂酶A2等，会干扰神经毒素的生物活性，应用于临床会出现多种不良反应，在使用过程中容易产生安全隐患。
因此，对眼镜蛇蛇毒神经毒素的提取方法作进一步的深入研究，摸索出一种便捷、快速的科博肽分离提纯工艺，从而缩短生产周期，降低成本，又能得到含量高、纯度高、性质稳定且药效良好的科博肽产品，这将在经济效益和临床运用方面具有重要意义。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是克服现有眼镜蛇蛇毒神经毒素的提取方法中存在的生产周期长，操作较为繁琐，质量难以控制等缺点，提供一种更为便捷、快速、安全的科博肽分离提取工艺。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：眼镜蛇毒其他组分的相对质荷比和神经毒素及细胞毒素相对质荷比差异比较大，利用SephadexG-50，可以清晰地将眼镜蛇毒的各种组分按不同相对质荷比的分子由大至小一一分开分开，清晰分出A、B、C、D、E等峰，其中E峰是相对质荷比是7000左右的组分，即E峰包括两个组分：神经毒素和细胞毒素，收集E峰，去除E峰以外的组分。而细胞毒素离子强度大于神经毒素的离子强度，细胞毒素与CM-32的结合能力强于神经毒素与CM-32结合能力。因此我们用CM-32柱分离神经毒素和细胞毒素。用较低离子强度的洗脱液把神经毒素从CM-32柱洗脱下来，得到神经毒素，达到分离神经毒素和细胞毒素的目的。
具体的，本发明采用如下的技术方案：
（1）、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（2）、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（3）、眼镜蛇粗毒加3-5倍量pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用。
（4）、经离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速30-50ml/h，自动部分收集器收集滤液。
（5）、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
（6）、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50-70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目的峰，冷冻干燥，即得科博肽。
优选地，本发明提供的具体技术方案为：
（1）、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8.0的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（2）、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH8.0的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（3）、眼镜蛇粗毒加4倍量pH8.0的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用。
（4）、经离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，pH8.0的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速40ml/h，自动部分收集器收集滤液。
（5）、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
（6）、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速60ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目的峰，冷冻干燥，即得科博肽。
根据本发明提供的技术方案，其有益效果是：1、先用SephadexG-50筛分眼镜蛇毒各组分后，收集E峰，得到的神经毒素的纯度有了极大提高，从原来93%左右提高近100%。2、由于CM-32柱只用来分离神经毒素和细胞毒素，没有其它阳离子介入，因此可增加上样量，提高产能；3、本发明提取工艺简单、操作方便，增大洗脱流速，缩短了近60%的洗脱时间、进而缩短了生产周期，降低了生产成本，更适应工业化生产需要。4、本发明工艺均采用直接分离目标组分，紫外分光光度计检测收集目标峰，制得的科博肽纯度高、收率理想、质量稳定等，使得临床用药效果更为显著，且用药安全得到了更好的保障。
本发明还提供了以由上述提取工艺提取出的眼镜蛇毒神经毒素加入辅料，按常规制剂工艺制成药物学意义上的各种制剂，包括注射制剂、口服液制剂，如：小容量注射剂、冻干粉针剂、普通片、口腔崩解片及分散片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、舌下片剂等。优选小容量注射剂和冻干粉针剂。
本发明所称的常规制剂工艺以及辅料等是指在教科书、国家标准、地方标准上已经公开的方法、技术及辅料。
其中小容量注射剂和冻干粉针剂的制备方法如下：
取70mg科博肽原料，加入配制药液总量10%氯化钠注射液，使其溶解，0.45μm过滤器滤过，检测含量，再加氯化钠注射液至全量2000ml，调节pH值至5-7，灌封，60℃保温30min，间隔24h,保温三次。制备成小容量注射制剂1000支，每支规格：2ml:70μg。
取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80%的注射用水溶解，再加入甘露醇，搅拌均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH值至5-8，无菌滤过，滤液分装于灭菌西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶，每瓶规格：70μg。
本发明又一目的还提供了本发明所述的眼镜蛇毒神经毒素及其制剂，主要用于治疗各种慢性疼痛、血管性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、晚期癌疼痛、关节痛及麻风反应神经痛。
为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，本申请人进行了一系列实验研究，以证明本发明的效果：
实验1工艺研究
本发明人为了探索出一种便捷、快速的眼镜蛇毒神经毒素的分离提取工艺，进行了大量的筛选试验，最终发现用SephadexG-50柱分子筛加CM-32柱阳离子交换层析的技术方案，工艺简单、操作方便，比我公司传统的提取工艺缩短了近60%的洗脱时间，大大缩短了生产周期。为进一步优化本技术方案，本发明人又进行大量的工艺研究，发现影响本发明提取物质量的关键因素主要有洗脱液的浓度、pH值、洗脱流速等，本发明人对提取工艺进行了参数的设计和选择，最终以提取物的性状、水分、有效成分含量、纯度和收率以及生产周期为考察指标进行考察。
1.1磷酸缓冲液pH值的选择：
药物1：按照本发明实施例1的方法制备；
药物2：按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8.0的磷酸缓冲溶液换成pH7.9的缓冲溶液。
药物3：按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8.0的磷酸缓冲溶液换成pH8.1的缓冲溶液。
药物4：按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8.0的磷酸缓冲溶液换成pH7.8的缓冲溶液。（pH较低的磷酸缓冲液）
药物5：按照本发明实施例1的方法制备，将各步骤pH8.0的磷酸缓冲溶液换成pH8.2的缓冲溶液。（pH较高的磷酸缓冲液）
试验结果：
表1磷酸缓冲液pH值对提取工艺的影响
| PH值 | 性状 | 水分（%） | 有效成分含量（%） | 纯度（%） | 收率（g/100g蛇毒） |
| 药物1 | 白色粉末 | 3.8 | 82.1 | 99.4 | 9.22 |
| 药物2 | 白色粉末 | 4.0 | 80.4 | 98.9 | 9.31 |
| 药物3 | 白色粉末 | 4.1 | 79.6 | 97.4 | 8.91 |
| 药物4 | 白色粉末 | 3.9 | 65.1 | 90.2 | 6.68 |
| 药物5 | 白色粉末 | 4.2 | 64.7 | 87.9 | 7.53 |
结果表明：本发明工艺洗脱液：磷酸缓冲液pH值对提取物质量的影响较为敏感（药物4和药物5质量、收率均不理想），因此，为确保本发明工艺的稳定性，优选本发明洗脱液为：pH7.9-8.1磷酸缓冲液。
1.2SephadexG-50柱洗脱流速的选择：
药物1：按照本发明实施例1的方法制备；
药物2：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成30ml/h。
药物3：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成50ml/h。
药物4：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成25ml/h。
药物5：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成55ml/h。
试验结果：
表2SephadexG-50柱洗脱流速考察
| 试验组 | 流速（ml/h） | 性状 | 水分（%） | 有效成分含量（%） | 纯度（%） |
| 药物4 | 25 | 白色粉末 | 4.2 | 67.5 | 88.7 |
| 药物2 | 30 | 白色粉末 | 4.7 | 78.3 | 97.5 |
| 药物1 | 40 | 白色粉末 | 4.1 | 81.6 | 99.5 |
| 药物3 | 50 | 白色粉末 | 4.3 | 79.9 | 97.3 |
| 药物5 | 55 | 白色粉末 | 4.6 | 69.8 | 92.4 |
结果表明：当SephadexG-50柱洗脱流速25ml/h时，提取药物4的质量不理，而且洗脱速度较慢；洗脱流速调为55ml/h时，虽然洗脱速度很快，但是提取药物5的质量也不理想，因此，为确保提取药物质量安全，根据筛选结果确定本发明SephadexG-50柱洗脱流速优选30-50ml/h。
1.3CM-32柱洗脱流速选择：
药物1：按照本发明实施例1的方法制备；
药物2：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤6的流速60ml/h，换成50ml/h。
药物3：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤6的流速60ml/h，换成70ml/h。
药物4：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤6的流速60ml/h，换成25ml/h。
药物5：按照本发明实施例1的方法制备，将步骤4的流速40ml/h，换成55ml/h。
试验结果：
表3：CM-32柱洗脱流速考察
| 试验组 | 流速（ml/h） | 性状 | 水分（%） | 有效成分含量（%） | 纯度（%） |
| 药物4 | 45 | 白色粉末 | 4.3 | 71.5 | 88.5 |
| 药物2 | 50 | 白色粉末 | 4.6 | 79.3 | 97.5 |
| 药物1 | 60 | 白色粉末 | 4.2 | 81.2 | 99.2 |
| 药物3 | 70 | 白色粉末 | 4.1 | 79.2 | 97.7 |
| 药物5 | 75 | 白色粉末 | 4.7 | 70.8 | 91.4 |
结果表明：当CM-32柱洗脱流速45ml/h时，提取药物4的质量不理，而且洗脱速度较慢；洗脱流速调为75ml/h时，虽然洗脱速度很快，但是提取药物5的质量也不理想，因此，为确保提取药物质量安全，根据筛选结果确定本发明SephadexG-50柱洗脱流速优选30-50ml/h。
1.4CM-32柱洗脱方式的选择：
药物1：按照本发明实施例1的方法制备；
药物2：按照本发明实施例1的方法制备：将步骤6洗脱方式改为：收集的E峰上平衡后的CM-32柱，用含0.10M氯化钠磷酸缓冲液洗脱,流速为60ml/h，24小时后开始检测收集目的峰。收集的目的峰进行冷冻干燥，即得科博肽。
药物3：按照本发明实施例1的方法制备；将步骤6洗脱方式改成为：收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.08M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速60ml/h，24小时后开始检测收集目的峰。收集的目的峰进行冷冻干燥，即得科博肽。
试验结果：
表4：CM-32柱洗脱方式考察：
| 试验组 | 性状 | 水分（%） | 有效成分含量（%） | 纯度（%） | 收率（g/100g蛇毒） |
| 药物1 | 白色粉末 | 4.1 | 81.5 | 99.5 | 9.18 |
| 药物2 | 白色粉末 | 4.6 | 76.3 | 89.4 | 9.21 |
| 药物3 | 白色粉末 | 4.4 | 72.2 | 88.2 | 6.22 |
结果表明：本发明提取工艺步骤6采用制得药物2、3的洗脱方式，提取药物纯度低，达不到要求；因此，本发明步骤6优选制得药物1的洗脱方式。
1.5本发明工艺的综合评价：
为了考察本发明提取工艺的有益效果，本发明人以提取物的性状、水分、有效成分含量、纯度以及纯神经毒素收率（100g蛇毒中纯神经毒素重量）为考察指标，进行了一系列的考察试验。
药物A：按照中国专利申请“一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法”CN101845089A（公开日期2010年9月29日)中实施例的方法制备；
药物B：按照中国专利申请“博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽以及包含该科博肽的制剂”CN101381408A（开公告：2009.03.11）中的实施例的方法制备；
药物C：按照文献“浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究”（李范珠等，中国药师，2004年09期,P659～661）中公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化方法制备；
药物D:本发明实施例1的方法制备；
上述方法制得的药物A-D进行质量考察：
表5：提取药物质量考察评价：
| 性状 | 水分（%） | 有效成分含量（%） | 收率（g/100g蛇毒） | 纯度（%） | |
| 药物A | 白色粉末 | 4.2 | 65.6 | 6.35 | 93.1 |
| 药物B | 白色粉末 | 4.5 | 70.3 | 7.10 | 95.5 |
| 药物C | 白色粉末 | 4.4 | 63.7 | 6.54 | 93.2 |
| 药物D | 白色粉末 | 3.8 | 80.2 | 9.18 | 99.2 |
上表数据表明，按照上述方法提取的眼镜蛇毒神经毒素性状一致，均为白色粉末，水分均未超过5.0%，满足法定标准的要求。而本发明方法制得药物D，在有效成分含量、收率、纯度等制备均较其他制备方法制得的药物优，提取的药物品质更好；并且本发明提取工艺简单、在生产过程中，易于操作，质量较好控制，整个生产周期较其他提取工艺大大缩短了生产周期。
实验例3、急性毒性试验
4.1动物及药物
动物：小白鼠，云南省动物研究所提供，体重18-20克。
药物：按照实施例6、7的方法分别制备得到注射液、冻干粉针剂，规格：2ml:70μg；
市售科博肽注射液，吉林省辉南辉发制药股份有限公司生产，规格同上，批号：20140402。
4.2方法
按照Meier方法，取经12h禁食不禁水的小鼠，分剂量组，每组10只，尾静脉或腹腔注射不同浓度的药物，注射量为0.1ml/10体重，记录注射剂量（D：mg/kg）和小鼠存活时间（T：min），以D/T为横坐标，D为纵坐标作图，进行线性回归，得方程D=a×D/T+b，截距b即为近似LD50，计算LD50的平均值及标准差（X±s）
4.3结果：注射20分钟后出现竖毛、畏缩、呼吸困难和频率加快并逐渐转为腹式呼吸，最后死于呼吸麻痹，死前有挣扎踢腿现象，呼吸停止后心跳仍可维持一段时间。近似LD50如下：
表7急性毒性试验结果
结果表明采用本发明方法制得的蛇毒神经毒素，毒性较市售产品显著小，说明本发明方法制得的蛇毒神经毒素低毒，临床用药安全性更好。
实验例5、科博肽镇痛实验
1.1材料：
1.1.1药品：
本发明制剂：按照本发明的制备方法制备成注射液和冻干剂（按实施例6、7制备），注射液规格：2ml:70μg，冻干规格：每瓶：70μg。
对照药品:科博肽注射液，吉林省辉南辉发制药股份有限公司生产，规格同上，批号：20140402。
1.1.2试验对象：昆明种小鼠l8～22g，雌雄各半，购于大理医学院实验动物中心。
1.2试验方法及结果
取若干只小鼠禁食12h不禁水，将小鼠放在55±1℃的恒温金属板上，密切观察小鼠反应，以小鼠舔后足为痛觉指标，用秒表记录小鼠从放置热板上到出现舔后足反应的时间为基础痛阈值，将基础痛阈不在10~30s范围内的小鼠剔除；取40只符合要求的小鼠随机分成四组，分别是实验注射液组、实验冻干剂组、对照组、空白对照组，每组1O只。按体重分别给小鼠腹腔注射本发明制剂、对照药品，实验组给本发明制剂，剂量为0.05mg/kg，对照组给相同剂量对照药品，空白对照组给等容量的0.9％氯化钠溶液作空白对照。测定各组给药后4h的痛阈，计算各组给药前后的平均痛阈值，用t检验对各组给药前后的平均痛阈值的差别作显著性检验。结果见表8。
表8表小鼠痛阈反应时间
| 组别 | 注射前潜伏期（秒） | 注射后潜伏期（秒） | 痛阈平均提高百分率（%） |
| 实验注射液组 | *9.98±2.41 | **16.26±3.56 | 62.9 |
| 实验冻干剂组 | *9.94±2.58 | **16.18±6.03 | 62.7 |
| 对照组 | 9.92±2.49 | 14.93±3.46 | 50.5 |
| 空白对照组 | 9.89±3.99 | 9.92±3.56 | —— |
*P＜0.05**P＜0.01
以上数据表明，实验组药物对热板法建立的小鼠急性疼痛模型具有镇痛作用，且效果优于对照组。
具体实施方式：
实施例1：眼镜蛇神经毒素的制备：
（1）、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8.0的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（2）、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH8.0的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（3）、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量pH8.0的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用。
（4）、经步骤（3）离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，PH8.0的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速40ml/h，自动部分收集器收集滤液。
（5）、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
（6）、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速60ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目的峰，冷冻干燥，得科博肽0.912g，纯度为99.2%。
实施例2：眼镜蛇毒神经毒素的制备：
（1）、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH7.9的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（2）、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH7.9的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（3）、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量pH7.9的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用。
（4）、经步骤（3）离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，pH7.9的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速30ml/h，自动部分收集器收集滤液。
（5）、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
（6）、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目的峰，冷冻干燥，得科博肽0.894g，纯度为97.6%。
实施例3：眼镜蛇毒神经毒素的制备：
（1）、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（2）、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（3）、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量pH8.1的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用。
（4）、经步骤（3）离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，pH8.1的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，自动部分收集器收集滤液。
（5）、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
（6）、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目的峰，冷冻干燥，得科博肽0.905g，纯度为97.3%。
实施例4：眼镜蛇毒神经毒素的制备：
（1）、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH7.9的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（2）、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH7.9的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（3）、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量pH7.9的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用。
（4）、经步骤（3）离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，pH7.9的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，自动部分收集器收集滤液。
（5）、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
（6）、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目的峰，冷冻干燥，得科博肽0.910g，纯度为97.8%。
实施例5：眼镜蛇毒神经毒素的制备：
（1）、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（2）、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡。
（3）、取10g眼镜蛇粗毒加4倍量PH8.1的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用。
（4）、经步骤（3）离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，pH8.1的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速30ml/h，自动部分收集器收集滤液。
（5）、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰。
（6）、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰。收集的目的峰，冷冻干燥，得科博肽0.900g，纯度为98.3%。
实施例6：科博肽注射液的制备（注射剂）
取70mg上述实施例1-5制得的科博肽原料，加入配制药液总量10%氯化钠注射液，使其溶解，0.45μm过滤器滤过，检测含量，再加氯化钠注射液至全量2000ml，调节pH值至5-7，灌封，60℃保温30min，间隔24h,保温三次。制备成小容量注射制剂1000支，每支规格：2ml:70μg。
实施例7：注射用科博肽的制备（冻干粉针剂）
取70mg上述实施例1-5制得的科博肽原料，加入配制药液总量80%的注射用水溶解，再加入甘露醇，搅拌均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH值至5-8，无菌滤过，滤液分装于灭菌西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶，每瓶规格：70μg。
Claims (8)
1.一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、SephadexG-50用注射用水膨胀，装柱后用pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡；
(2)、CM-32用注射用水溶胀后用0.5M氢氧化钠反应30min后,冲洗至中性；再用0.5M盐酸反应30min后,冲洗至中性，装柱，用pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液平衡；
(3)、眼镜蛇粗毒加3-5倍量pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液溶解，3000rpm离心10min，待用；
(4)、经离心后的蛇毒溶液上平衡后的SephadexG-50柱，pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液洗脱，流速30-50ml/h，自动部分收集器收集滤液；
(5)、24小时后，紫外分光光度计检测收集，收集E峰；
(6)、收集的E峰上平衡后的CM-32柱，用pH7.9-8.1的0.01M磷酸缓冲液洗脱16h后，换含0.10M氯化钠的磷酸缓冲液洗脱，流速50-70ml/h，24小时后开始检测收集液，收集目的峰，收集的目的峰，冷冻干燥，即得科博肽。
2.根据权利要求1所述的科博肽分离提取工艺，其特征在于：所述步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(6)的0.01M磷酸缓冲液PH为8.0。
3.根据权利要求1所述的科博肽分离提取工艺，其特征在于：所述步骤(4)SephadexG-50柱洗脱流速为40ml/h。
4.根据权利要求1所述的科博肽分离提取工艺，其特征在于：所述步骤(6)CM-32柱洗脱流速为60ml/h。
5.一种由权利要求1所述的分离提取工艺制得的科博肽，其特征在于：所述的科博肽的纯度大于97％。
6.一种包含权利要求1、5任一所述的科博肽加入药学上可接受的辅料，按常规制剂工艺制成药物学意义上的各种制剂。
7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于：可制成注射制剂、口服制剂。
8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于：所述的注射制剂为小容量注射剂或冻干粉针剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410529341.8A CN105566482B (zh) | 2014-10-10 | 2014-10-10 | 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410529341.8A CN105566482B (zh) | 2014-10-10 | 2014-10-10 | 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105566482A true CN105566482A (zh) | 2016-05-11 |
| CN105566482B CN105566482B (zh) | 2018-12-07 |
Family
ID=55877166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410529341.8A Active CN105566482B (zh) | 2014-10-10 | 2014-10-10 | 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105566482B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107098956A (zh) * | 2017-03-13 | 2017-08-29 | 广西医科大学 | 眼镜蛇毒细胞毒素‑4n的纯化制备方法及其应用 |
| CN109651496A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-04-19 | 南京昂峰医药科技有限公司 | 一种蛇毒蛋白储备液、其组合物以及稳定蛇毒蛋白的方法 |
| CN112094335A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-18 | 广西中恒创新医药研究有限公司 | 一种简单、高效的科博肽制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101381408A (zh) * | 2007-09-06 | 2009-03-11 | 北京赛生药业有限公司 | 科博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽以及包含该科博肽的制剂 |
| CN101845089A (zh) * | 2010-01-15 | 2010-09-29 | 中鑫东泰(莱阳)纳米基因生物技术有限公司 | 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法 |
-
2014
- 2014-10-10 CN CN201410529341.8A patent/CN105566482B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101381408A (zh) * | 2007-09-06 | 2009-03-11 | 北京赛生药业有限公司 | 科博肽的提取方法、由该方法提取得到的科博肽以及包含该科博肽的制剂 |
| CN101845089A (zh) * | 2010-01-15 | 2010-09-29 | 中鑫东泰(莱阳)纳米基因生物技术有限公司 | 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| L.STANDKER等: "Improved method for the isolation, characterization and examination of neuromuscular and toxic properties of selected polypeptide fractions from the crude venom of the Taiwan cobra Naja naja atra", 《TOXICON》 * |
| 龚潮梁等: "一种分离提纯眼镜蛇（Naja naja atra）神经毒素的简便方法", 《动物学研究》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107098956A (zh) * | 2017-03-13 | 2017-08-29 | 广西医科大学 | 眼镜蛇毒细胞毒素‑4n的纯化制备方法及其应用 |
| CN107098956B (zh) * | 2017-03-13 | 2021-02-09 | 广西医科大学 | 眼镜蛇毒细胞毒素-4n的纯化制备方法及其应用 |
| CN109651496A (zh) * | 2018-11-20 | 2019-04-19 | 南京昂峰医药科技有限公司 | 一种蛇毒蛋白储备液、其组合物以及稳定蛇毒蛋白的方法 |
| CN112094335A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-18 | 广西中恒创新医药研究有限公司 | 一种简单、高效的科博肽制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105566482B (zh) | 2018-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AM | Purification of the two components of leucocidin from Staphylococcus aureus. | |
| KR20190085136A (ko) | 피부, 헤어, 네일 및/또는 점막의 치료 및/또는 케어를 위해 유용한 화합물 | |
| CN103393780B (zh) | 一种高纯度黄连总生物碱提取方法 | |
| CN104327176B (zh) | 一种高纯度眼镜蛇神经毒素的提取方法及含有该毒素的药物组合物 | |
| Aston et al. | Isolation and purification of the diuretic hormone from Rhodnius prolixus | |
| CN102351951A (zh) | 一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂 | |
| KR20110130420A (ko) | 생물학적 활성 조류독소의 산업적 정제 방법 | |
| CN105566482A (zh) | 一种便捷、快速的科博肽分离提取工艺 | |
| Simonart et al. | Isolation of protein from humic acid extracted from soil | |
| WO2020057012A1 (zh) | 一组与烟碱乙酰胆碱受体具有高度亲和力能快速起效的眼镜蛇神经毒素分子在镇痛上的应用 | |
| CN103387610B (zh) | 双离子交换层析分离纯化眼镜蛇神经毒蛋白的方法及制剂 | |
| CN114599667B (zh) | 一种角蛋白bd-1、制法和其药物组合物与用途 | |
| CN101747409B (zh) | 一种眼镜蛇毒因子和眼镜蛇毒神经毒素的组合分离纯化方法 | |
| He et al. | Potential low toxic alternative for Na-Cl cotransporter inhibition: A diuretic effect and mechanism study of Pyrrosia petiolosa | |
| CN117281885A (zh) | 一种富硒山药糖蛋白作为免疫调节药物的应用 | |
| CN107056913A (zh) | 一种制备蜂毒肽的方法 | |
| CN100427076C (zh) | 一种治疗血栓的药物制剂及其制备方法 | |
| CN104974239A (zh) | 一种离子交换和反相层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法 | |
| CN102600217B (zh) | 一种常山碱的提取工艺 | |
| CN101709083B (zh) | 一种来自蝎尾的纤溶活性蛋白及其制备方法和应用 | |
| Jáuregui-Zúñiga et al. | Modifications on the morphology of synthetically-grown calcium oxalate crystals by crystal-associated proteins isolated from bean seed coats (Phaseolus vulgaris) | |
| Burnett et al. | A comparison of the toxicology of the nematocyst venom from sea nettle fishing and mesenteric tentacles | |
| WO2019193614A2 (en) | The process of achieving the highest degree of drug's purity of c-phycocyanin from spirulina alga | |
| CN103599189A (zh) | 贞芪扶正注射制剂及其制备方法 | |
| CN112724232B (zh) | 一种角蛋白bd-2、制法和其药物组合物与用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200609 Address after: 671099 biopharmaceutical Park, Dali Economic Development Zone, Dali City, Dali Bai Autonomous Prefecture, Yunnan Province Patentee after: Yunnan Nanzhao Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 550008 No. 220-1 Baiyun Avenue, Guizhou, Guiyang Patentee before: GUIZHOU YIBAI PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. |