CN102351951A - 一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂，该眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物由眼镜蛇粗毒提取纯化制得。本发明首先采用滤膜过滤的方法，去除溶液中的细菌、颗粒及大分子的至敏物质，为后续工艺节约时间和成本，增加产品的安全性；采用离子交换的方法洗脱分离神经毒素，改善了神经毒蛋白的分离；最后采用丙酮直接沉淀眼镜蛇神经毒素，除去最终产品中的杂质。与现有技术相比，本发明得到的眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物及制剂，产品收率、含量和纯度得到提高，同时有效降低了药物的不良反应，提高了疗效，从而保证了产品的质量。

Description

一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂

技术领域

本发明属于生物医药提取技术领域，特别是涉及一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂。

背景技术

蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，主要成份是毒性蛋白质，约占干重的90％至95％。酶类和毒素约含二十多种。此外，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具特点。就眼镜蛇蛇毒而言，含有细胞毒素(Cytotoxin，CTX)、神经毒素(neurotoxin，NT)，神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)和多种酶类等。神经毒素(neurotoxin，NT)在蛇毒中含量较高，一般在20％～50％之间，毒性极强，是该类毒蛇咬伤致死的主要成分之一。

蛇毒神经毒素种类多、活性强、性质稳定、结构相对简单，因此一直备受人们的关注。近年来随着生化技术的发展及分子生物学方法的应用，已经从不同的蛇毒中分离纯化出许多的神经毒素。其中仅突触后神经毒素就有100多种。蛇毒神经毒素根据作用机制可分为四类：突触前神经毒素(presynaptically-acting neurotoxin或βα一neurotoxin)、突触后神经毒素(postsy-naptically-acting neurotoxin或a-neurotoxin)、抗胆碱酯酶类神经毒素(anticholinesterase neurotoxin)和离子通道型神经毒素(ion-channel neurotoxin)。目前发现的镇痛成分几乎都是突触后神经毒素。

科学研究表明，突触后神经毒素是一条由60～80个氨基酸残基组成的多肽链，氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性，分子量约为6000～8000道尔顿。突触后神经毒索有长链和短链之分，短链含60～62个氨基酸，四个二硫键.长链含66～74个氨基酸，五个二硫键。分子中的二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出三个肽链环就象三个手指，故其又被形象地称为三指蛋白(three-ringer protein)。突触后神经毒素几乎全部是碱性蛋白，等电点在9～10之间。由于分子量很小但二硫键很多，这类毒素的理化性质十分稳定，对热及化学试剂都有抗性。

1936年Macht提出肌肉注射微量眼镜蛇毒具有类似吗啡的中枢镇痛作用。美国Hynson，Westcott&Dunning公司对眼镜蛇粗毒进行初步分离，制成Cobroxin和Nyloxin两种神经毒素制剂，用于治疗顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛，这两种药物已列入美国药物局方中。我国自1952年起开展对蛇毒神经毒素的镇痛作用研究，开发了一些制剂用于临床治疗疼痛，其中中国科学院昆明动物研究所研制的“克痛灵”注射剂(现名为科博肽注射液)，用于治疗坐骨神经痛、三叉神经痛、神经血管性头痛以及风湿痛等顽固性疼痛，疗效显著且副作用少。NT的镇痛作用有别于阿片类药物，表现为作用效价高，维持时间久，无耐受性和成瘾性，是一种很有潜力的新型镇痛药。同时，NT还能戒除吗啡毒瘾，在戒毒方面有独特的治疗作用。

目前，获取眼镜蛇蛇毒中的神经毒素主要是通过捕蛇或养蛇取毒，对粗毒进一步纯化提取而得到，主要利用离子交换层析和凝胶层析。现有技术中，中国专利申请CN101845089A(公开日期2010年9月29日)公开了“一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法”，该方法将蛇毒层析洗脱后再过分子量为3K的超滤膜最后采用过氧化氢修饰神经毒素，步骤较繁琐，容易引入杂质，在实际生产中，蛇毒神经毒素在层析洗脱后仍存在一部分分子量大于神经毒素的至敏物质，且采用过氧化氢修饰神经毒素后对眼镜蛇神经毒素的长期稳定性并未作考察，规模化生产出的成品距离产品实际运用中仍然需要一定的考察时间。李范珠等在文献“浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究”(中国药师，2004年09期，P659～661)中公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化方法为将蛇毒直接进行三次柱层析，耗时长，提取成本高，神经毒素的收率较低。龚潮梁等在“一种分离提纯眼镜蛇_Najanajaatra_神经毒素的简便方法”(动物学研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)一文中公开了采用CM-纤维柱层析分离神经毒素，70℃保温热变性处理杂质，低温冷丙酮提纯，然后用Sephadex G-10脱盐的方法获得纯化的眼镜蛇毒神经毒素，但是高温保温容易引起神经毒素大量变性沉淀，导致产物的生物活性降低，另外，由于盐在目标产物中的量较少且不会影响其活性，脱盐会导致有效成分损失，且操作繁琐，实际生产中耗费人力物力，使生产周期变长。

以上几种工艺获得NT的成本高，生产周期长，质量难以控制，收率较低，获得纯品技术难度较大，并且由于天然蛇毒含有理化性质与神经毒素较为接近的其他大分子毒素如磷脂酶A2等，会干扰神经毒素的生物活性，应用于临床会出现多种不良反应，在使用过程中容易产生安全隐患。

因此，对眼镜蛇蛇毒神经毒素的提取方法作进一步的深入研究，以期获得含量高、纯度高、性质稳定且药效良好的科博肽产品，是对科博肽的又一开发，也是我们研究人员的职责所在。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有眼镜蛇蛇毒神经毒素的提取方法中存在的生产周期长，质量难以控制，纯度较低等缺点，提供一种工艺简单、安全、质量可控的眼镜蛇蛇毒神经毒素提取方法。

本发明进一步要解决的技术问题是提供一种由上述方法制备得到的具有含量高、疗效好的更适合于工业化大生产的眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物及其制剂。

为解决上述问题，提供的眼镜蛇毒神经毒素提取方法为：

1)将眼镜蛇粗毒溶于磷酸盐缓冲液中，离心，上清液过微孔滤膜；

2)对滤液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜进行；

3)所得到的蛇毒液采用阳离子柱进行纯化，用含Nacl的磷酸盐缓冲液线性洗脱，收集神经毒素粗品，冷冻，加丙酮沉淀，滤去丙酮，真空干燥，得眼镜蛇毒神经毒素即科博肽。

具体的，本发明采用如下的技术方案：

1)将眼镜蛇粗毒溶于pH7.8-8.0，0.01M的磷酸盐缓冲液中，离心，取上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)对滤液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜进行；

3)所得到的蛇毒液上样到已用pH7.8-8.0，0.01M磷酸盐缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为30-50ml/h，用自动部分收集器收集洗脱液，用紫外分光光度计在280nm处进行检测。

4)洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.03-0.05M Nacl的磷酸盐缓冲液洗脱，待洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.08-0.09M Nacl磷酸盐缓冲液洗脱；洗脱液吸光度降至0.2以下后，取最强吸收部分进行收集，量收集液体积，测吸光值；

5)将前述步骤4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5℃以下，加入经过预冷至5℃的丙酮，沉淀，过滤，真空干燥，得眼镜蛇毒神经毒素即科博肽。

优选的，前述步骤4)中洗脱流速为30-50ml/h，最强吸收部分为在280nm处测吸光值大于0.1的最大部分；步骤5)中丙酮用量为收集液体积的2.5-3倍，沉淀时间为80-120min。

在本发明的提取方法中，采用微孔滤膜对离心后的蛇毒上清液进行过滤，去除溶液中的细菌和颗粒。由于天然蛇毒含有理化性质与神经毒素较为接近的其他大分子毒素如磷脂酶A2等，采用截留分子量为10KDa的超滤膜，可以滤除分子量大于神经毒素的至敏物质，在后续的阳离子纯化中，节约时间和成本，极大地简化了提取工艺，增加产品的安全性。针对眼镜蛇毒含碱性蛋白质较多的特点，采用阳离子交换剂CM-纤维素作固定相，采用较高的pH和离子强度的磷酸缓冲液平衡CM-纤维素，既可以使等电点较高的毒性多肽吸附在交换剂上，同时使许多等电点偏低的组分不经吸附而流出，改善了神经毒蛋白的分离。最后采用丙酮直接从溶液中沉淀眼镜蛇神经毒素，除去最终产品中的杂质，提高产品收率。

本发明的另一个目的在于提供一种由上述提取方法制备而得的眼镜蛇毒神经毒素，该物质的纯度大于95％，纯神经毒素的含量大于70％。

本发明还提供了包含上述眼镜蛇毒神经毒素加入辅料，按常规制剂工艺制成药物学意义上的各种制剂，包括注射制剂、口服液制剂，如：小容量注射剂、冻干粉针剂、普通片、口腔崩解片及分散片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、舌下片剂等。优选为小容量注射剂和冻干粉针剂。

本发明所称的常规制剂工艺以及辅料等是指在教科书、国家标准、地方标准上已经公开的方法、技术及辅料。

其中小容量注射剂和冻干粉针剂的制备方法如下：

取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80％的注射用水，使其溶解，加入氯化钠，加入配制药液总量0.06％的针用活性炭，充分搅拌，过滤，调节pH值至5-8，再加注射用水至全量2000ml，垂熔滤球过滤，灌封，115℃热压灭菌30分钟，制备成小容量注射制剂1000支，每支规格：2ml:70μg。

取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80％的注射用水溶解，再加入甘露醇，搅拌均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH值至5-8，无菌滤过，滤液分装于灭菌西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶，每瓶规格：70μg。

本发明的眼镜蛇毒神经毒素及其制剂，主要用于治疗各种慢性疼痛、血管性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、晚期癌疼痛、关节痛及麻风反应神经痛。

为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，本申请人进行了一系列实验研究，以证明本发明的效果：

实验例1、工艺研究

在眼镜蛇毒神经毒素提取过程中，本发明人对提取工艺进行了设计和选择，以最终提取物的性状、水分、有效成分含量、纯度以及纯神经毒素收率(100g蛇毒中纯神经毒素重量)为考察指标，进行了一系列的选择试验。

样品A：按照文献“一种分离提纯眼镜蛇_Najanajaatra_神经毒素的简便方法”(龚潮梁等，动物学研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)中眼镜蛇毒神经毒素提取纯化方法制备；

样品B：按照中国专利申请“一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法”CN101845089A(公开日期2010年9月29日)中实施例的方法制备；

样品C：按照文献“浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化及其镇痛作用研究”(李范珠等，中国药师，2004年09期，P659～661)中公开的浙江眼镜蛇蛇毒中神经毒素的分离纯化方法制备；

样品D：按照本发明实施例1方法制备；

样品E：按照本发明实施例1方法，去除超滤步骤2)制备；

样品F：按照本发明实施例1方法，增加脱盐步骤6)，具体如下：

6)将按照实施例1中步骤1)-5)方法得到的目的物用葡聚糖G-10凝胶柱层析进行脱盐和纯化，溶液冻干即得纯化的眼镜蛇神经毒素。

样品G：按照本发明实施例1方法，增加70℃保温步骤，具体如下：

5)将按照实施例1中步骤1)-4)方法得到的收集液集中，调PH到6.5，在70℃恒温水浴中保温半小时，进行选择性热变性处理。冷却后离心除去变性蛋白的沉淀，清液冷却到4℃，加入经过预冷至5℃的丙酮，丙酮用量为收集液体积的2.8倍，沉淀100min，滤去丙酮，真空干燥，得眼镜蛇神经毒素。

上述方法得到的目的产物的考察结果，见表1。

表1工艺选择实验结果

以上数据表明，按照上述方法提取的眼镜蛇毒神经毒素性状一致，均为白色粉末，水分均未超过5.0％，满足法定标准的要求。有效成分含量方面，样品B、D、E、F、G的含量均较理想，但是样品D、F、G的纯度较高，综合收率来看，样品F的收率较低，可能是因为提纯过程中增加了脱盐步骤，造成一定量有效成分的损失。故选择样品D和G进一步考察神经毒素活性。

实验例2、神经毒素活性考察

方法：参照Bulbring法制备大鼠膈神经-膈肌标本，置入盛有Kreb液25ml，恒温30℃浴槽中，通氧气，标本肋骨端固定于浴槽底部，中心腱接于张力换能器。用0.5ms超强方波，每15秒交替刺激神经和肌肉，待标本收缩稳定后，向浴槽中加入受试样品D和G，每份样品量不超过Kreb液容量的5％，观察样品对标本收缩的影响。

结果：在电刺激诱发大鼠离体膈神经-膈肌标本收缩实验中，上述两种样品均能抑制间接刺激引起的膈肌收缩，但不影响直接刺激膈肌引起的肌肉收缩，说明能抑制神经-肌肉接头的传递，对肌肉组织无影响，但样品D抑制作用强于样品G，这可能与在大生产的纯化过程中，增加了保温步骤，使得神经毒素变性沉淀，降低了神经毒素的生物活性。故选择样品D的提取方法，进一步考察各参数对产品的含量等的影响。

实验例3、工艺参数选择

超滤膜的大小，柱层析过程中洗脱液的浓度和流速，沉淀过程中丙酮的用量和沉淀时间等均是影响提取物质量的关键因素，本发明人对提取工艺进行了参数的设计和选择，以最终提取物的性状、水分、有效成分含量、纯度和收率为考察指标进行考察。

3.1超滤选择

药物1：按照本发明实施例1的方法制备，其中步骤2)中超滤膜更换为截留分子量为6KDa的超滤膜；

药物2：按照本发明实施例1的方法制备；

结果：

表2超滤膜大小对产物的影响

	性状	水分(％)	有效成分含量(％)	纯度(％)
					药物1	白色粉末	4.2	71.7	92.3
药物2	白色粉末	3.8	80.1	97.4

结果：眼镜蛇毒中大部分物质分子量大于10000，分子量小于7000的物质在眼镜蛇毒中含量不多。故采用10KDa的超滤膜，产品的含量和纯度得到提高，同时在后续的阳离子纯化中，简化了提取工艺，节约时间和成本。

3.2柱层析过程中洗脱液的浓度和流速选择

表3Nacl磷酸盐缓冲液浓度范围的考察

洗脱液浓度	性状	水分(％)	有效成分含量(％)	纯度(％)
					0.01、0.06	白色粉末	4.7	65.5	87.3
0.02、0.07	白色粉末	4.4	68.2	90.5
					0.03、0.08	白色粉末	4.5	72.2	97.4
0.04、0.08	白色粉末	4.0	76.3	99.1
					0.05、0.09	白色粉末	4.3	75.1	98.8
0.06、0.10	白色粉末	4.6	70.4	93.4

表4洗脱流速考察

流速(ml/h)	性状	水分(％)	有效成分含量(％)	纯度(％)
					25	白色粉末	4.2	65.5	88.7
30	白色粉末	4.7	70.3	96.5
					35	白色粉末	4.3	72.4	97.9
40	白色粉末	4.1	78.6	99.0
					45	白色粉末	4.0	76.2	98.6
50	白色粉末	4.8	74.9	96.3
					55	白色粉末	4.6	69.8	92.4

结果：Nacl磷酸盐缓冲液线性洗脱的浓度为0.03-0.05、0.08-0.09mol/L，流速范围为30-50ml/h，产品的含量和纯度较好。

3.3丙酮的用量和沉淀时间选择

表5丙酮用量范围的考察

表6沉淀时间考察

结果：丙酮的用量为收集液体积的2.5-3倍，沉淀时间为80-120分钟，产品的各项参数均较好，且用量和时间合理。

以上数据表明，选择截留分子量为10KDa的超滤膜，可有效除去分子量大于神经毒素的致敏物质等，提高产品的含量和纯度，同时在后续的阳离子纯化中，节约时间和成本，极大地简化了提取工艺，增加产品的安全性。将柱层析过程中洗脱液即Nacl磷酸盐缓冲液两步洗脱的浓度控制在0.03-0.05、0.08-0.09mol/L，流速范围为30-50ml/h，可以使等电点较高的毒性多肽吸附在交换剂上，改善了神经毒蛋白的分离；另外沉淀纯化神经毒素的过程中，选择丙酮的用量为收集液体积的2.5-3倍，沉淀时间为80-120分钟，能够较好的除去最终产品中的杂质，提高产品收率。

实验例4、急性毒性试验

4.1动物及药物

动物：小白鼠，云南省动物研究所提供，体重18-20克。

药物：按照实施例1-3的方法分别制备得到药物1、药物2、药物3，规格：2ml:70μg；

市售科博肽注射液，吉林省辉南辉发制药股份有限公司生产，规格同上，批号：20091101。

4.2方法

按照Meier方法，取经12h禁食不禁水的小鼠，分剂量组，每组10只，尾静脉或腹腔注射不同浓度的药物，注射量为0.1ml/10体重，记录注射剂量(D：mg/kg)和小鼠存活时间(T：min)，以D/T为横坐标，D为纵坐标作图，进行线性回归，得方程D＝a×D/T+b，截距b即为近似LD₅₀，计算LD₅₀的平均值及标准差(X±s)

4.3结果：注射20分钟后出现竖毛、畏缩、呼吸困难和频率加快并逐渐转为腹式呼吸，最后死于呼吸麻痹，死前有挣扎踢腿现象，呼吸停止后心跳仍可维持一段时间。近似LD₅₀如下：

表7急性毒性试验结果

结果表明采用本发明方法制得的蛇毒神经毒素，毒性与市售产品相当，甚至毒性略低一些，说明本发明方法制得的蛇毒神经毒素低毒，安全性得到保证。

实验例5、镇痛实验

1.1材料：

1.1.1药品：

本发明制剂：按照本发明的制备方法制备成注射液和冻干剂(按实施例4、5制备)，注射液规格：2ml:70μg，冻干规格：70μg。

对照药品：科博肽注射液，吉林省辉南辉发制药股份有限公司生产，规格同上，批号：20091101。

1.1.2试验对象：昆明种小鼠18～22g，雌雄各半，购于大理医学院实验动物中心。

1.2试验方法及结果

取若干只小鼠禁食12h不禁水，将小鼠放在55±1℃的恒温金属板上，密切观察小鼠反应，以小鼠舔后足为痛觉指标，用秒表记录小鼠从放置热板上到出现舔后足反应的时间为基础痛阈值，将基础痛阈不在10～30s范围内的小鼠剔除；取40只符合要求的小鼠随机分成四组，分别是实验注射液组、实验冻干剂组、对照组、空白对照组，每组10只。按体重分别给小鼠腹腔注射本发明制剂、对照药品，实验组给本发明制剂，剂量为0.05mg/kg，对照组给相同剂量对照药品，空白对照组给等容量的0.9％氯化钠溶液作空白对照。测定各组给药后4h的痛阈，计算各组给药前后的平均痛阈值，用t检验对各组给药前后的平均痛阈值的差别作显著性检验。结果见表8。

表8表小鼠痛阈反应时间

组别	注射前潜伏期(秒)	注射后潜伏期(秒)	痛阈平均提高百分率(％)
				实验注射液组	*9.87±2.39	**15.24±4.79	53.1
实验冻干剂组	*9.82±2.75	**15.21±6.03	52.6
				对照组	9.56±1.95	14.47±3.62	50.8
空白对照组	17.15±3.99	17.86±3.56	-

*P＜0.05**P＜0.01

以上数据表明，实验组药物对热板法建立的小鼠急性疼痛模型具有镇痛作用，且效果优于对照组。

具体实施方式

实施例1：眼镜蛇毒神经毒素的制备

1)将眼镜蛇粗毒粉100g溶于pH7.9，0.01M的磷酸盐缓冲液中至280ml，搅拌下溶解，以3000r/min的速度离心10min，取上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜；

3)所得到的蛇毒液上样到已用pH7.9，0.01M磷酸盐缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为40ml/h，用自动部分收集器收集洗脱液，用紫外分光光度计在280nm处进行检测。

4)洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.04mol/L的Nacl磷酸盐缓冲液洗脱，待洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.08mol/LNacl磷酸盐缓冲液洗脱。洗脱液吸光度降至0.2以下后，取吸光度大于0.1的最强吸收部分进行收集，量收集液体积，测吸光值。洗脱流速为40ml/h，收集液取280nm处吸光值大于0.1的最大部分。

5)将前述步骤4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5℃以下，加入经过预冷至5℃的丙酮，丙酮用量为收集液体积的2.8倍，沉淀100min，滤去丙酮，真空干燥，得眼镜蛇毒神经毒素即科博肽。

实施例2：眼镜蛇毒神经毒素提取物的制备

1)将眼镜蛇粗毒粉100g溶于pH8.0，0.01M的磷酸盐缓冲液中至280ml，搅拌下溶解，以3000r/min的速度离心10min，取上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜；

3)所得到的蛇毒液上样到已用pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为50ml/h，用自动部分收集器收集洗脱液，用紫外分光光度计在280nm处进行检测。

4)洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.05mol/L的Nacl磷酸盐缓冲液洗脱，待洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.09mol/LNacl磷酸盐缓冲液洗脱。洗脱液吸光度降至0.2以下后，取最强吸收部分进行收集，量收集液体积，测吸光值。洗脱流速为50ml/h，收集液取280nm处吸光值大于0.1的最大部分。

5)将前述步骤4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5℃以下，加入经过预冷至5℃的丙酮，丙酮用量为收集液体积的3倍，沉淀120min，滤去丙酮，真空干燥，得眼镜蛇毒神经毒素即科博肽。

实施例3：眼镜蛇毒神经毒素提取物的制备

1)将眼镜蛇粗毒粉100g溶于pH7.8，0.01M的磷酸盐缓冲液中至280ml，搅拌下溶解，以3000r/min的速度离心10min，取上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜；

3)所得到的蛇毒液上样到已用pH7.8，0.01M磷酸盐缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为30ml/h，用自动部分收集器收集洗脱液，用紫外分光光度计在280nm处进行检测。

4)洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.03mol/L的Nacl磷酸盐缓冲液洗脱，待洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.08mol/LNacl磷酸盐缓冲液洗脱。洗脱液吸光度降至0.2以下后，取最强吸收部分进行收集，量收集液体积，测吸光值。洗脱流速为30ml/h，收集液取280nm处吸光值大于0.1的最大部分。

5)将前述步骤4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5℃以下，加入经过预冷至5℃的丙酮，丙酮用量为收集液体积的2.5倍，沉淀80min，滤去丙酮，真空干燥，得眼镜蛇毒神经毒素即科博肽。

实施例4：科博肽注射液的制备

取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80％的注射用水，使其溶解，加入氯化钠，加入配制药液总量0.06％的针用活性炭，充分搅拌，过滤，调节pH值至5-8，再加注射用水至全量2000ml，垂熔滤球过滤，灌封，115℃热压灭菌30分钟，制备成小容量注射制剂1000支，每支规格：2ml:70μg。

实施例5：注射用科博肽的制备

取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80％的注射用水溶解，再加入甘露醇，搅拌均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH值至5-8，无菌滤过，滤液分装于灭菌西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶，每瓶规格：70μg。

实施例6：产品质量检测

样品：以实施例1-5中所述方法制得的科博肽原料和制剂，编号样品1-5；

样品6：科博肽注射液，吉林省辉南辉发制药股份有限公司生产，规格2ml:70μg，批号：20091101。

采用国家药品监督管理局国家药品标准(原料标准编号：WS1-XG-009-2000，注射液标准编号：WS-10001-(HD-0833)-2002，注射用科博肽标准编号：WS1-XG-010-2000)记载的检测方法测定提取物的各项指标。

1、含量测定

取样品1-3、5各一份适量，加水制成每1ml中含约0.6mg蛋白的溶液，精密取1.0ml；精密量取样品4、6各一份1.0ml，将上述样品液按照质量标准中“福林酚测定法”测定，从回归曲线中求得样品中的蛋白含量。

结果：按干燥品计算，样品1-5中神经毒蛋白的含量分别为80.1％、76.5％、74.3％、100.2％、99.9％，样品6中神经毒蛋白的含量为89.2％。产品含量得到明显提高。

检测标准为：原料：不得少于35.0％；注射液和冻干剂：应为标示量的80.0％-120.0％。

2、纯度检查

测定方法：取样品1-6各一份，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中含0.3mg的溶液，作为供试品溶液，照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录)试验，以辛基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％三氟醋酸溶液为流动相A，三氟醋酸-50％乙腈溶液(1∶1000)为流动相B，柱温36℃，流速为每分钟1ml；检测波长214nm；洗脱初始状态流动相B为8％，保持4分钟，在12分钟内，流动相B增至100％，保持6分钟，再在6分钟内回到初始状态，保持10分钟。理论塔板数按神经毒蛋白的峰计算应大于3000。

取样品溶液50μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。按面积归一化法计算，主峰的相对百分含量不得少于90％。

结果：样品1-5的纯度分别为99.1％、98.4％、97.6％、98.8％、97.9％，样品6的纯度为92.2％。产品纯度得到了改进。

3、水分

取样品1-3各一份，用KarlFischer方法测定，含水不得超过5.0％。

结果：样品1-3含水分分别为4.1％、4.5％、4.3％。符合规定。

4、稳定性

4.1加速稳定性试验：随机选取样品1、4、5、6各1份，在25±2℃，相对空气湿度为60±10％的条件下放置，分别在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末取样一次进行考察。

4.2长期稳定性试验：随机选取样品1、4、5、6各1份，在2-10℃下避光贮存，于3、6和12个月末时取样一次进行考察。

上述考察以性状、水分、有效成分含量、纯度为指标，检查产品的稳定性，结果见表9、表10。

从上述试验结果可看出，本发明制备的科博肽及制剂样品与市售科博肽样品经过加速试验和长期试验，各考察项目均不见异常，有效成分含量未发生明显变化，符合质量标准要求，且检测结果中表明本发明制备方法所得样品稳定性高于市售科博肽样品。

Claims (9)

1.一种眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物，由眼镜蛇蛇毒提取纯化制备而成，其特征在于：提纯方法为：

1)将眼镜蛇粗毒溶于磷酸盐缓冲液中，离心，上清液过微孔滤膜；

2)对滤液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜进行；

3)所得到的蛇毒液采用阳离子柱进行纯化，用含Nacl的磷酸盐缓冲液线性洗脱，收集神经毒素粗品，冷冻，加丙酮沉淀，滤去丙酮，真空干燥，即得目的产物。

2.如权利要求1所述的眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物，其特征在于：提纯方法为：

1)将眼镜蛇粗毒溶于pH7.8-8.0，0.01M的磷酸盐缓冲液中，离心，取上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)对滤液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜进行；

3)所得到的蛇毒液上样到已用pH7.8-8.0，0.01M磷酸盐缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为30-50ml/h，用自动部分收集器收集洗脱液，用紫外分光光度计在280nm处进行检测；

4)洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.03-0.05M Nacl的磷酸盐缓冲液洗脱，待洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.08-0.09M Nacl磷酸盐缓冲液洗脱；洗脱液吸光度降至0.2以下后，取最强吸收部分进行收集，量收集液体积，测吸光值；

5)将前述步骤4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5℃以下，加入经过预冷至5℃的丙酮，沉淀，过滤，真空干燥，即得目的产物。

3.如权利要求2所述的眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物，其特征在于：前述步骤4)中洗脱流速为30-50ml/h，最强吸收部分为在280nm处测吸光值大于0.1的最大部分；步骤5)中丙酮用量为收集液体积的2.5-3倍，沉淀时间为80-120min。

4.如权利要求1-3任一所述眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物，其特征在于：提取物的含量大于70％、纯度大于95％。

5.一种包含权利要求4所述眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物以及药学上可接受的辅料的制剂。

6.如权利要求5所述的制剂，其特征在于：所述制剂为注射制剂、口服制剂，具体为小容量注射剂、冻干粉针剂、普通片、口腔崩解片及分散片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、舌下片剂。

7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于：所述制剂为小容量注射剂和冻干粉针剂。

8.如权利要求7所述的眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物制剂，其特征在于：

1)将眼镜蛇粗毒粉100g溶于pH7.9，0.01M的磷酸盐缓冲液中至280ml，搅拌下溶解，以3000r/min的速度离心10min，取上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜；

3)所得到的蛇毒液上样到已用pH7.9，0.01M磷酸盐缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为40ml/h，用自动部分收集器收集洗脱液，用紫外分光光度计在280nm处进行检测；

4)洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.04mol/L的Nacl磷酸盐缓冲液洗脱，待洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.08mol/LNacl磷酸盐缓冲液洗脱；洗脱液吸光度降至0.2以下后，取吸光度大于0.1的最强吸收部分进行收集，量收集液体积，测吸光值；洗脱流速为40ml/h，收集液取280nm处吸光值大于0.1的最大部分；

5)将前述步骤4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5℃以下，加入经过预冷至5℃的丙酮，丙酮用量为收集液体积的2.8倍，沉淀100min，滤去丙酮，真空干燥，得眼镜蛇毒神经毒素即科博肽；

6)取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80％的注射用水，使其溶解，加入氯化钠，加入配制药液总量0.06％的针用活性炭，充分搅拌，过滤，调节pH值至5-8，再加注射用水至全量200Gml，垂熔滤球过滤，灌封，115℃热压灭菌30分钟，制备成小容量注射制剂1000支，每支规格：2ml:70μg。

9.如权利要求7所述的眼镜蛇蛇毒神经毒素提取物制剂，其特征在于：

1)将眼镜蛇粗毒粉100g溶于pH7.9，0.01M的磷酸盐缓冲液中至280ml，搅拌下溶解，以3000r/min的速度离心10min，取上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)所得到的上清液进行超滤并交换为分离缓冲液，采用截留分子量为10KDa的超滤膜；

3)所得到的蛇毒液上样到已用pH7.9，0.01M磷酸盐缓冲液平衡的CM-纤维素层析柱，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为40ml/h，用自动部分收集器收集洗脱液，用紫外分光光度计在280nm处进行检测；

4)洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.04mol/L的Nacl磷酸盐缓冲液洗脱，待洗脱液吸光度降至0.2以下，用含0.08mol/LNacl磷酸盐缓冲液洗脱；洗脱液吸光度降至0.2以下后，取吸光度大于0.1的最强吸收部分进行收集，量收集液体积，测吸光值；洗脱流速为40ml/h，收集液取280nm处吸光值大于0.1的最大部分；

5)将前述步骤4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5℃以下，加入经过预冷至5℃的丙酮，丙酮用量为收集液体积的2.8倍，沉淀100min，滤去丙酮，真空干燥，得眼镜蛇毒神经毒素即科博肽；

6)取70mg科博肽原料，加入配制药液总量80％的注射用水溶解，再加入甘露醇，搅拌均匀，加注射用水至全量2000ml，搅匀，调节pH值至5-8，无菌滤过，滤液分装于灭菌西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂1000瓶或500瓶，每瓶规格：70μg、140μg。