CN103638060A - 侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒多肽有效部位及其制备和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒多肽有效部位及其制备和医药用途。具体而言，该有效部位是从侧狭腹胡蜂（Parischnogaster spp.）粗蜂毒中以截留分子量为25KDa的透析膜透析，析出液经冷冻干燥或者减压浓缩干燥而得。本发明人经一系列药效学实验验证了该生物毒素多肽有效部位及其透皮吸收制剂具有显著防治脑血栓生成、恢复脑瘫动物活动能力、减轻缺血性脑损伤的功效，药效学表现强于波立维、醒脑静等一线用药，可预期用于制备防治心脑血管疾病生化药物，用以预防和治疗缺血性心脑血管等疾病，例如心梗、心血管血栓、脑血栓、脑梗、急/慢性脑卒中，及由脑梗塞损伤带来的后遗症如侧偏瘫、偏身感觉障碍、偏盲、面舌瘫、失语、全身瘫痪。

Description

侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒多肽有效部位及其制备和医药用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种侧狭腹胡蜂属（Parischnogasterspp.）昆虫中多肽有效部位的制备方法及医药用途。该有效部位是由侧狭腹胡蜂属胡蜂的粗蜂毒以25KDa的透析膜透析，析出液经冷冻干燥或者减压浓缩干燥而得。本发明人经一系列动物体内外药理药效学实验发现，该多肽有效部位具有显著防治脑血栓生成、恢复脑瘫动物活动能力、减轻缺血性脑损伤的功效，可预期用于制备防治心脑血管疾病包括缺血性脑血管疾病和缺血性心血管疾病的药物、保健品、医疗器械和日化用品。

背景技术

心脑血管疾病是当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤而跃居世界第一。目前，全球有高血压患者6亿人，高血压患病率约10％。心脏病和中风等心脑血管疾病也是我国首位死亡原因。北京市卫生局披露，上世纪80年代后，北京地区心血管病和脑中风的发病率都呈明显上升的趋势，到2006年，心脑血管疾病占到居民总死亡原因的44%，已经成为北京居民的第一位杀手。2005年中国卫生部公布的资料显示：中国人口的总死亡率中心脑血管疾病死亡率高居首位，城市居民脑血管死亡率达21.2%，心脏病死亡率17.9%；而农村居民脑血管死亡率也达21.2%，心脏病死亡率11.8%。中国每年有将近300万人死于心血管疾病，每天有7000多人死于心血管疾病，大约每12秒钟倒下1位。近十几年35～55岁男性心肌梗死死亡增加速度最快。随着生活水平的提高和生活节奏的加快，心脑血管疾病现已进入窗口期，未来十年将爆发流行。

心脑血管疾病是两大类疾病的总称，它可分为心血管疾病和脑血管疾病。心血管疾病以冠心病为主，冠心病又称冠状动脉硬化性心脏病，是由于供应心肌血液的冠状动脉发生粥样硬化，使动脉血管变窄，心肌供血不足造成的；由于冠状动脉病变引起管腔狭窄或闭塞的临床症状，在时间长短、程度轻重上不尽相同，因此可表现为隐性心脏病、心绞痛、心肌梗塞、心肌硬化和心源性猝死等多种形式。脑血管病则是指脑血管破裂出血或血栓形成，引起的以脑部出血性或缺血性损伤症状为主要临床表现的一组疾病，俗称脑中风。

心脑血管疾病已成为危害人们生命和健康的“第一杀手”，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”之“四高一多”的特点。临床类型上分为（1）完全性卒中：发病后神经功能缺失症状较重较完全，常于数小时内（<6小时）达到高峰。（2）进展性卒中：发病后神经功能缺失症状在48小时内逐渐进展或呈阶梯式加重。（3）可逆性缺血性神经功能缺失（RIND）：发病后神经缺失症状较轻，持续24小时以上，但可于3周内恢复。

脑血管病具体而言，是指脑血管破裂出血或血栓形成，引起的以脑部出血性或缺血性损伤症状为主要临床表现的一组疾病，又称脑血管意外或脑卒中，俗称为脑中风，是当前三大致死疾病之一。临床流行病学资料显示，我国脑卒中发生率150万/年，死亡100万/年。据国外统计资料，脑血管病以缺血性为多见，脑梗塞占59.2%～85%。而脑出血除日本外，一般在20%以下。中国1984年农村调查新发完全性卒中280例，蛛网膜下腔出血占3.9%、脑出血占44.6%、脑血栓占46.4%、脑栓塞占2.5%、难以分型者占2.9%。由以上资料可看出缺血性脑血管疾病中脑血栓发病几率为最高。

目前，在针对脑血栓的治疗上，主要采用（1）超早期溶栓治疗：目的是溶解血栓，迅速恢复梗死区血流灌注，减轻神经元损伤；溶栓应在起病6小时内的治疗时间窗内进行才有可能挽救缺血半暗带。（2）抗凝治疗：目的在于防止血栓扩展和新血栓形成；常用药物有肝素、低分子肝素及华法林等；治疗期间应监测凝血时间和凝血酶原时间，还须备有维生素K、硫酸鱼精蛋白等拮抗剂，以便处理可能性的出血并发症。（3）脑保护治疗：可采用钙离子通道阻滞剂、镁离子、抗兴奋性氨基酸递质、自由基清除剂和亚低温治疗。（4）降纤治疗：通过降解血中纤维蛋白原，增强纤溶系统活性，抑制血栓形成；药物有：降纤酶、巴曲酶、安克洛酶和蚓激酶等。（5）抗血小板聚集治疗：发病后48小时内对无选择的急性脑梗死病人给予阿司匹林100～300毫克/天，可降低死亡率和复发率，但在进行溶栓及抗凝治疗时不要同时应用，以免增加出血的风险；其他抗血小板聚集剂如噻氯匹定、氯吡格雷等也可应用。（6）其他药物治疗：血管扩张剂可导致脑内盗血及加重脑水肿，宜慎用或不用；神经细胞营养剂包括三类：影响能量代谢类（急性期不宜使用）、影响氨基酸及多肽类、影响神经递质及受体类。

随着对环保要求的日益提高，以及研发出的化学制剂毒性和副作用越来越大，使得医药界、药企、及患者不得不将眼光转向广谱、低毒、使用安全的“绿色治疗药物”。不断研发出新的植物和动物天然绿色抗心脑血管疾病生化新药，是十几亿人口的人口大国必须执行的一个既定政策。

由于缺血性脑血管疾病发病机制复杂，当前对其治疗药物也比较多，这些治疗药物中有植物药、动物药和矿物药。而动物药物在治疗脑血管疾病方面效果显著，历来备受医学界关注，对于动物药物治疗脑血管疾病研究较多的有水蛭制剂、蛇毒制剂、地龙制剂等。

动物药物保护缺血性脑损伤多通过降低兴奋性神经递质和酸的毒性作用、抑制脂质过氧化和硝化反应、减轻炎症反应和抑制细胞凋亡等途径来实现，具有多靶点、多层次、多环节的脑保护作用。动物毒素及其提取物对脑缺血的治疗作用及其机制研究中，研究的较多的是（1）蛇毒：现今国家药监局批准上市并在在治疗脑血管疾病时使用的蛇毒制剂主要包括去纤酶、蛇岛蝮蛇抗栓酶(SVATE I)、蝮蛇抗栓酶(SVATE)、江浙蝮蛇抗栓酶(SVATEII)、蕲蛇酶、消栓灵、精制溶栓酶，以及由日本推向中国市场的东菱克栓酶(DF-521)、俗称巴曲酶。（2）水蛭制剂：水蛭素是一种多肽，现代药理学研究证明，水蛭素具有抗凝、抗血小板集聚、改善微循环等药理作用，大量临床试验表明，水蛭素比肝素能更有效地预防深静脉血栓形成。（3）地龙制剂：地龙的活性成分蚓激酶能抑制脑缺血后血栓形成、减轻脑组织损伤，提示蚓激酶可作为脑血管疾病的防治药物。（4）全蝎：蝎毒纤溶活性肽对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与抑制炎性细胞因子表达有关。（5）虻虫：虻虫提取液具有弱抗凝血酶作用，尔瘤虻Hybomitra erberi(Brauer)虻虫中含有的多糖类物质能显著著延长小鼠、大鼠凝血时间，并能降低内、外源凝血系统因子的活性，增加纤溶系统的活力，从而防治血栓的形成。（6）土鳖虫：土鳖虫水提物1毫克/公斤静注10分钟后，夹闭通气管致动物缺氧，发现其可使兔耐缺氧功能明显增强，土鳖虫水提取液能明显延长小鼠耐缺氧时间；增强脑组织中SOD的活性，降低NOS活性，增加GSH含量和降低NO、MDA的含量。说明土鳖虫提取液对脑缺血再灌注小鼠具有一定的保护作用；其机制可能与抗氧化和抑制自由基NO的生成有关。（7）蜘蛛：虎纹蜘蛛毒素-I（HWTX-I）蛛网膜下腔用药对全脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用；其机制可能是通过抑制Fas分子启动的死亡信号转导通路激活而发挥作用。（8）蜈蚣：蜈蚣具有抗凝和溶血栓作用，机制可能与其毒液中的蛋白酶、溶血因子及其它血液系统活化因子等密切相关；采用线栓法建立大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，提示蜈蚣提取液能通过降低局灶性脑缺血再灌注大鼠血浆vWF和TPO的含量，改善脑缺血再灌注造成的损伤，改善内皮细胞损伤和血小板功能，有效抑制血小板黏附和聚集，防止血栓形成，从而减轻脑缺血再灌注造成的损伤，可作为防治心脑血管疾病的途径。此外还有僵蚕、水牛角、麝香等动物药物也可应用于脑血栓疾病的防治。[赵海荣，巫秀美，张成桂，郭云胶，杨自忠，张敬新，赵昱，等；Animal drugs on treatment of cerebral ischemia and its mechanism，CHAMC,2014]。此外，叶口蝠的蝙蝠唾液、蜜蜂蜂毒肽也报道有溶栓成分。

蜜蜂蜂毒(bee venom)存在于蜜蜂毒囊内的毒液，含碳、氢、硫、磷、钙、氯、氮等元素，系透明液体，呈酸性反应。蜜蜂蜂毒具有溶血和抗凝血作用，在治疗剂量时，对人体极少引起溶血反应，在较大剂量时，在体内外都能使血液凝固时间明显延长，表明蜂毒具有活血化瘀的治疗作用。另外还具有降低血栓素的功效，在改善微循环的基础上起缓解关节症状的作用。

关于各类蜂毒，国内外均有研究。（1）国外研究状况：1888年奥地利内科医师PhillipTerc发表的一篇题为“关于蜂蜇和风湿病的特殊关联”的报道拉开了现代蜂疗尤其是蜂毒疗法(Bee venom therapy,BVT)的研究序幕。美国佛蒙特州的养蜂人玛耶兹·查尔斯(CharlesMraz)经过多次实际应用，确信蜂毒具有缓解自身免疫性疾病如多发性硬化和风湿性疾病的症状和抗炎的作用。1967年Habermanm首先从蜜蜂蜂毒中分离出由26个氨基酸组成的蜂毒素，并分析了氨基酸序列，证明其结构中无二硫键。1979年Hirai等首次从黄胡蜂(Vespulalewisii)毒液中分离出一种含有l4个氨基酸残基的阳离子多肽类毒素，Mastopara（MP）是胡蜂毒液致毒、致死的主要因子之一。因其具有诱导鼠肥大细胞脱颗粒并释放组胺的功能，所以称之为“组胺释放因子”。1995年Reita等在证实亚剂量膜攻击复合物可降低补体对细胞的损伤基础上，进一步观察了亚剂量蜂毒素对补体损伤细胞的影响。发现亚剂量蜂毒素可明显降低补体对细胞的溶解率。1997年Shamsher利用合成的蜂毒素观察了对分泌型磷脂酶A2的影响；结果表明，蜂毒素可抑制各种来源分泌型磷脂酶A2的活性，对类风湿性关节炎患者滑液中磷脂酶A2活性的抑制率可达96％。（2）国内研究状况：1987年伍爱蝉经研究发现全蜂毒及其各种组分对体内或体外动物实验的药理作用不同。1996年余晓东等对意大利蜜蜂毒组分研究发现，蜂毒有诱导血小板聚集的作用。1996年徐彭等研究发现蜂毒有活血化瘀的作用。2001年王关林等利用大肠杆菌研究并表达蜂毒素前体蛋白。2004年张晨等研究表明，蜂毒素可以干扰肝癌细胞细胞周期的正常移行，将细胞阻滞于S期，并且呈剂量依赖性，造成大量的S细胞的堆积。2005年王斌等发现蜂毒肽单独使用对NK杀伤活性影响不大。嵌合蛋白NK杀伤活性的增强作用最为显著，杀伤率显著高于正常对照组。2009年朱文赫等人工合成含肠激酶切割位点的蜂毒明肽基因，构建了含蜂毒明肽的大肠杆菌融合表达载体，实现了蜂毒明肽与GST基因的融合表达。2009年李爱剑、梁枫发现蜂毒素在体外对人胃癌细胞BGC的增殖具有抑制作用。本发明人所在的大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心发表了关于胡蜂蜂毒作为新的健康产业之昆虫药物的应用前景[Heng Liu等,Utilization of Polislidae wasp venom as potential new insectsdrugs in the R&D wellness industry,International Journal of Biotechnology for WellnessIndustry,2012,1:241-249]。

侧狭腹胡蜂属（Parischnogaster spp.Schulthess）属昆虫纲有翅亚纲膜翅目（Hymenoptera）细腰亚目（Apocrita）针尾部（Aculeata）胡蜂总科（Vespoidea）狭腹胡蜂科（Stenogastridae）昆虫，云南省分布不足6种，主要集中于滇南部，属社会性胡蜂，结巢群居。由于很多独特的该属昆虫资源集中在云贵地区，国内其他省份及国外同行对其研究及其活性报道均较少。本发明人所在的大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心在对云贵高原的药用昆虫抗心脑血管类疾病药物的系列研究过程中，对该属各种昆虫进行了综合全面的采集、种属鉴定；并进一步实施了各不同种侧狭腹胡蜂的蜂毒采集、纯化、得到不同的提取部位，比较了其抗心脑血管类疾病的多种药效学活性，完成了药物开发的前期研究工作。

根据文献，我国针对“蜂毒”的应用多为复方，且对于蜜蜂蜂毒研究的较多。对于野生胡蜂的研究，尤其是特种侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒中纯化得到的有效部位治疗心脑血管的相关报道尚未见到。已公开的资料有：（1）精制方法类：2007年张文礼、孙井元公开的“蜂毒的精制方法”（公开号CN101088514A）；公开了一种将粗蜂毒溶于乙醇中除去蜂胶等杂质得到精制蜂毒。同年其后，二人又公开了一种“蜂毒肽的分离提纯方法”（公开号CN101089017A），描述了将粗蜂毒用水浸洗、乙醇沉淀、氢氧化铵及正丁醇萃取，丙酮沉淀等一系列操作，最终通过G-10柱脱盐、G-25柱纯化和脱盐冻干得到电泳级蜂毒肽melittin的制备方法。2009年，张文礼又申报了“蜂毒肽的提纯方法”（公开号CN101455287A），描述了对上述专利制备方法的改进，从而保留了蜂毒肽四聚体不被截留掉，工艺步骤减少，产率提高的制备方法。1994年，刘尽晖、王远程、杨峰公开了一种用过滤、超滤、透析除掉大分子和小分子的蜜蜂毒多肽制备方法。2009年刘卫华、李明申报的“一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用”（授权号CN100547000C），描述了一种用凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到分子量为1387.7道尔顿的单链多肽。（2）蜂毒肽的应用方面：2005年，郑江等公开了一种“蜂毒肽及其应用”（公开号CN1704431A），描述了用树脂合成INLKAIAALAKKLL-NH2的小分子肽及其用于制备杀灭细菌和治疗脓毒症的药物。2009年赖仞、徐学清申请了“胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用”（授权号CN100475840C），描述了分子量为1316.6道尔顿的NH2-IDWKGIAAMAKI-COOH的胡蜂抗菌肽，主要是通过离心、凝胶柱层析、离子交换柱层析、反相HPLC柱纯化得到，并测试了其对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞的抑制作用。（3）生物工程及应用方面：2001年，美国泛太平洋制药公司公开了“蜂毒蛋白的有用特性和编码这种蜂毒蛋白的基因”（公开号CN1313895A），描述了从蜜蜂毒液中分离的新型蛋白、其抗体和编码改蛋白的核酸，用于治疗风湿性关节炎和炎症。2002年，张素方、施婉君、程家安、张传溪公开了“墨胸胡蜂蜂毒溶血肽前体基因及其编码的多肽和制备方法”（公开号CN1385526A）和“额斑黄胡蜂溶血肽前体基因及编码的多肽和制备方法”（授权号CN1385525A）。2005年，张素方、施婉君、程家安、张传溪、沈立荣等又先后公开了“大胡蜂镇静肽前体基因及其编码的多肽和制备方法”（授权号CN1194089C）和“中华蜜蜂大胡蜂溶血肽前体基因及编码的多肽和制备方法”（授权号CN1233830C）。2006年，王斌等公开了“蜂毒素与基因变构白细胞介素2嵌合体蛋白”（公开号CN1754960A），作为治疗肿瘤的基因工程药物尝试。2007年颜炜群、许天敏公开了“尿激酶型纤溶酶激活剂a链与蜂毒素的融合蛋白及其制备”（公开号CN101337992A），描述了一种由尿激酶型纤溶酶原激活剂a链与蜂毒素结合形成的融合蛋白、其制备方法及该融合蛋白在肿瘤治疗中的作用。2008年，瑞普生物药业有限公司申报了“重组ceeA-mil杂合基因抗菌肽”（公开号CN101323644A），根据天蚕素A和蜂毒素，用基因工程方法构建酵母表达一种重组蛋白，测试了其抗菌活性，借此尝试一种重组抗菌肽。2009年，重庆大学胡宗利等公开了“蜂毒肽基因裂殖酵母工程菌及其构建方法和应用”（授权号CN101591622B）。同年，浙江大学沈立荣等公开了一种“中华蜜蜂王浆抗菌肽AccRoyalisin基因及其编码多肽与应用”（公开号CN101705231A），并测试了用发酵工程方法重组的Royalisin产物抗真菌活性。2011年华南农业大学谢青梅等公开了一种“一种重组蜂毒肽及其应用”（公开号CN102229664A），用该基因重组药物治疗鸡输卵管疾病。同年，浙江大学叶恭银等公开了一种“蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽及应用”（公开号CN102260348）；意图用于转基因作物或改造植物共生菌。（4）制剂方面，杨孟君2001年公开了一种“纳米胡蜂制剂药物及其制备方法”（公开号CN1366926A），描写了以胡蜂虫体为原料，超微粉碎后，经过系列处理，用超音速射流技术制备的纳米胡蜂制剂。沈阳药科大学崔福德、寸冬梅于2003年申报的“蜂毒的可生物降解微球注射剂及其制备方法”描述了对于蜜蜂毒的微球制剂剂型尝试，但并无药理实施例。2009年崔福德等又申报了一种“用于口服给药的蜂毒肽复合物纳米粒及其制备方法”（公开号CN101406691A）；描述了用纳米技术将蜜蜂毒制成蜂毒肽复合物纳米粒，用于口服。以上制剂均无描述纯化后的胡蜂毒有效部位，尤其是产于云南特殊种群的侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒有效部位的透皮吸收制剂制备方法；更无其生理活性和对于心脑血管的药效学的活性方面的相关报导。

显然，上述公开的各项发明均未对隶属于特殊种群的侧狭腹胡蜂属昆虫种类及其抗脑血栓方面的活性进行研究。鉴于生物界由于地理、气候环境不同造就出的丰富的生物多样性对生理活性的影响至关重要，昆虫不同的种属之间结构差异千差万别，仅仅氨基酸的排列不同就导致生物活性的巨大差异。故而，专门针对西南地区生物多样性最高的、全国昆虫种类最多的云南省之狭腹胡蜂科侧狭腹胡蜂属昆虫毒素进行系统采集和生物活性测定尚属首次，然却十分必要。对于维护生物资源安全性，率先报道云南胡蜂总科侧狭腹胡蜂属药用昆虫资源以前未研究过的防治心脑血管疾病活性的意义重大。

胡蜂总科狭腹胡蜂科（Stenogastridae）的侧狭腹胡蜂属Parischnogaster spp.Schulthess昆虫主要集中于滇南部，是云南省优势资源。为明确云贵高原药源广泛分布的侧狭腹胡蜂属昆虫毒素是否具有治疗缺血性心脑血管疾病活性及其医药用途，侧狭腹胡蜂胡蜂属蜂毒多肽有效部位的TTS制剂治疗缺血性心脑血管疾病的强度比较及由此指导进一步弄清其中起主要药理作用的物质结构基础，从分子药理学基础上阐明侧狭腹胡蜂胡蜂属昆虫毒素多种生物活性的作用机制，大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心的研发团队对分布于云南省境内的民间习用侧狭腹胡蜂属昆虫进行了综合采集和药效学活性研究。

经皮给药是药物通过皮肤给药的一种方法，药物应用于皮肤后，以恒定速度（或接近恒定速度）穿过角质层，扩散通过皮肤，由毛细血管吸收进入体循环，产生全身或局部治疗作用，通常文献上称为经皮治疗系统(transdermal therapeutic system，简称TTS)或经皮给药系统(transdermal drug delivery system，简称TDDS)。经皮给药的特点：（1）可避免肝脏的首过效应和药物在胃肠道中的灭活，药物的吸收不受胃肠道因素的影响，减少用药的个体差异。（2）可维持恒定有效的血药浓度或生理效应，避免口服给药引起的血药浓度峰谷现象，降低毒副反应。（3）减少给药次数，提高治疗效能，延长作用时间，避免多剂量给药，使大多数病人易于接受。（4）使用方便，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药。

正因为这些优点，TTS系统的研发是目前药物制剂研发的热点之一，并且发展迅速，如硝酸甘油贴片自80年代问世以来一直是世界上最畅销的50种药物之一。TTS系统是被国内医药界普遍认可的继口服和注射之后的第三代药物制剂新剂型，是当代制药业理应掌握的高新技术，在药物制剂学上具有里程碑的意义。作为第三代药物新剂型，TTS系统不仅是世界上发展最快的药物研究领域之一，而且在欧、美等发达国家已经产生了巨大的经济效益。自1981年第一个TTS产品东莨菪碱贴片问世以来，TTS立即受到了广大患者的欢迎。据报道，在1992年Nicotin-TTS（尼古丁贴剂）的销售额就达到10亿美元，远远超过其他戒烟产品，被美国《时代》杂志评为当年美国最受欢迎的十大产品之一；1999年仅Voltaren公司和Lamisil公司生产的Estraderm（雌二醇贴剂）和Nitroderm（硝化甘油贴剂）的销售额分别达到3.8亿和3.3亿美元。具有强效麻醉性镇痛药芬太尼贴片在2002年开始销售就达年销售额15.9亿美元。TTS是当今世界一种科技含量高、范围广、使用方便的新型外用贴剂，开发前景广阔，潜在经济效益巨大。

TTS产品中透皮给药已选用的药物主要有以下几类：【性激素】–黄体酮、睾酮、炔诺酮、18-甲基炔诺酮、雌二醇、前列腺素、加压素、雌孕激素+黄体酮等；【心血管药】–硝苯地平、尼群地平、氨氯地平、消心痛、硝酸甘油、尼卡地平、普萘洛尔等；【神经系统药】–毒扁豆碱、吗啡、二氢埃托啡、酮洛酸、芬太尼等；【消炎镇痛药】–消炎痛、酮洛芬、氟比洛芬、布洛芬、双氯芬酸等；【平喘药】–妥洛特罗、特布他林等。目前，国际经皮给药市场发展迅猛，日新月异，根据世界卫生组织（WHO）预测，到2025年，将有1/3的现用药将采用经皮吸收制剂，TTS系统的产值将达到数百亿美元。因此，TDDS给药产品的研发受到广泛关注，将在药物使用史上翻开新的一页。

国内贴剂市场中，传统狗皮膏(古老的经皮给药方式)类中药贴片占据了一大半以上的市场份额，而中药和化学药品透皮贴剂的市场份额则微不足道。目前国内透皮制剂市场规模之所以比较小，主要是受国内制剂技术水平的限制。我国TTS系统在研究和开发方面与发达国家相比还存在比较明显的差距，特别是工业生产配套水平较低，尚未能形成规模生产能力。大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心承担的动物药经皮给药科研平台建设项目对此做了大量准备。不仅购置了世界先进的巴布膏涂布机等一批TTS专用仪器，还大力引进了专攻透皮制剂的科研团队。本发明中的各类蜂毒TTS制剂，即是在大理学院云南省创新团队昆虫药物透皮制剂GMP车间制备的。

防治脑血栓形成的方法主要是：溶栓、抗血小板聚集、抗凝。但是提高病人的存活率和生活质量仍是脑血管疾病治疗的难题。即便存活，也有其中约50%病人可留有不同程度的后遗症。因此，提高对该症的认识、探索有效的治疗方法和药物，实属当务之急，也无疑具有重要的理论价值及临床意义。本发明人团队从药物的溶栓作用、抗凝活性、药物对血小板功能的影响、复制脑血栓形成四方面入手，在复制脑血栓动物模型的基础上，测试相应的神经生理学及生理生化指标，探讨药物对该模型的影响，以期为脑血管疾病解决实质上的问题。

在对云贵高原采集得到的胡蜂总科昆虫的研究中，我们发现侧狭腹胡蜂属胡蜂的粗蜂毒有一定的抗凝血作用，继而多次试验发现小于25KDa的有效部位具有对抗局灶性脑缺血大鼠损伤的作用。本发明人还发现：外用于小鼠、大鼠等动物脑部和鼻部的原料药物效果优于其他口服、肌注、静注等给药途径。因此，本发明人设计了以现代制剂技术制备出一系列透皮吸收制剂，并将各种该TTS制剂应用于抗心脑血管疾病药理及药效实验中，发现：胡蜂毒多肽有效部位透皮制剂有着无可替代的优势，其起效时间快、毒性低、作用强度大、使用剂量小。最重要的是，一旦发现施用对象有不适症状或毒性反应后可以随时停药，保证了实验动物和临床使用之病人的安全性。

本发明使用不同体内外模型，测试了侧狭腹胡蜂属粗蜂毒经由透析膜制备出的侧狭腹胡蜂属蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂（以水凝胶、巴布剂、涂膜剂为例）对大、小鼠血栓、脑梗、血小板聚集、断头小鼠呼吸时间、动物脑组织通透性、对局灶性脑缺血大鼠脑栓塞等模型的药理活性。试验结果发现：侧狭腹胡蜂属蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂具有显著的抗血栓、抗脑梗、抗血小板聚集、延长断头小鼠呼吸时间的功效。有部分TTS药物制剂的药效活性超过多种脑缺血性疾病的一线用药和重磅炸弹类畅销药。可以作为防治心脑血管疾病创新性天然药物进一步深入开发，从而构成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供了一种从侧狭腹胡蜂属胡蜂中提取的多肽有效部位及其制备方法，其特征是：该有效部位是从侧狭腹胡蜂属胡蜂粗蜂毒中以25KDa的透析膜透析，析出液经冷冻干燥或者减压浓缩干燥而得，其中多肽含量占比不低于50%。

本发明的另一目的是提供了将侧狭腹胡蜂属胡蜂多肽有效部位用于制备防治心脑血管疾病的药物用途，其特征是：所述心脑血管疾病是指缺血性脑血管疾病、缺血性心血管疾病；具体是指心梗、心血管血栓、脑血栓、脑梗、急/慢性脑卒中，及由脑梗塞损伤带来的后遗症如侧偏瘫、偏身感觉障碍、偏盲、面舌瘫、失语、全身瘫痪等。该药物用途是通过药物制剂、医疗器械、日化用品形式得以体现；所述药物制剂、医疗器械、日化产品的形式是水凝胶、泡沫凝胶、涂膜剂、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、外用搽剂、软膏剂。

本发明的再一目的是提供了一种具有防治心脑血管疾病活性的药物组合物，其特征是：该药物组合物含有治疗有效量的从侧狭腹胡蜂属胡蜂中提取的多肽有效部位、药用辅料、药用载体或敷料。

本发明中的动物原料药物蜂毒多肽采自膜翅目胡蜂总科狭腹胡蜂科侧狭腹胡蜂属昆虫虫体。

本发明提供了一种侧狭腹胡蜂属蜂毒经透析膜制备出的有效部位，及以其原料药为主药进行配制的水凝胶、巴布剂、涂膜剂等透皮吸收制剂，及其控释或缓释剂型或纳米制剂；并且，本发明人首次将上述制剂应用于抗血栓、抗脑梗、抗血小板聚集、延长断头小鼠呼吸时间、减少脑水肿的医药用途。

本发明所述的经透析膜制备出的多肽有效部位其原料药或其可药用盐为主药进行配制的水凝胶、巴布剂、涂膜剂等透皮吸收制剂及其控释或缓释剂型或其纳米制剂还可以与现已上市的治疗心血管疾病类病症的药物如降纤溶栓剂，抗凝药物，脑保护制剂如钙离子通道阻滞剂、镁离子、抗兴奋性氨基酸递质、自由基清除剂、抗血小板聚集药物、血管扩张剂、神经细胞保护剂等药物品种联合使用或交叉使用，例如与肝素、低分子肝素、华法林、维生素K、硫酸鱼精蛋白、降纤酶、巴曲酶、安克洛酶、去纤酶、蛇岛蝮蛇抗栓酶(SVATEI)、蝮蛇抗栓酶(SVATE)、江浙蝮蛇抗栓酶(SVATE II)、蕲蛇酶、消栓灵、精制溶栓酶、阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、水蛭素及水蛭制剂、蛇毒制剂、蚓激酶及地龙制剂、虎纹蜘蛛毒素-I（HWTX-I）、蜜蜂蜂毒(bee venom)及melittin等蜂毒肽等组合，或与醒脑静、尼莫地平、血塞通、急效救心丹、川芎嗪、波立维等药物组合，制备得到具有治疗心脑血管疾病功效的组合物或复方制剂，可预期成为治疗心脑血管疾病的药品、保健品、日化用品和医疗器械。上述各类药物组合物或者药品、保健品、日化用品和医疗器械可以采用多种制剂，包括水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、涂膜剂、软膏剂等透皮吸收剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。

至今为止，以往文献中并未发现有以本发明提供的制备工艺对侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒多肽有效部位进行纯化富集的文献报道，本发明所述之用特定孔径的透析膜制备侧狭腹胡蜂属蜂毒多肽有效部位法具有意想不到的效果。并且，迄今为止，中外文献并无针对云南采集到的侧狭腹胡蜂属蜂毒多肽有效部位进行针对缺血性脑血管疾病、缺血性心血管疾病活性研究的报道，更没有将该蜂毒多肽有效部位制成TTS（透皮吸收制剂）用于防治心脑血管疾病的报道。本发明针对性的将侧狭腹胡蜂属蜂毒多肽有效部位TTS制剂预防和治疗缺血性心脑血管疾病之全面研究尚属首次。此外，侧狭腹胡蜂属蜂毒透析膜制备出的有效部位其原料药及其透皮吸收制剂均具有显著的抗血栓、抗脑梗、抗血小板聚集、延长断头小鼠呼吸时间的功效；亦均属于意想不到的结果，因而可以预期进一步开发成为治疗缺血性心脑血管疾病类的药物或药物组合物。由此完成了本发明。

本发明的有益之处在于：首次用截留分子量（MWCO）为25千道尔顿（25KDa）的透析膜制备出侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒多肽有效部位，并首次发现了该有效部位在开发防治心脑血管类疾病的药物领域中的潜力；对于开发治疗缺血性脑血管疾病、缺血性心血管疾病包括心梗、心血管血栓、脑血栓、脑梗、急/慢性脑卒中，及由脑梗塞损伤带来的后遗症如侧偏瘫、偏身感觉障碍、偏盲、面舌瘫、失语、全身瘫痪等的创新药物提供了新的动物药物之物质基础。本发明又一特点是：根据侧狭腹胡蜂属昆虫蜂毒多肽有效部位制成的透皮吸收制剂具有起效快、活性广泛、安全性高的优势，使得该有效部位许多TTS制剂活性优于心脑血管临床一线用药，具有相当广阔的市场前景。本发明再一特点是：该属膜翅目昆虫生长繁殖能力旺盛，在云贵高原广泛分布，便于养殖，每头蜂王每年可以孵育逾百只子代，有利于成为稳定的和可持续开发生物药物资源，同时也有利于贫困山区农民养殖此类药源性动物达到脱贫目的。具有潜在的巨大社会效益和经济效益。该药物原料来源于天然养殖的胡蜂总科昆虫，其蜂毒来源数量稳定、质量可控；蜂毒多肽有效部位制备步骤简便，绿色天然，成本低，污染小，利于大规模生产。

具体实施方案

为了更好地理解本发明的实质，下面分别以实施例和药理实施例说明使用以侧狭腹胡蜂属蜂毒经透析膜制备出的多肽有效部位为主药制成的水凝胶、巴布剂、涂膜剂等透皮吸收制剂的制备方法，及其对胶原-肾上腺素合剂诱导小鼠体内血栓形成的影响（治疗给药和预防给药）、对脑缺氧小鼠的脑保护作用（药物对断头小鼠喘息时间的影响）、抗血小板聚集作用等药理实验结果，说明该多肽有效部位的制备及其在防治心脑血管生化药物开发领域中的新用途。

若无特别说明，本发明的百分比指的是重量百分比。必须说明，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位及涂膜剂的制备

1.1黑侧狭腹胡蜂粗蜂毒的采集：

黑侧狭腹胡蜂采自云南省勐海县境内，蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为Parischnogaster nigricans Cameron（黑侧狭腹胡蜂）。采集胡蜂毒装置：使用经过本工程研究中心改装的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压11V，输出自动间歇脉动电压；采集胡蜂毒方法：将采毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，对该巢黑侧狭腹胡蜂蜂群职蜂采毒。打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引黑侧狭腹胡蜂出来攻击蜂毒采集器。采毒结束后，关闭电源，扫掉不再排毒的黑侧狭腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。合并数次收集得到的黑侧狭腹胡蜂蜂毒共计166毫克。

1.2透过透析膜进行粗毒的纯化：

按照常规透析膜截留大分子方法，使用美国光谱医学（spectrum）品牌的透析袋，即用型纤维素酯膜，截留分子量为25千道尔顿。使用前处理及操作均按照说明书进行。加8毫升蒸馏水溶解黑侧狭腹胡蜂蜂毒，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，在4℃温度环境摇床震荡透析过夜，并不断搅拌。15小时后取透出液冷冻干燥，G-10柱脱盐后，再冻干，即为下一步制剂使用之原料药。依此法得到黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位122毫克。经福林酚法检查，该有效部位中多肽含量为82.6%。

1.3黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂的制备：

制涂膜剂方法：取甘油0.25克、0.1克吐温-80和黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位溶解于5毫升蒸馏水中，微加热震荡使之溶解。然后与20毫升2%CMC-Na胶浆搅拌混匀，40℃保温，待气泡消除，便可适用于药理实施例中的动物实验。使用给小鼠时，配制成的涂膜剂终浓度为0.75毫克/30微升。

实施例2：黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位及水凝胶剂的制备

2.1黑额侧狭腹胡蜂粗毒的采集：

黑额侧狭腹胡蜂采自云南省文山河口县境内，蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心郭云胶教授鉴定为Parischnogaster nigrifrons Saussure。采集胡蜂毒装置：使用经过本工程研究中心改装的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压6V，输出自动间歇脉动电压；采集胡蜂毒方法：将未经涂装的采毒器置于蜂巢前，按照常规采毒规程，对该巢黑额侧狭腹胡蜂蜂群职蜂采毒。打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢口，吸引黑额侧狭腹胡蜂出来攻击蜂毒采集器。采毒结束后，关闭电源，扫掉不再排毒的黑额侧狭腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。合并数次收集得到的黑额侧狭腹胡蜂粗蜂毒共计144毫克。

2.2透过透析膜进行粗毒的纯化：

按照常规透析膜截留大分子方法，使用美国光谱医学（spectrum）的透析袋，即用型纤维素酯膜，截留分子量为25KDa。使用前处理及操作均按照说明书进行。加8毫升蒸馏水溶解黑额侧狭腹胡蜂粗蜂毒，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，在4℃温度环境摇床震荡透析过夜，并不断搅拌。15时后取透出液冷冻干燥，G-10柱脱盐后，再冻干，即为下一步制剂使用之原料药。得到黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位117毫克。经福林酚法检查，该有效部位中多肽含量为83.3%。

2.3黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂的制备：

制水凝胶剂方法：称取150克甘油，放入500毫升烧杯中，依次称取甘羟铝1克、EDTA各1克，先后溶解于甘油中，搅拌均匀，再加入25克NP-700，混匀，得到A液；将卡波姆5.0克溶解4个小时，加双蒸水200克，得到B液；将A、B混合得到C液。取酒石酸1.0克，加双蒸水117.5克混匀得到D液。将D液分次倒入C中，并搅拌均匀，即得到水凝胶基质。根据药理实施例需要的水凝胶剂浓度，向水凝胶剂中加入黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位，充分搅拌均匀。即可用于药理实施例中的动物实验。使用在小鼠脑部或鼻部时，配制成的水凝胶剂终浓度为0.75毫克/30微升。

实施例3：密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂的制备

3.1密侧狭腹胡蜂粗毒的采集：

密侧狭腹胡蜂采自云南省勐腊境内，蜂体标本据云南省大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心杨自忠教授鉴定为Parischnogaster mellyi Saussure。采毒基本装置使用经过本工程研究中心改装的副盖式蜂毒采集器，木框，长80公分，宽50公分；内嵌4片长20公分/宽33公分取毒玻璃；输入电压9V，输出自动间歇脉动电压；木框事先以红色油漆涂成红色；木框上预先涂抹20毫升浓度为15毫克/毫升的另外一窝密侧狭腹胡蜂的蜂巢及蜂体提取物挥发性溶液（制备方法：将100克蜂巢及80只职蜂蜂体匀浆磨碎，加入20毫升蒸馏水，以乙醚萃取2次、每次20毫升；萃取液减压蒸干溶剂后，以醋酸乙酯溶解，配制成15毫克/毫升的提取物挥发性溶液）；采集密侧狭腹胡蜂蜂毒前20分钟涂抹。将该取毒器放置于铺有大红色塑料布的地上，略微倾斜15度，形成对蜂巢蜂群的强烈刺激信号。然后打开取毒器电源开关，敲击地面及蜂巢，吸引密侧狭腹胡蜂出来攻击蜂毒采集器。采毒结束后，关闭电源，扫掉不再排毒的密侧狭腹胡蜂，收集玻璃板上的蜂毒，装入特制冷冻瓶中，梅特勒十万分之一电子天平称重。合并数次收集得到的密侧狭腹胡蜂粗蜂毒186毫克。

3.2透过透析膜进行粗毒的纯化：

按照常规透析膜截留大分子方法，使用美国光谱医学（spectrum）的透析袋，即用型纤维素酯膜，截留分子量（mwco）25000道尔顿。使用前处理及操作均按照说明书进行。加9毫升蒸馏水溶解密侧狭腹胡蜂蜂毒，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，在4℃温度环境摇床震荡透析过夜，并不断搅拌。16小时后取透出液冷冻干燥，G-10柱脱盐后，再冻干，即为下一步制剂使用之原料药。得到密侧狭腹胡蜂有效部位134毫克。经福林酚法检查，该有效部位中多肽含量为79.7%。

3.3密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂的制备：

制巴布剂方法：将卡波姆5克溶解4个小时，加双蒸水200克，得到A液；称取150克甘油，放入500毫升烧杯中，依次称取甘羟铝、EDTA各1克，先后溶解于甘油中，搅拌均匀，再加入25克NP-700，混匀，得到B液；将A、B混合得到C液。取酒石酸1克，加双蒸水117.5克混均匀得到D液。将D液分次倒入C中，并搅拌均匀，即得到基质E。向合适量的基质中加入3.2中制备出的密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位至药理实施例需要量，充分搅拌均匀。制成药理实验所需要的单位面积要求的终浓度（小鼠实验时保证1.0厘米×1.0厘米的巴布剂含量为0.75毫克）于大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心GMP中试车间用巴布剂机器涂布成5厘米×7厘米的巴布剂。使用时剪成1.0厘米×1.0厘米大小块状贴于小鼠脑部或鼻部，并用胶布固定好。

药理实施例1：黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂对胶原-肾上腺素合剂诱导小鼠体内血栓形成的保护作用（预防给药）

1.1实验目的：

通过观察药物对胶原蛋白-肾上腺素诱导的小鼠血栓的保护作用，初步评价其抗血栓作用。小鼠静注胶原-肾上腺素合剂混合诱导剂后，由于采用匀浆技术处理胶原蛋白诱导剂，使胶原蛋白易通过肺循环，经血流至脑血管形成血栓，动物会迅速出现半侧肢体偏瘫的症状，死亡一般发生在5分钟内，静注药液后，分别记录小鼠偏瘫形成的时间、小鼠存活的时间以及偏瘫未恢复数，超过15分钟的小鼠及死亡小鼠均以15分钟计算。

1.2实验材料：

1.2.1实验动物：雄性昆明种小鼠，体重：18～22克。

1.2.2实验器材：一次性注射器(规格：1毫升)、100微升移液枪、灌胃针每次用之前沸水煮沸消毒）、秒表、5毫升匀浆器等。

1.2.3主要试剂：

1.2.3.1阳性药：

阿司匹林（肠溶片，拜耳医药保健有限公司，批号：BJ10402）；

氯吡咯雷，别名波立维（赛诺菲，批号：2A627）；

川芎嗪（针剂，哈尔滨三联药业有限公司，批号：121101A3）；

胶原蛋白（专业生化试剂供应商）。

1.2.3.2黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位：由大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心提供（制备方法见实施例1）。

1.2.4主要试剂的配置：胶原蛋白-肾上腺素合剂的配制，参考文献（[1]朱虹，吴强，徐明，吴樱樱，胡秀萍，邹宇宏，杨雁，黄芪总提物体内外抗血栓作用的实验研究[J]，中国临床药理学与治疗学，2005，08:17-920；[2]汪艳秋，刘宪丽，刘东颖，吴荣杰，邹向阳，侯林，刺松藻多糖抗凝血及抗血栓作用的研究[J]，安徽医药，2011，07:804-806）中的方法完成。临用时称取胶原蛋白45毫克，浸泡于3～4毫升生理盐水中2小时以上，匀浆，2000转/分钟离心10分钟，取上清液；另取1克/升的肾上腺素1.8毫升，加入上清液中，加生理盐水至40毫升即成，即制得1.125毫克/毫升胶原蛋白和0.045毫克/毫升肾上腺素溶液。用生理盐水稀释倍数比例为1.5﹕1，即诱导剂为0.67毫克/毫升的胶原蛋0.027毫克/毫升肾上腺素溶液。经过稀释后的给药剂量为胶原蛋白268微克/只和肾上腺素10微克，亦即尾静脉注射0.4毫升/只。

1.2.5阳性药的配制：根据人与动物之间的剂量换算，计算出阳性药物的小鼠给药剂量，并于实验前一天将灌胃给药者用生理盐水配制好，4℃保存。

1.2.6黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂的配制：涂膜剂制备方法参见实施例1中的1.3部分。小鼠给药量为0.75毫克/20克，每次30微升，则涂膜剂需要配制的浓度为0.75毫克/30微升。

1.2.7阳性药涂膜剂的配制：按照本药理实施例1.2.6所述之相同工艺，配制阳性药物阿司匹林涂膜剂、波立维涂膜剂、川芎嗪涂膜剂。其中，阿司匹林涂膜剂配制浓度为1.6毫克/30微升；波立维涂膜剂配制浓度为0.16毫克/30微升；川芎嗪涂膜剂配制浓度为1.1毫克/30微升。

1.3实验分组：

60只小鼠（雄性昆明种）随机分为10组，每组6只。

1.3.1一般给药途径阳性药组（3组）（阿司匹林灌胃给药组、波立维灌胃给药组、川芎嗪静脉注射给药组）；

1.3.2三种阳性药涂膜剂组（3组）（阿司匹林涂膜剂组、波立维涂膜剂组、川芎嗪涂膜剂组）；

1.3.3阴性对照组（2组）（基质组，即涂抹未加任何药物的涂膜剂空白基质；生理盐水组）；

1.3.4给药组：黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂组（2组）（脑部仿太阳穴涂膜给药组、鼻部涂膜给药组）。

1.4实验方法：

基质组、鼻部涂膜组、脑部仿太阳穴给药组定量按照30微升/只涂抹，灌胃和静脉注射，按0.2毫升/10克，根据以上配制好的药物给药，连续给七天，隔一天称一次体重，小鼠正常饮水、饮食。末次给药后1小时各组自尾静脉注射血小板聚集诱导剂胶原蛋白-肾上腺素混合溶液（0.4毫升/只）。观察5分钟内小鼠死亡数及15分钟内小鼠偏瘫未恢复数，

计算药物对小鼠脑血栓的保护率及小鼠偏瘫的恢复时间。

1.5实验结果：

本实施例中药物对胶原-肾上腺素合剂诱导小鼠体内血栓形成的影响实验属于预防给药，小鼠尾静脉注射诱导剂后，生理盐水、基质组均出现呼吸加快、躁动、眼球突出、发白，随后迅速死亡，死亡率为百分百；给药组、阳性药组，小鼠诱导后呼吸急促到平缓或是急促到死亡。与生理盐水组、基质组比较，黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位2个涂膜剂组均明显降低小鼠死亡率；黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位鼻部涂膜给药组和脑部仿太阳穴给药组对小鼠血栓形成有明显的保护作用。实验结果见表1。

表1各实验组对胶原-肾上腺素合剂诱导血栓小鼠死亡及恢复的作用（预防给药）

1.6实验结果说明：

小鼠静注胶原-肾上腺素合剂混合诱导剂使胶原蛋白通过肺循环，经血流至脑血管形成血栓，动物迅速出现半侧肢体偏瘫的症状，通过观察药物对胶原蛋白-肾上腺素诱导的小鼠血栓的保护作用，可初步评价其抗血栓作用。本药理实施例中，黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位鼻部涂膜给药组和仿太阳穴涂膜给药组表现出的抗小鼠脑血栓作用强于波立维涂膜剂给药组、阿司匹林涂膜剂给药组、川芎嗪涂膜剂给药组，还强于灌胃给药阿司匹林组和静脉注射川芎嗪组；其对脑血栓小鼠偏瘫恢复作用与一线用药波立维灌胃给药组相当。实验结果显示黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂具有相当强效的抗血栓生成能力，能对心脑血管血栓的形成起到极佳的保护和预防作用。

药物对小鼠静注胶原-肾上腺素合剂混合诱导剂形成血栓的保护作用实验是药理学界普遍认可的评价药物对脑血栓疾病防治作用的重要评价指标。由上述黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂实验结果可以看出，侧狭腹胡蜂属蜂毒及其相关透皮吸收制剂有望成为新的抗脑血栓疾病的药物。

药理实施例2：黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂对胶原-肾上腺素合剂诱导小鼠体内血栓形成的保护作用（治疗给药）

2.1实验目的：

通过观察对诱导剂诱导小鼠体内血栓形成后再治疗给药的实验结果，观察药物对胶原蛋白-肾上腺素诱导的小鼠血栓的保护作用，进一步评价其抗血栓作用。实验机理同药理实施例1.1部分。

2.2实验材料：

2.2.1实验动物：雄性昆明小鼠，体重：18～22克。

2.2.2实验器材：一次性注射器(规格：1毫升)、100微升移液枪、灌胃针每次用之前沸水煮沸消毒）、秒表、5毫升匀浆器等。

2.2.3主要试剂：

2.2.3.1阳性药：

阿司匹林（肠溶片，拜耳医药保健有限公司，批号：BJ10402）；

氯吡咯雷，别名波立维（赛诺菲，批号：2A627）；

川芎嗪（针剂，哈尔滨三联药业有限公司，批号：121101A3）；

胶原蛋白（专业生化试剂供应商）。

2.2.3.2黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位：由大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心提供，制备方法见实施例1。

2.2.4主要试剂的配置：胶原蛋白-肾上腺素合剂的配制，同药理实施例1。

2.2.5阳性药的配制：同药理实施例1。根据人与动物之间的剂量换算，计算出阳性药物的小鼠给药剂量，并于实验前一天将灌胃给药者用生理盐水配制好，4℃保存。

2.2.6黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂的配制：同药理实施例1。涂膜剂制备方法参见实施例1中的1.3部分。小鼠给药量为0.75毫克/20克，每次30微升，则涂膜剂需要配制的浓度为0.75毫克/30微升。

2.3实验分组：

48只小鼠（雄）随机分为8组，每组6只。

2.3.1一般给药途径阳性药组（3组）（阿司匹林灌胃给药组、波立维灌胃给药组、川芎嗪静脉注射给药组）；

2.3.2药理实验1的结果提示，三种阳性药涂膜剂（阿司匹林涂膜剂、波立维涂膜剂、川芎嗪涂膜剂）不具有显著治疗作用，因而本实施例中不再重复试验。

2.3.3模型组和2组阴性对照组（基质组，即涂抹未加任何药物的涂膜剂空白基质；生理盐水组）；

2.3.4给药组：黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位涂膜剂组（2组）（脑部仿太阳穴涂膜给药组、鼻部涂膜给药组）。

2.4实验方法：

先自小鼠尾静脉注射胶原蛋白与肾上腺素的混合诱导剂制，0.4毫升/只。注射后小鼠立即产生肢体偏瘫的脑血栓症状。注射后1分钟，立即给药，观察5分钟内小鼠死亡数及15分钟内小鼠偏瘫未恢复数。计算药物对小鼠脑血栓的保护率。为确认模型是否成功、判断涂膜剂空白基质对小鼠的毒性，对于生理盐水组和基质组的小鼠，给予尾静脉注射生理盐水0.4毫升/只，注射后1分钟分别给予生理盐水和涂膜剂空白基质。模型组诱导血栓形成即可，不予给药。

2.5实验结果：

本实施例中药物对胶原-肾上腺素合剂诱导小鼠体内血栓形成的影响属治疗给药。小鼠尾静脉注射诱导剂后很短时间内即发生偏瘫，呼吸困难、眼球突出发白，随后小鼠迅速死亡。与模型组比较，黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位鼻部涂膜给药组和脑部仿太阳穴给药组对血栓小鼠的存活率有显著的提高。实验结果见表2。

表2各实验组对胶原-肾上腺素合剂诱导血栓小鼠死亡及恢复的作用（治疗给药）

2.6实验结果说明：

药物对小鼠静注胶原-肾上腺素合剂混合诱导剂形成血栓的保护作用实验是药理学界普遍认可的评价药物对脑血栓疾病防治作用的重要评价指标。造模形成偏瘫后再试验药物对小鼠的救治实验（存活率），可以更有效地评价受试药物对于临床常见的急性脑血栓的治疗能力。由表2可以看出，黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位鼻部涂膜给药组和脑部仿太阳穴涂膜给药表现出出乎意料的小鼠脑血栓损伤保护作用。其救治小鼠急性脑血栓造成的死亡之作用强度强于一线用药波立维、阿司匹林，川芎嗪。实验结果显示黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂具有相当强效的抗血栓生成能力，能对心脑血管血栓的形成起到极佳的保护、预防和治疗作用。

由上述黑侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位及其透皮吸收制剂的实验结果再次看出，侧狭腹胡蜂属蜂毒及其相关透皮吸收制剂有望成为新的抗脑血栓疾病和防治心脑血管重大疾病的药物。

药理实施例3：黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂对脑缺氧小鼠的脑保护作用（药物对断头小鼠喘息时间的影响）

3.1实验目的：

通过观察药物对断头小鼠的呼吸延长作用，初步评价其对脑缺氧动物的脑保护功效。

3.2实验材料：

3.2.1实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重：18～22克。

3.2.2实验器材：手术器械、秒表8只等。

3.2.3主要试剂：

3.2.3.1阳性药：

阿司匹林（肠溶片，拜耳医药保健有限公司，批号：BJ10402）；

川芎嗪（针剂，哈尔滨三联药业有限公司，批号：121101A3）。

3.2.3.2黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂（由大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心提供，制备方法见实施例2）。

3.2.3.3阳性药的配制：同药理实施例1。

3.2.2.4黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂的配制：水凝胶剂制备方法参见实施例2中的2.3部分。配制成的水凝胶剂终浓度为0.75毫克/30微升。

30只小鼠（雄）随机分为6组，每组5只。

3.3.1一般给药途径阳性药组（2组）（阿司匹林灌胃给药组、川芎嗪静脉注射给药组）；

3.3.2阴性对照组（2组）（水凝胶基质组，即未加任何药物的制作水凝胶制剂的空白基质；生理盐水组）；

3.3.3给药组：黑额侧狭腹胡蜂毒多肽有效部位水凝胶剂组（2组）（脑部仿太阳穴水凝胶给药组、鼻部水凝胶给药组）。使用在小鼠脑部或鼻部时，小鼠给药量为0.75毫克/20克，每次30微升。

3.4实验方法：

末次给药1小时后，自小鼠耳后根部快速断头，记录小鼠断头后喘息的时间s（秒）和张口呼吸次数n（次）。

3.5实验结果：见表3。

表3黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂对脑缺氧小鼠的脑保护作用

注：与生理盐水组比较，**P<0.01，*P<0.05

3.6实验结果说明：

由表3可看出，与生理盐水组比较，两个阳性药物组、两组黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂组（脑部仿太阳穴水凝胶给药组、鼻部水凝胶给药组）均有统计学差异（*P<0.05，**P<0.01)，说明药物黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂能增加小鼠断头呼吸次数（脑缺氧时小鼠有一定的抵抗能力）。与基质组比较，两组黑额侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位水凝胶剂组能有效延长断头小鼠喘息时间，说明给药组小鼠有一定的耐缺氧能力。实验结果显示侧狭腹胡蜂属蜂毒多肽有效部位对于缺血缺氧性脑损伤有一定的保护作用。

药理实施例4：密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂抗血小板聚集实验

4.1实验目的

检查密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位作为抗心脑血栓药物的潜质，为下一步开发抗心脑血栓药物TTS制剂提供科学依据。

4.2实验材料

4.2.1实验动物：健康昆明种雄性小鼠，购自大理学院实验动物中心，体重18～22克。

4.2.2实验器材：秒表、微量采血毛细管（内径为1毫米，长度为10厘米）、小鼠灌胃针头、1毫升注射器、EP管、200微升微量移液器、枪头等。

4.2.3实验试剂：

4.2.3.1密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂：由大理学院药用特种昆虫开发国家地方联合工程中心自制（制备方法分别参见实施例3）；

4.2.3.2生理盐水（四川科伦药业股份有限公司，批号：N12102201-2）；

4.2.3.3阿司匹林肠溶片（拜耳医药保健有限公司，批号：BJ10402）；

4.2.3.4注射用尿激酶（天津生物化学制药有限公司，批号：20120403）；

4.2.3.5血塞通片（昆明制药集团金泰得药业股份有限公司，批号：130202）。

4.3实验方法：

4.3.1试剂配制：

4.3.1.1阳性药物等的配制：阿司匹林肠溶片（80毫克/公斤）和血塞通片（90毫克/公斤）于实验前一天用生理盐水配制，4℃保存；注射用尿激酶（100000U/公斤），实验前一天用生理盐水配成10000U/毫升，4℃保存；临用前取20微升母液用生理盐水稀释至200微升；4.3.1.2密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂的配制：于实验前一天新鲜配制，4℃保存备用。根据实施例3（3.3部分）所述方法将密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂制成药理实验所需要的单位面积要求的终浓度（每1.0厘米×1.0厘米的巴布剂含量为0.75毫克）。使用时剪成1.0厘米×1.0厘米的块状贴于小鼠脑部或鼻部透皮给药，并用胶布固定好。

4.3.2给药及测定方法：

4.3.2.1分组与给药：42只雄性小鼠随机分为7组，每组6只，分别为密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂鼻贴给药组（M1）、密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂太阳穴给药组（M2）、阿司匹林肠溶片组（阳1）、尿激酶组（阳2）、血塞通片组（阳3）、巴布剂基质对照组（对1）、溶媒对照组（对2）。小鼠隔日称重一次，并控制饮食量。M1组、M2组均给巴布剂（含药量为每1.0厘米×1.0厘米的巴布剂0.75毫克），将剪好的1.0厘米×1.0厘米的块状贴于小鼠脑部或鼻部透皮给药，并用胶布固定好。阳1组、阳3组、对2组均采取灌胃给药，按0.2毫升/10克给药。对1给1.0厘米×1.0厘米的巴布剂基质（不含药）。采取以上方法连续给药七天。第八天用毛细管法测各组动物凝血时间。

4.3.2.2毛细管法测定药物对正常小鼠体外凝血时间的影响：用毛细玻璃管于小鼠眼内眦球后静脉丛取血，自血液流入毛细管内开始计时，血液注满毛细管后平放于桌面上，每隔20秒折断一段毛细管，并缓慢向左右两侧拉开，观察折断处是否有血液凝丝，观察至有血液凝丝出现为止。以血液流入毛细玻璃管内至出现血液凝丝的间隔时间作为小鼠的凝血时间。

4.4实验结果：

从表4可以看出，用毛细管法测得的结果是：与基质对照组和溶媒对照组相比，阳性药组、密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂鼻贴给药和巴布剂太阳穴给药所测得的体外凝血时间均有统计学差异（*P<0.05，**P<0.05）；与三个阳性药物组相比，密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂鼻贴给药和巴布剂太阳穴给药所测得的体外凝血时间也显著大于阳性药物（P<0.05）。可以看出，密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂鼻贴给药和巴布剂太阳穴给药的抗凝血作用均大大强于现有一线用药；可以预期该属胡蜂蜂毒多肽有效部位开发成抗凝血、抗血栓药物及透皮吸收制剂，用于防治心脑血管缺血性疾病。

表4密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂及对照组对小鼠体外凝血时间的影响

（*P<0.05，**P<0.05；与模型组比较）（^△P<0.05；与阳性药物比较）

4.5结果说明：

病变血管结构的改变是血栓形成的前提，它激活或吸引血流中的血小板和白细胞，使之粘附、聚集在病变处，这些粘附、聚集的细胞可释放多种活性物质，进一步加重血管病变和募集更多的细胞，导致血栓形成。也就是说，内皮细胞、血小板、白细胞在血栓形成过程中，存在互为因果的相互促进作用，形成恶性循环。血小板活化聚集与血栓形成和发展密切相关，血小板活化聚集后，可致血栓形成，血管痉挛，影响血液循环，产生缺血或梗阻，从而促进心血管和脑血管疾病的发生。因此研究药物对血小板活化聚集的影响，对于防止血栓性疾病和开发防治心脑血管类疾病创新药物至关重要。

在本实验中，根据测得的结果我们发现密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位巴布剂鼻贴给药和巴布剂太阳穴给药的体外凝血时间与阳性和阴性对照组比较，均有统计学差异。据此，待测药物密侧狭腹胡蜂蜂毒多肽有效部位是有极其显著的抗血小板聚集及抗血栓形成作用的。说明侧狭腹胡蜂属蜂毒及其有效部位非常值得进一步研究开发成抗血小板凝聚、抗心血管血栓、抗脑血管血栓、防治缺血性心脑血管疾病的新型生化药物。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (6)

1.一种蜂毒多肽有效部位，其特征是：该有效部位是从膜翅目胡蜂总科侧狭腹胡蜂属昆虫的粗蜂毒经透析膜透析而得；其中透析膜的截留分子量为25KDa。

2.一种制备权利1所述的蜂毒多肽有效部位的制备方法，其特征是：溶解收集到的胡蜂粗蜂毒，倒入透析管中，扎紧上口，将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，摇床震荡透析，搅拌，12-24小时后取透出液干燥，脱盐，再干燥即得；其中透析管是指截留分子量为25KDa的透析袋，干燥是指冷冻干燥或减压浓缩干燥，胡蜂粗蜂毒是指膜翅目胡蜂总科侧狭腹胡蜂属昆虫体内的蜂毒。

3.权利要求1-2任一所述的蜂毒多肽有效部位用于制备防治心脑血管疾病药物的用途，其特征是：所述心脑血管疾病是指缺血性脑血管疾病、缺血性心血管疾病。

4.根据权利要求3的用途，其特征是所述心脑血管疾病是指心梗、心血管血栓、脑血栓、脑梗、急/慢性脑卒中、和/或脑梗塞损伤后遗症；其中脑梗塞损伤后遗症是指侧偏瘫、偏身感觉障碍、偏盲、面舌瘫、失语、全身瘫痪。

5.根据权利要求3的用途，其特征是：所述用途是通过药物制剂、医疗器械、日化用品形式得以体现；所述药物制剂、医疗器械、日化产品的形式是水凝胶、泡沫凝胶、涂膜剂、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、外用搽剂、软膏剂。

6.一种具有防治心脑血管疾病功效的药物组合物，其特征是：该药物组合物含有治疗有效量的根据权利要求1的蜂毒多肽有效部位、药用辅料、药用载体或敷料。