CN111196840A

CN111196840A - 一种大胡蜂肽wvc-ⅰ及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111196840A
Application number: CN202010027002.5A
Authority: CN
Inventors: 吴俊珠; 杜雯雯; 滕飞; 杨红; 巫秀美; 赵昱; 刘光明
Original assignee: Dali University
Current assignee: Dali University
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2020-05-26

Abstract

本发明提供一种大胡蜂肽WVC‑Ⅰ及其制备方法和应用，属于生化药物制备技术领域，本发明以大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末为原料，通过阳离子交换高效液相色谱、阴离子交换高效液相色谱以及反相高效液相色谱共三步分离获得的WVC‑Ⅰ，运用质谱鉴定纯度达到98％以上，其分子量约为1435Da。

Description

一种大胡蜂肽WVC-Ⅰ及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生化药物制备技术领域，尤其涉及一种大胡蜂肽WVC-Ⅰ及其制备方法和应用。

背景技术

生物毒素是生物活性最高、毒性最大的化学物质，对探索生命运动过程和发展新药均有重要价值。

脑血管疾病是全身性血管病变或系统性血管疾病在脑部的表现，是血管源性脑部病损的总称，中医俗称“中风”，主要分为出血性脑中风和缺血性脑中风两大类，以脑梗塞最为常见。脑中风发病急，病死率高，是世界上最重要的致死性疾病之一。目前用于治疗脑中风的药物多为化学制剂，存在毒性和副作用大的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大胡蜂肽WVC-Ⅰ及其制备方法和应用，该大胡蜂肽WVC-Ⅰ能够用于治疗脑中风。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种胡蜂肽WVC-Ⅰ，所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了上述方案所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ的制备方法，包括以下步骤：

1)将大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末和水混合溶解，离心，取上清液得到毒素溶液；

2)将步骤1)所述毒素溶液上样阳离子交换色谱柱进行第一纯化，收集0～5min出现的洗脱峰对应的洗脱液对应的洗脱液，将洗脱液冻干得到第一冻干粉，将所述第一冻干粉和双蒸水混合溶解，得到第一纯化物；

3)将步骤2)所述第一纯化物上样阴离子交换色谱柱进行第二纯化，收集5～7min出现的洗脱峰对应的洗脱液对应的洗脱液，将洗脱液冻干得到第二冻干粉，将所述第二冻干粉和双蒸水混合溶解，得到第二纯化物；

4)将步骤3)所述第二纯化物上样反向交换色谱柱进行第三纯化，收集30～40min出现的洗脱峰对应的洗脱液，得到大胡蜂肽WVC-Ⅰ。

优选的，步骤1)中所述大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末的质量和水的体积比为4～6mg:0.5～1.5mL。

优选的，步骤2)中所述第一纯化的条件包括：色谱柱为Agilent Bio WCX；柱温为25℃；检测器为W2998检测器；检测波长为280nm；流动相的流速为3mL/min；洗脱液分别为A相0.02M NaH₂PO₄，B相0.02M Na₂HPO₄，C相1MNaCl，D相ddH₂O。

优选的，步骤2)中所述Agilent Bio WCX的内径为4.6mm；所述Agilent Bio WCX的长度为250mm；所述Agilent Bio WCX的粒径为10μm。

优选的，步骤3)中所述第二纯化的条件包括：色谱柱为Bio Suite^TMDEAE；检测器为DAD检测器；检测波长为280nm；流动相的流速为0.8mL/min；洗脱液分别为A相0.02M Tris-HCl，B相0.7M NaCl。

优选的，步骤3)中所述Bio Suite^TMDEAE的内径为7.5mm；所述Bio Suite^TMDEAE的长度为75mm；所述Bio Suite^TMDEAE的粒径为10μm。

优选的，步骤4)中所述第三纯化的条件包括：色谱柱为Sepax Bio-C18；色谱柱的柱温为25℃；检测器为W2998检测器；检测波长为280nm；流动相的流速为2mL/min；洗脱液分别为A相含0.1％(v/v)TFA的水，B相含0.1％(v/v)TFA的乙腈。

优选的，步骤4)中所述Sepax Bio-C18的内径为10mm；所述Sepax Bio-C18的长度为250mm；所述Sepax Bio-C18的粒径为10μm；所述Sepax Bio-C18的孔径为

本发明还提供了上述方案所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ在制备治疗脑中风的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供一种大胡蜂肽WVC-Ⅰ，所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明的大胡蜂肽WVC-Ⅰ能够用于制备治疗脑中风的药物。本发明还提供了一种大胡蜂肽WVC-Ⅰ的制备方法，该方法以大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末为原料，通过阳离子交换高效液相色谱、阴离子交换高效液相色谱以及反相高效液相色谱共三步分离获得的WVC-Ⅰ，运用质谱鉴定纯度达到98％以上，其分子量约为1435Da。

附图说明

图1是大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末阳离子交换HPLC图谱；“*”表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间；

图2是第一纯化物阴离子交换HPLC图谱；“*”表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间；

图3是第二纯化物反向交换HPLC图谱；“*”表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

具体实施方式

本发明提供了一种胡蜂肽WVC-Ⅰ，所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；具体为：Leu Asn Ile Arg Ala Leu Ala Ala Ile Ala Arg Arg Ile Ile-NH₂；所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。

本发明首先将大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末(自制：其中大胡蜂毒腺分泌物，即含有尘土等杂质的大胡蜂蜂毒，购自胡蜂养殖农户；大胡蜂蜂毒经除杂工艺、冻干即得产品，“大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉”含有60％的多肽和蛋白质)和水混合溶解，离心，取上清液得到毒素溶液；所述大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末的质量和水的体积比优选为4～6mg:0.5～1.5mL，更优选5mg:1mL；所述水优选为双蒸水；所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为10000rpm；所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min；所述离心后，优选的还包括采用过滤器对上清液进行过滤；所述过滤器的孔径优选为0.22μm；所述毒素溶液保存的温度优选为4℃。

得到毒素溶液后，本发明将所述毒素溶液上样阳离子交换色谱柱进行第一纯化，收集0～5min出现的洗脱峰对应的洗脱液对应的洗脱液，将洗脱液冻干得到第一冻干粉，将所述第一冻干粉和双蒸水混合溶解，得到第一纯化物；所述第一纯化的条件优选的包括：色谱柱为Agilent Bio WCX；柱温为25℃；检测器为W2998检测器；检测波长为280nm；流动相的流速为3mL/min；洗脱液分别为A相0.02M NaH₂PO₄，B相0.02M Na₂HPO₄，C相1M NaCl，D相ddH₂O；所述的Agilent Bio WCX内径优选为4.6mm；所述的Agilent Bio WCX长度优选为250mm；所述的Agilent Bio WCX粒径优选为10μm。得到第一纯化物后，本发明将所述第一纯化物上样阴离子交换色谱柱进行第二纯化，收集5～7min出现的洗脱峰对应的洗脱液对应的洗脱液，将洗脱液冻干得到第二冻干粉，第二冻干粉和双蒸水混合溶解，得到第二纯化物；所述第二纯化的条件优选的包括：色谱柱为Bio Suite^TMDEAE；检测器为DAD检测器；检测波长为280nm；柱温为25℃；流动相的流速为0.8mL/min；洗脱液分别为A相0.02M Tris-HCl，B相0.7M NaCl；所述Bio Suite^TMDEAE的内径优选为7.5mm；所述Bio Suite^TMDEAE的长度优选为75mm；所述Bio Suite^TMDEAE的粒径优选为10μm。

得到第二纯化物后，本发明将所述第二纯化物上样反向交换色谱柱进行第三纯化，收集30～40min出现的洗脱峰对应的洗脱液，得到大胡蜂肽WVC-Ⅰ；所述第三纯化的条件优选的包括：色谱柱为Sepax Bio-C18；色谱柱的柱温为25℃；检测器为W2998检测器；检测波长为280nm；流动相的流速为2mL/min；洗脱液分别为A相含0.1％(v/v)TFA的水，B相含0.1％(v/v)TFA的乙腈；所述Sepax Bio-C18的内径优选为10mm；所述Sepax Bio-C18的长度优选为250mm；所述Sepax Bio-C18的粒径优选为10μm；所述Sepax Bio-C18的孔径优选为为

得到大胡蜂肽WVC-Ⅰ，本发明还包括对大胡蜂肽WVC-Ⅰ进行质谱鉴定和序列测定。本发明对所述质谱鉴定和序列测定的方法没有特殊限制，采用本领域常规设置即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 WVC-Ⅰ的分离纯化及质谱分析

1、实验材料和方法

1.1 WVC-Ⅰ的分离纯化及质谱分析

(1)大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末(自制：其中大胡蜂毒腺分泌物，即含有尘土等杂质的大胡蜂蜂毒，购自胡蜂养殖农户；大胡蜂蜂毒经除杂工艺、冻干即得产品，“大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉”含有60％的多肽和蛋白质)用双蒸水溶解配成5mg/mL的毒素溶液，10000rpm离心5min，上清用一次性过滤器(0.22μm)过滤后，置于4℃保存。

(2)大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末上样阳离子交换HPLC(Agilent Bio WCX)进行第一步分离。W2998检测器检测，检测波长为280nm，柱温为25℃。流动相为四相洗脱系统，流速为3mL/min。洗脱液分别为A相0.02MNaH₂PO₄，B相0.02M Na₂HPO₄，C相1M NaCl，D相ddH₂O。上述经阳离子交换HPLC分离后收集0～5min出现的洗脱峰对应的洗脱液冻干后溶解，得到第一纯化物。具体参见图1，其中“*”表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

(3)将第一纯化物上样阴离子交换HPLC(Bio Suite^TMDEAE，7.5×75mm，10μm)进行进一步纯化，DAD检测器检测，检测波长为280nm，柱温为25℃。流速为0.8mL/min。洗脱液分别为A相0.02M Tris-HCl，B相0.7MNaCl。上述经阴离子交换HPLC分离后收集5～7min出现的洗脱峰对应的洗脱液冻干后溶解，得到第二纯化物。具体参见图2，其中“*”表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

(4)将第二纯化物上样反相HPLC进行进一步纯化。采用反相柱(Sepax Bio-C18，10.0×250mm，10μm，

)于分析型Waters 2535高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，W2998检测器检测，检测波长为280nm，流动相为含0.1％(v/v)TFA+水(A)和0.1％(v/v)TFA+乙腈(B)，洗脱速度为2mL/min，柱温为25℃。收集30～40min出现的洗脱峰对应的洗脱液，冻干后溶解，得到WVC-Ⅰ。具体参见图3，其中“*”表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

(5)利用5800MALDI-TOF/TOF质谱测定分子量。线性阳离子模式；N₂光源337nm；离子加速电压为20000V。基质为α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CHCA)，通过以下方式制备样品：取1μL蛋白样品点至样品靶上，自然干燥后，再取0.6μL CHCA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，并采用内标法校正。

(6)WVC-Ⅰ的氨基酸序列测定

WVC-Ⅰ氨基酸序列测定采用N-端Edman降解法在PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪上完成。测14个循环，采用仪器配备的标准程序测序，在线HPLC检测，准确读出WVC-Ⅰ的氨基酸序列。

2、实验结果与分析

2.1 WVC-Ⅰ的分离纯化

由于大胡蜂成分非常复杂，通常采用二维色谱的方法分离纯化毒素多肽：即首先经过阳离子交换分离粗毒后，洗脱成分进一步经过阴离子交换分离，再进一步采用反相HPLC分离纯化。二维色谱是一种非常有效的分离纯化的方法，通过阳离子交换HPLC、阴离子交换HPLC以及反相HPLC分离，我们从大胡蜂粗毒中成功分离到WVC-Ⅰ。图1是大胡蜂粗毒的阳离子交换HPLC图谱，在280nm波长下检测，可观察到非常明显的洗脱峰，其中第1个峰是目的峰。收集此峰后，进行脱盐处理所得图谱见图2。收集目的峰并冷冻干燥。图中显示含WVC-Ⅰ的洗脱峰为单一峰，通过质谱鉴定它们的纯度达到98％以上。

2.2 质谱分析

将图3所示洗脱峰用MALDI-TOF质谱分析表明所含组分单一。经鉴定WVC-Ⅰ的分子量分别为1435Da，样品纯度达到98％以上，说明目的肽的分离纯化是很成功的。

2.3 氨基酸序列分析

WVC-Ⅰ的序列测定在PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪上进行。测序之前对WVC-Ⅰ进行碘乙酰胺烷基化修饰，结果表明，WVC-Ⅰ是单链多肽分子，由12个氨基酸残基组成，WVC-Ⅰ是新发现的一个序列独特的胡蜂毒素分子。

实施例2 对实施例1得到的WVC-Ⅰ制成涂膜剂

1.仪器和试剂

仪器：恒温水浴锅，烧杯(规格25mL、50mL、100mL)，量筒，秒表，量杯(规格：5mL、10mL)，玻璃板，玻璃棒。

试剂：聚乙烯醇PVA-124，厂家：广州淇盛化工有限公司；甘油；95％乙醇。

原料药：实施例1制备得到的WVC-Ⅰ。

2.制备方法

2.1取PVA-124，1g加水12mL、2g加水24mL、3g加水36mL，浸泡24h，然后在85℃的水浴锅加热10-20min，直到PVA-124完全溶解，冷却，得到A液，备用。

2.2另取一50mL的烧杯，加入甘油2.4g，用量筒量取95％的乙醇9.6mL(含醇量为25％)加入，充分搅拌，得到B液。

2.3使用前，把水相的A液加入油相的B液中，搅拌均匀，即得涂膜剂基质。

2.4给药前，根据相应剂量，将足量的WVC-Ⅰ加入涂膜剂基质、混匀，即得WVC-Ⅰ涂膜剂。

实施例3 实施例2制备得到的WVC-Ⅰ涂膜剂对心肌的保护作用

1.实验动物、药物及试剂

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22g，SPF级，购于湖南莱斯克景达实验动物有限公司，动物合格证号：SCXX(湘)K2016-0002。

磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffer solution，PBS)，Solarbio，批号：531J021；

多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)，天津市复精细化工研究所，批号：21061011；

生理盐水，贵州天地药业有限责任公司，批号：G18011701；

索莱宝薇婷脱毛膏，利洁时家化(中国)有限公司，批号：J20160017；

受试药物：(1)阳性药，复方丹参滴丸，天津天士力制药股份有限公司，批号：140609；(2)根据实施例2制备得到的涂膜剂基质，以及按给药剂量配制的不同载药量的WVC-Ⅰ涂膜剂；

异丙肾上腺素(isoproterenol)，上海禾丰制药有限公司，批号：41141201；

天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20170626；

肌酸激酶(Creatine kinase,CK)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20170626；

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20170626

2.实验分组及给药

采用异丙肾上腺素(ISO)致心肌缺血造模方法，将体重为18-22g的36只雌雄各半小鼠随机分成6组(每组6只)：正常组组(灌胃生理盐水10mL)、涂膜剂基质组(30μL/只)、阳性药丹参滴丸组(灌胃500mg/kg)和WVC-Ⅰ涂膜剂低、中、高剂量(低：0.5mg/kg；中：1.0mg/kg；高：2.0mg/kg，按30μL/只用量制备成不同载药量的涂膜剂)受试药物组。连续给药6d，给药第5日起，除正常组外，其余各组给药30min后腹腔注射ISO 40mg/kg。所有实验小鼠于实验前1d使用人用脱毛膏将心俞穴穴位处脱毛。涂膜剂基质组、WVC-Ⅰ各剂量组分别于小鼠脱毛处均匀地涂抹涂膜剂基质或相应剂量的WVC-Ⅰ涂膜剂至脱毛的心俞穴处。

3.心脏细胞相关因子AST、LDH和CK的检测

末次给药2h后，将小鼠断头处死立即取出心脏，使用冷生理盐水将心脏上附着血液冲洗干净，按体质量1:9加入生理盐水，冰浴条件下匀浆，以3000g离心力离心15min，取出匀浆液将其浓度稀释至1％。根据试剂盒的使用说明检测小鼠心脏细胞中相关因子谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)的表达。

4.结果

与正常组相比，涂膜剂基质组的AST、LDH均显著升高，而CK的表达结果则呈现显著性降低，差异均具有统计学意义(P<0.01)；与涂膜剂基质组相比，丹参滴丸阳性药组以及WVC-Ⅰ涂膜剂高、中剂量组均可显著降低AST和LDH的表达(P<0.01)，丹参滴丸阳性药组以及WVC-Ⅰ涂膜剂受试药物各剂量组均可不同程度地升高CK的含量(如表1所示)。

表1 WVC-Ⅰ涂膜剂对心肌缺血小鼠AST、LDH、CK表达的影响(

n＝6)

组别	剂量	AST(U/L)	LDH(U/L)	CK(U/L)
					正常组(N/S)	10mL	9.83±0.81	434.62±13.74	0.98±0.07
涂膜剂基质	30μL	19.56±1.67<sup>**</sup>	534.03±18.79<sup>**</sup>	0.60±0.14<sup>**</sup>
					丹参滴丸	500(mg/kg)	13.76±1.45<sup>**▲▲</sup>	334.07±20.54<sup>**▲▲</sup>	1.42±0.14<sup>**▲▲</sup>
WVC-Ⅰ涂膜剂高剂量	2.0(mg/kg)	14.98±1.28<sup>**▲▲</sup>	347.83±20.65<sup>**▲▲</sup>	1.00±0.22<sup>▲▲</sup>
					WVC-Ⅰ涂膜剂中剂量	1.0(mg/kg)	15.13±1.73<sup>**▲▲</sup>	373.45±29.62<sup>**▲▲</sup>	1.27±0.16<sup>**▲▲</sup>
WVC-Ⅰ涂膜剂低剂量	0.5(mg/kg)	20.19±2.14<sup>**</sup>	528.12±25.74<sup>**</sup>	0.85±0.25<sup>▲</sup>

注：与正常组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与涂膜剂基质组比较，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01。

心肌缺血是指包括心肌梗死、心源性猝死、不稳定型心绞痛和稳定型心绞痛在内的有关心血管疾病的总称，其主要病因是各种因素引起冠状动脉血液灌注量减少，致使心肌供能减少，能量代谢发生紊乱，导致下游AST、LDH、CK等各因子代谢发生紊乱引起心肌损伤，并最终导致心功能障碍；而心肌细胞内AST、LDH、CK等的分泌表达，便反映了心肌的损伤程度。

异丙肾上腺素在体内可进行自身氧化从而导致机体内自由基的大量生成，机体内生成的大量自由基将进一步聚集，最终引起心肌缺血、缺氧。异丙肾上腺素诱发实验动物心肌缺血的症状与临床非常相近，因此是研究中常用的一种动物实验模型。

本实验结果表明，WVC-Ⅰ涂膜剂可显著降低ASD和LDH的表达，各剂量组均可不同程度地升高CK的含量；提示WVC-Ⅰ涂膜剂具有维持心肌膜系统完整性的功能，能有效阻止心肌细胞膜的破坏，从而发挥其对心脏组织的保护作用。据此可知，WVC-Ⅰ具有进一步开发成为防治急性心肌缺血的药物的潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 大理大学

<120> 一种大胡蜂肽WVC-Ⅰ及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Asn Ile Arg Ala Leu Ala Ala Ile Ala Arg Arg Ile Ile

1 5 10

Claims

1.一种大胡蜂肽WVC-Ⅰ，所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ的制备方法，包括以下步骤：

1)将大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末和水混合溶解，离心，取上清液得到毒素溶液；所述毒腺分泌物的冻干粉末由去除杂质的大胡蜂受刺激后分泌的毒液精制而成，其中含有60％的多肽和蛋白质；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述大胡蜂毒腺分泌物的冻干粉末的质量和水的体积比为4～6mg:0.5～1.5mL。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述第一纯化的条件包括：色谱柱为Agilent Bio WCX；检测器为W2998检测器；检测波长为280nm；柱温为25℃；流动相的流速为3mL/min；洗脱液分别为A相0.02M NaH₂PO₄，B相0.02M Na₂HPO₄，C相1M NaCl，D相ddH₂O。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述Agilent Bio WCX的内径为4.6mm；所述Agilent Bio WCX的长度为250mm；所述Agilent Bio WCX的粒径为10μm。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述第二纯化的条件包括：色谱柱为Bio Suite^TMDEAE；检测器为DAD检测器；检测波长为280nm；柱温为25℃；流动相的流速为0.8mL/min；洗脱液分别为A相0.02M Tris-HCl，B相0.7M NaCl。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述Bio Suite^TMDEAE的内径为7.5mm；所述Bio Suite^TMDEAE的长度为75mm；所述Bio Suite^TMDEAE的粒径为10μm。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述第三纯化的条件包括：色谱柱为Sepax Bio-C18；色谱柱的柱温为25℃；检测器为W2998检测器；检测波长为280nm；流动相的流速为2mL/min；洗脱液分别为A相含体积含量为0.1％的TFA的水，B相含体积含量为0.1％的TFA的乙腈。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述Sepax Bio-C18的内径为10mm；所述Sepax Bio-C18的长度为250mm；所述Sepax Bio-C18的粒径为10μm；所述SepaxBio-C18的孔径为

10.权利要求1所述大胡蜂肽WVC-Ⅰ在制备治疗心肌缺血的药物中的应用。