CN1683399A - 胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。胡蜂抗菌肽是从中国节肢类动物胡蜂毒液中分离得到的一种单链多肽，分子量1316.6道尔顿，等电点8.59，多肽全序列为：NH2－IDWKGIAAMAKI－COOH。其制备方法是：电刺激胡蜂收集的蜂毒离心去除沉淀，冷冻干燥后经凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱后分离纯化后得到。胡蜂抗菌肽具有对细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞生长强烈活性抑制作用，并且还具有无溶血活性、血浆凝固活性等优点，可作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物的应用。
Description
技术领域：
本发明涉及一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
自从青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策，并由此发展了大量的β-内酰胺类抗生素，对保护人类健康作出了巨大贡献。但随着上述“传统抗生素”的广泛使用，不断产生出诸多新问题。如长期使用导致抗药菌株的产生。有时甚至发展到某些病原菌感染已没有药物用于临床治疗。于是新一代抗菌剂的研制成为当务之急。近期的研究发现，多肽抗生素具有广谱的抗菌活性，同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性：不会诱导抗药菌株的产生，有希望成为新一代抗菌剂。
蜂产品广泛用于医药历史悠久，扎根民间和传统医学之中。其主要有：蜂蜜、蜂蜡、蜂花粉、蜂毒、蜂胶、蜂王浆、蜂王幼虫、雄蜂蛹、蜂王台、蜂巢等。其中蜂毒应用最为广泛，其成分有多肽、酶类、生物胺、碳水化合物和其他物质组成。已被报道药理作用有：亲神经特性、抗细菌活性、细胞毒性及对内分泌、心血管系统、抗辐射、机体的免疫功能等方面都有显著作用。
20世纪30年代初，德国等从活蜂中取出蜂毒制成针剂、软膏等剂型作临床应用，50年代蜂毒疗法在前苏联的许多医院得到广泛应用，对治疗高血压、风湿、类风湿性关节炎、畸形脊椎炎、外周神经炎、肌肉炎、神经痛、偏头痛、外周血管粥样硬化等均取得明显的疗效。北美的查利斯·麦拉兹采集纯蜂毒制成的蜂毒针剂治疗多发性硬化症，疗效显著。但蜂毒混合物直接用于治疗时有不少的副作用和不良反应，如：极少数患者出现过敏，少数患者出现蛋白尿、肾脏损伤等不良反应。大胡蜂(Vespa magnifica Smith)是胡蜂科胡蜂属成员，主要分布于我国四川、云南、西藏和台湾，是我国的特色资源动物之一，且已被人工饲养，另外，经研究发现其毒液的抗菌成分不具有溶血活性和细胞毒性等缺点。
发明人将本发明的胡蜂抗菌肽全序列结构经蛋白数据库进行搜索比较未发现有任何相同的多肽。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阴、阳性细菌，真菌，病毒)、抗肿瘤活性的胡蜂抗菌肽及其制备方法和在制药中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：
胡蜂抗菌肽为我们首次从中国节肢类动物胡蜂毒液中分离得到的一种单链多肽，分子量1316.6道尔顿，等电点8.59，多肽全序列为：异亮氨酸-天冬氨酸-色氨酸-赖氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸(NH2-IDWKGIAAMAKI-COOH)。
胡蜂抗菌肽的制备方法：本方法包括电刺激胡蜂收集的蜂毒离心去除沉淀，冷冻干燥后经凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱分离纯化；其中：
凝胶过滤柱层析为：将收集的胡蜂毒液冻干粉溶于纯净水后上样于SephadexG-50凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长1000mm，直径26mm，用0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH6.0缓冲液洗脱，收集第III峰；
离子交换柱层析为：凝胶过滤柱层析得到的活性成分峰III上样于0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH 6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25阳离子交换柱，交换柱长300mm，直径26mm，用含Nacl的0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0缓冲液梯度洗脱，收集第V峰；
反相高压液相色谱为：离子交换柱层析得到的活性成分峰V上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水平衡的C18反相柱，柱长300mm、直径5mm，用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液从15％至65％的梯度洗脱，收集时间为45.4min处的峰。
本发明采用飞行时间质谱法测定分子量，等电聚焦测定等电点，自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
胡蜂抗菌肽作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物的应用。
下面用本发明的胡蜂抗菌肽的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果：
1.胡蜂抗菌肽抑制细菌生长的作用
抗菌活性检测采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热溶化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底均匀摊布，凝固后另取培养基适量加热溶化，分别向每皿中加入5ml菌悬液，摇匀使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h后测量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作为最小抑菌浓度(minimalinhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此实验做四个平行，取几何平均值，结果如表1。
表1.胡蜂抗菌肽抑制细菌生长的作用
| 菌株 | 最小抑菌浓度(ug/ml) | |
| 胡蜂毒液 | 胡蜂抗菌肽 | |
| 大肠杆菌ATCC25922(Escherichia coli ATCC25922)金黄色葡萄球菌ATCC2592(Staphylococcus auneus ATCC2592)绿脓杆菌CMCCB10104(Pseudomonas aeruginosa CMCCB10104)肺炎球菌(Klebsiella pneumoniae)巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)枯草杆菌(Bacillus subtilis) | 7018013512315060 | 3.521.519.59.715.66.5 |
由表1可见，胡蜂毒液与胡蜂抗菌肽的纯品均具有显著的抑制细菌生长作用。
2.胡蜂抗菌肽抑制真菌生长的作用
抗真菌活性检测采用杯碟法，培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基。分别注入加热溶化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底均匀摊布，凝固后另取培养基适量加热溶化，分别向每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离放入已消毒的不锈钢杯5个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h-48h后测量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于云南大学微生物研究所，此实验做三个平行，取几何平均值，结果如表2。
表2.胡蜂抗菌肽抑制真菌生长的作用
| 菌株 | 最小抑菌浓度(ug/ml) | |
| 胡蜂毒液 | 胡蜂抗菌肽 | |
| 白色念珠菌ATCC2002(Candia albicans ATCC2002)黄曲霉IFFI4015(Aspergillus flavus sp ATCC2592) | 15075 | 19.56.5 |
| 青霉IFFI2002(Penicillium sp CMCCB10104)微小毛霉(Mucor pusillus)啤酒酵母(Sacharomyces cervisiae) | 2008270 | 21.611.610.5 |
由表2可见，胡蜂毒液与胡蜂抗菌肽的纯品均具有显著的抑制真菌生长作用。
3.胡蜂抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的作用
在96孔平底细胞培养板上将待测样品用完全培养基进行5倍或2倍倍比稀释，共6个滴度，每个稀释度3个重复，每孔100ul，同时设正常细胞对照。每孔滴加3×105/ml的HeP3B细胞或Molt-4细胞100ul，置37℃，5％CO2培养箱内培养。48h后用MTT法测定样品对细胞的毒性作用。EC50是对50％细胞产生细胞毒作用时的药物浓度。结果见表3。
目前临床上所运用的大部分抗生素药物不具有抑制肿瘤作用，从表3可见，胡蜂毒液与胡蜂抗菌肽均具有体外显著的抑制肿瘤细胞生长的作用。
表3.胡蜂抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的作用
| 菌株 | EC50(ug/ml) | |
| HeP3B | Molt-4 | |
| 胡蜂毒液胡蜂抗菌肽(批号1)胡蜂抗菌肽(批号2)胡蜂抗菌肽(批号3) | 38.43.52.63.1 | 55.222.319.420.5 |
4.胡蜂抗菌肽抑制HIV-1繁殖的作用
将细胞瓶中的JC53-BL细胞以每孔20000个的浓度接入到无菌96孔板，在sDMEM培养基中37℃，5％CO2条件下培养18h，接入最终浓度为0.1、1.25、2.5、5、10、20ug/ml的阳品，同样条件培养3 h后分别接入用含40ug EAE-dextran的sDMEM稀释的HIV-1 LAI株和BAL株(MOI：0.009-0.65)并使每孔最终为200ul，置37℃，5％CO2培养箱内培养48h后用X-Gal染色数兰斑计算抑制百分率和50％的抑制浓度IC50，实验设空白对照，阳性对照剂及加肽而不接毒的对照，做四次重复求几何平均。
表4.胡蜂抗菌肽抑制HIV-1繁殖的作用
| 菌株 | IC50(ug/ml) | |
| LAI株 | BAL株 | |
| 胡蜂毒液胡蜂抗菌肽 | 18.87.6 | 34.513.5 |
由表4可见，胡蜂毒液与胡蜂抗菌肽的纯品均具有显著的抑制HIV-1繁殖作用。
胡蜂毒液和胡蜂抗菌肽均具有显著的抑制细菌、真菌和病毒生长的作用，所有微生物菌/毒株包括：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎球菌、巨大芽孢杆菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黄曲霉、青霉、微小毛霉、啤酒酵母、HIV-1的LAI株和BAL株等，结果表明胡蜂抗菌肽具有广谱抗微生物活性(包括革兰氏阴、阳性细菌，真菌和病毒，MIC和IC50分别在3.5-25ug/ml与7ug/ml-15ug/ml的范围内)。同时胡蜂抗菌肽具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，胡蜂抗菌肽对HeP3B细胞和Molt-4细胞的抑制率的EC50值分别为3.1ug/m，20.7ug/ml，与文献报道的同时具有肿瘤细胞抑制活性的其他来源抗菌肽相比，胡蜂抗菌肽的肿瘤细胞抑制活性高10-15倍。因此，本发明的胡蜂抗菌肽是一种首次从中国特色药用生物资源中研制的具有抗微生物，肿瘤活性的多肽。
附图说明：
图1为本发明胡蜂抗菌肽的Sephadex G-50凝胶过滤柱层析图。
图2为本发明胡蜂抗菌肽的CM Sephadex C-25阳离子交换柱层析图。
图3为本发明胡蜂抗菌肽反相高压液相色谱图。
图4为本发明胡蜂抗菌肽的飞行时间质谱图。
具体实施方式：
下面结合附图用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
1、制备胡蜂抗菌肽
电刺激胡蜂收集的蜂毒离心(10000rpm，10min)去除沉淀，冷冻干燥后低温保存。
第一步，Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，按上述方法获得的原材料胡蜂毒冻干粉300mg溶解于5ml纯净水，10000rpm 4℃离心10min去除沉淀。SephadexG-50凝胶过滤柱(长1000mm，直径26mm)用0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0缓冲液平衡，充分后将样品上于该柱。用同样缓冲液洗脱，收集第III峰。
第二步，离子交换柱层析：凝胶过滤柱层析得到的活性成分峰III上样于0.1MNa2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0缓冲液充分平衡的CM Sephadex C-25阳离子交换柱，交换柱长300mm，直径26mm，经两个半个柱体积同样缓冲液洗至穿透峰被完全洗脱，用含Nacl的0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH 6.0缓冲液梯度洗脱，收集第V峰；
第三步，反相高压液相色谱为：离子交换柱层析得到的活性成分峰V上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水充分平衡的C18反相柱(长300mm，直径5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液从15％至65％的梯度洗脱。收集时间为45.4min处的峰(图中第二大洗脱样品峰)。
2.纯化的胡蜂抗菌肽分子量测定采用飞行时间质谱(Flight of time massspectrometry，TOF-MS)，等电点采用等电聚焦测定，用自动氨基酸序列测定仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的胡蜂抗菌肽是我们首次从中国节肢类动物胡蜂毒液中分离得到的一种单链多肽，分子量1316.6道尔顿，等电点8.59，多肽全序列为：异亮氨酸-天冬氨酸-色氨酸-赖氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸(NH2-IDWKGIAAMAKI-COOH)。
实验结果表明，胡蜂抗菌肽具有对细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞生长强烈活性抑制作用，并且还具有无溶血活性、血浆凝固活性等优点，可作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物的应用。
Claims (3)
1.一种胡蜂抗菌肽，其特征在于该抗菌肽是从胡蜂中分离得到的一种单链多肽，分子量1316.6道尔顿，等电点8.59，多肽全序列为：异亮氨酸-天冬氨酸-色氨酸-赖氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸。
2.权利要求1所说胡蜂抗菌肽的制备方法，其特征在于方法包括电刺激胡蜂收集的蜂毒离心去除沉淀，冷冻干燥后经凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱分离纯化；其中：
2.1凝胶过滤柱层析为：将收集的胡蜂毒液冻干粉溶于纯净水后上样于Sephadex G-50凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长1000mm，直径26mm，用0.1MNa2HPO4-NaH2PO4 pH6.0缓冲液洗脱，收集第III峰；
2.2离子交换柱层析为：凝胶过滤柱层析得到的活性成分峰III上样于0.1MNa2HPO4-NaH2PO4 pH6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25阳离子交换柱，交换柱长300mm，直径26mm，用含Nacl的0.1M Na2HPO4-NaH2PO4 pH6.0缓冲液梯度洗脱，收集第V峰；
2.3反相高压液相色谱为：离子交换柱层析得到的活性成分峰V上样于经含1‰三氟乙酸的超纯水平衡的C18反相柱，柱长300mm、直径5mm，用含1‰三氟乙酸的乙晴缓冲液从15％至65％的梯度洗脱，收集时间为45.4min处的峰。
3.权利要求1所说的胡蜂抗菌肽，作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物的应用。
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