CN100547000C - 一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用。该抗菌肽是一种单链多肽，其分子量为1387.7道尔顿，等电点为10，该单链多肽的序列为：异亮氨酸-色氨酸-色氨酸-赖氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸。其制备方法是将电刺激胡蜂收集得到的蜂毒液依次经过凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化后得到。该胡蜂抗菌肽可用于制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用，属于生物医学领域。
背景技术
自从青霉素被发现后，人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策，并由此发展了大量的β-内酰胺类抗生素，对人类健康作出了巨大贡献。但随着上述“传统抗生素”的广泛使用，产生了诸多新问题，如长期使用导致抗药菌株的产生，甚至是某些病原菌感染已没有相应的药物进行治疗。于是新一代抗菌剂的研制成为当务之急。近期的研究发现，多肽抗生素不仅具有广谱的抗菌活性，且不会诱导抗药菌株的产生，具有“传统抗生素”无法比拟的优越性，有希望成为新一代抗菌素。
蜂产品扎根于中国的民间医学和传统医学，在医药方面应用历史悠久。蜂产品中以蜂毒的应用最为广泛，蜂毒一般由多肽、酶类、生物胺、碳水化合物和其他物质组成，它具有广泛的药理作用，例如已报道的药理作用有：亲神经特性、抗细菌活性和细胞毒性，它还可以抗辐射，并且对增强内分泌系统功能、心血管系统功能和机体的免疫功能等方面有显著效果。
20世纪30年代初，德国等从活蜂中提取出蜂毒并制成针剂和软膏等剂型应用于临床，50年代蜂毒疗法在前苏联的许多医院得到应用。在临床应用中发现蜂毒对治疗高血压、风湿、类风湿性关节炎、畸形脊椎炎、外周神经炎、肌肉炎、神经痛、偏头痛、外周血管粥样硬化等均有明显疗效。北美的查利斯·麦拉兹采集纯蜂毒制成的蜂毒针剂治疗多发性硬化症，疗效显著。但蜂毒混合物直接用于治疗时也伴随着不少的副作用和不良反应，如极少数患者出现过敏，少数患者出现蛋白尿、肾脏损伤等不良反应。
大胡蜂(Vespa magnifica Smith)是胡蜂科胡蜂属成员，主要分布于我国四川、云南、西藏和台湾，是我国的特色资源动物之一，已被人工饲养。另外，经研究发现胡蜂毒液的抗菌成分无溶血活性和细胞毒性等缺点。
本发明的胡蜂抗菌肽的全序列在NCBI蛋白质数据库进行搜索比较，未发现有相同的多肽。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有广谱抗微生物和抗肿瘤活性的胡蜂抗菌肽及其制备方法和应用。
本发明一方面包括了一种胡蜂抗菌肽，其特征在于该抗菌肽是一种单链多肽，其分子量为1387.7道尔顿，等电点为10，该单链多肽的序列为：异亮氨酸-色氨酸-色氨酸-赖氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸。
本发明又一方面包括了一种制备本发明所述的胡蜂抗菌肽的方法，其包含以下步骤：
(1)将电刺激胡蜂收集得到的蜂毒液进行离心，收集上清液，将上清液进行冷冻干燥，得到的冻干粉溶解在去离子水中后得到样品溶液；
(2)将步骤(1)得到的样品溶液依次经过凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到该胡蜂抗菌肽。
上述的步骤中，步骤(1)采用6伏特的电压刺激胡蜂得到蜂毒液。
步骤(2)中所述的凝胶过滤柱层析是指：将得到的样品溶液通过交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱后，再用洗脱液来洗脱该过滤柱，收集第3个洗脱峰部分的溶液，所述的交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱的柱长为1000毫米，直径为26毫米，所述的洗脱液是PH值为6的0.1摩尔/升的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
步骤(2)中所述的离子交换柱层析是指：将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱峰部分的溶液通过羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该阳离子交换柱，收集第5个洗脱峰部分的溶液，所述的羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱的柱长为300毫米，直径为26毫米，该操作中使用的洗脱液是含1摩尔/升氯化钠的PH值为6的0.1摩尔/升的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
步骤(2)中所述的反相高压液相色谱是指：将离子交换柱层析收集到的第5个洗脱峰部分的溶液通过C18反相柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该C18反相柱，洗脱液梯度范围在15％-65％，洗脱速度为0.7毫升/分钟，总洗脱时间为70分钟，收集洗脱时间在20.5分钟-21.3分钟之间流出的溶液，所述的C18反相柱的柱长为300毫米，直径为5毫米，该操作中使用的缓冲液是含三氟乙酸的乙腈缓冲液，其中三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999。
由本发明所制备的胡蜂抗菌肽，对细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞的生长活性有强烈的抑制作用，不仅无溶血活性还具有血浆凝固活性等特点，因此可应用于制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物。
附图说明
图1为本发明胡蜂抗菌肽的凝胶过滤柱层析结果图。
图2为本发明胡蜂抗菌肽的离子交换柱层析结果图。
图3为本发明胡蜂抗菌肽反相高压液相色谱结果图。
具体实施方式
说明书附图1中，X轴表示试管号，即在洗脱交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱时，接收从该过滤柱中流出溶液的试管的编号，每个试管接收3毫升溶液；Y轴表示吸光值，即在280纳米波长下，试管中溶液的吸光值。
说明书附图2中，X轴表示试管号，即在洗脱羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱时，接受从该过滤柱中流出溶液的试管的编号，每个试管接收3毫升溶液；Y轴表示吸光值，即在215纳米波长下，试管中溶液的吸光值。
说明书附图3中，X轴表示洗脱时间；Y轴表示在215纳米波长下，试管中溶液的吸光值。
以下通过试验例来进一步阐述本发明所述的胡蜂抗菌肽对细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞的生长活性有强烈的抑制作用。
试验例1
胡蜂抗菌肽抑制细菌生长的试验如下：
抗菌活性检测采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。向每个平皿中注入20毫升加热溶化的培养基，并使其在皿底均匀摊布，待凝固后另取适量培养基加热溶化，再向每个皿中加入5毫升菌悬液(每毫升含有1×106个细菌)，摇匀使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中放入6个已消毒的不锈钢杯(钢杯直径为6毫米，每两个相邻的不锈钢杯之间的距离相等)。向第一个钢杯中加入0.1毫升的浓度为0.3毫克/毫升的待测品溶液，采用二倍稀释法依次向其余每个钢杯中加入0.1毫升稀释的待测品溶液，将平皿放置在37℃环境下培养，24小时后测量每个钢杯处抑菌圈大小。抑菌圈直径在10毫米以上的所对应的待测品溶液浓度作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)即能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。试验所用细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院。此试验做了四组平行试验，最终结果取几何平均值，结果如表1。
表1、胡蜂抗菌肽抑制细菌生长的试验结果
由表1可见，胡蜂毒液和胡蜂抗菌肽的纯品均具有明显的抑制细菌生长活性的作用。
试验例2
胡蜂抗菌肽抑制真菌生长的试验如下：
抗真菌活性检测采用杯碟法，培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基。向每个平皿中注入20毫升加热溶化的培养基，并使其在皿底均匀摊布，待凝固后另取适量培养基加热溶化，再向每个皿中加入5毫升菌悬液(每毫升含有1×106个真菌)，摇匀使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中放入5个已消毒的不锈钢杯(钢杯直径为6毫米，每两个相邻的不锈钢杯之间的距离相等)。向第一个钢杯中加入0.1毫升的浓度为0.3毫克/毫升的待测品溶液，采用二倍稀释法依次向其余每个钢杯中加入0.1毫升稀释的待测品溶液，将平皿放置在37℃环境下培养，24-48小时后测量每个钢杯处的抑菌圈大小。抑菌圈直径在10毫米以上的所对应的待测品溶液浓度作为最小抑菌浓度。试验所用真菌菌株来源于云南大学微生物研究所。此试验做了三组平行试验，最终结果取几何平均值，结果如表2。
表2、胡蜂抗菌肽抑制真菌生长的试验结果
由表2可见，胡蜂毒液与胡蜂抗菌肽的纯品均具有明显抑制真菌生长活性的作用。
试验例3
胡蜂抗菌肽抑制艾滋病病毒HIV-1繁殖的试验：
将JC53-BL细胞以每孔20000个的浓度接入到无菌96孔板中，培养基为sDMEM，接种后的无菌96孔板在37℃，5％CO2的条件下培养18h，分别接入最终浓度为0.1、1.25、2.5、5、10、20微克/毫升的待测品溶液，在37℃，5％CO2的条件下培养3h后，再分别加入用含DEAE-dextran的sDMEM稀释过的LAI和BAL病毒株(病毒感染复数MOI在0.009-0.65之间)，并使每孔的最终体积为200微升，再置入37℃，5％CO2培养箱内培养48h，最后将生色底物X-Gal涂于培养基表面，通过蓝斑的数量来计算待测品溶液的50％抑制浓度(IC50)，即抑制50％的病毒生长所用的待测品溶液浓度。此试验设空白对照，阳性对照及加肽而不接毒的对照，做了四组平行试验，最后结果取几何平均值，结果如下表3。
表3、胡蜂抗菌肽抑制艾滋病病毒HIV-1繁殖的试验结果
由表3可见，胡蜂毒液与胡蜂抗菌肽的纯品均具有显著的抑制艾滋病病毒HIV-1繁殖的作用。
试验例4
胡蜂抗菌肽抑制肿瘤细胞生长活性的试验：
在96孔平底细胞培养板上将待测品溶液用完全培养基进行5倍或2倍的倍比稀释，共有6个滴度，同时设置了正常细胞对照组。每孔滴加100微升浓度为3×105个/毫升的HeP3B细胞或Molt-4细胞，置入37℃，5％CO2培养箱内培养。48小时后用细胞生长抑制实验(MTT法)测定待测品溶液对细胞的毒性作用。EC50是指对50％细胞产生细胞毒作用时的待测品的浓度。试验中用了3个不同批号的胡蜂抗菌肽，且做了3组平行试验，最后结果取几何平均值，结果如表4。
表4、胡蜂抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的试验结果
目前临床上所运用的大部分抗生素药物不具有抑制肿瘤作用，从表4可见，胡蜂毒液和胡蜂抗菌肽均有显著的体外抑制肿瘤细胞生长的作用。
综合试验例1，2，3，4的结果来看，胡蜂抗菌肽具有广谱抗微生物活性，所述的微生物包括革兰氏阴、阳性细菌，真菌和病毒，例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎球菌、巨大芽孢杆菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黄曲霉、青霉、微小毛霉、啤酒酵母、HIV-1的LAI株和BAL株等；同时胡蜂抗菌肽具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，胡蜂抗菌肽处理HeP3B细胞和Molt-4细胞得到的EC50值分别为3.1微克/毫升和20.7微克/毫升，与文献报道过的能抑制肿瘤细胞生长活性的其他来源抗菌肽相比，胡蜂抗菌肽抑制肿瘤细胞生长的作用高出10-15倍。
以下结合实施例来进一步阐述本发明所述胡蜂抗菌肽的制备方法。
实施例1
制备一种胡蜂抗菌肽的步骤如下：
(1)采用6伏特的电压刺激胡蜂，将收集到的蜂毒液以10000转/分钟的转速离心10分钟，去除沉淀，将上清液进行冻干燥后得到冻干粉。取300毫克冻干粉溶解于5ml去离子水中，得到样品溶液。
(2)凝胶过滤柱层析：采用的是交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱(柱长1000毫米，直径26毫米)。用洗脱液A(PH值为6的0.1摩尔/升的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液)平衡该过滤柱后，将步骤(1)得到的样品溶液上样于过滤柱，再用洗脱液A对过滤柱进行洗脱，并收集第3个洗脱峰部分的溶液。(凝胶过滤柱层析结果见说明书附图1，第3个洗脱峰部分如A处所示。)
离子交换柱层析：采用的是羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱(柱长300毫米，直径26毫米)。用洗脱液A平衡该阳离子交换柱(加入2.5个柱体积洗脱液A至穿透峰被完全洗脱)，再将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱蜂部分的溶液上样于该阳离子交换柱，之后用洗脱液B(含1摩尔/升氯化钠的PH值为6的0.1摩尔/升的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液)对阳离子交换柱以线性梯度方式进行洗脱，收集第5个洗脱峰部分的溶液。(离子交换柱层析结果见说明书附图2，其中第5个洗脱峰部分如B处所示。)
反相高压液相色谱：采用的C18反相柱(柱长300毫米，直径5毫米)。用三氟乙酸的超纯水溶液(三氟乙酸与超纯水的体积比为1∶999)平衡该反相柱，再将离子交换柱层析收集得到的第5个洗脱峰部分的溶液上样于该反相柱，之后用洗脱液C(三氟乙酸的乙晴缓冲液，三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999)对该反相柱以线性梯度方式进行洗脱，洗脱液C的梯度范围在15％至65％之间，洗脱速度为0.7毫升/分钟，总洗脱时间为70分钟，收集洗脱时间在20.5分钟-21.3分钟之间流出的溶液。(反相高压液相色谱结果见说明书附图3，其中洗脱时间在20.5分钟-21.3分钟之间的峰是如C所示的第一大洗脱样品峰。)
通过上述的制备方法得到了一种胡蜂抗菌肽，是我们首次从中国节肢类动物胡蜂的蜂毒液中分离得到的一种单链多肽，采用飞行时间质谱法(Flight oftime mass spectrometry，TOF-MAS)测得其分子亮为1387.7道尔顿，用等电聚焦的方法测得其等电点为10，用自动氨基酸序列测定仪测得其多肽全序列为：异亮氨酸-色氨酸-色氨酸-赖氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸。
Claims (7)
1、一种胡蜂抗菌肽，其特征在于该抗菌肽是一种单链多肽，其分子量为1387.7道尔顿，等电点为10，该单链多肽的序列为：异亮氨酸-色氨酸-色氨酸-赖氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸。
2、一种制备权利要求1所述的胡蜂抗菌肽的方法，其包含以下步骤：
(1)将电刺激胡蜂收集得到的蜂毒液进行离心，收集上清液，将上清液进行冷冻干燥，得到的冻干粉溶解在去离子水中后得到样品溶液；
(2)将步骤(1)得到的样品溶液依次经过凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析和反相高压液相色谱进行分离纯化得到该胡蜂抗菌肽。
3、根据权利要求2所述的胡蜂抗菌肽制备方法，其特征是步骤(1)采用6伏特的电压刺激胡蜂得到蜂毒液。
4、根据权利要求2所述的胡蜂抗菌肽制备方法，其特征是步骤(2)中所述的凝胶过滤柱层析是指：将得到的样品溶液通过交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱后，再用洗脱液来洗脱该过滤柱，收集第3个洗脱峰部分的溶液，所述的交联葡聚糖凝胶G-50过滤柱的柱长为1000毫米，直径为26毫米，所述的洗脱液是PH值为6的0.1摩尔/升的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
5、根据权利要求4所述的胡蜂抗菌肽制备方法，其特征是步骤(2)中所述的离子交换柱层析是指：将凝胶过滤柱层析收集到的第3个洗脱峰部分的溶液通过羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该阳离子交换柱，收集第5个洗脱峰部分的溶液，所述的羧甲基-交联葡聚糖凝胶C-25阳离子交换柱的柱长为300毫米，直径为26毫米，该操作中使用的洗脱液是含1摩尔/升氯化钠的PH值为6的0.1摩尔/升的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
6、根据权利要求5所述的胡蜂抗菌肽制备方法，其特征是步骤(2)中所述的反相高压液相色谱是指：将离子交换柱层析收集到的第5个洗脱峰部分的溶液通过C18反相柱后，再用洗脱液以线性梯度方式洗脱该C18反相柱，洗脱液梯度范围在15％-65％，洗脱速度为0.7毫升/分钟，总洗脱时间为70分钟，收集洗脱时间在20.5分钟-21.3分钟之间流出的溶液，所述的C18反相柱的柱长为300毫米，直径为5毫米，该操作中使用的缓冲液是含三氟乙酸的乙腈缓冲液，其中三氟乙酸与乙腈的体积比为1∶999。
7、一种权利要求1所述的胡蜂抗菌肽在制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物中的应用。
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