CN112961218A

CN112961218A - 具有广谱杀菌活性的肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112961218A
Application number: CN202110330158.5A
Authority: CN
Inventors: 谭垦; 温心馨
Original assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Current assignee: Xishuangbanna Tropical Botanical Garden of CAS
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2021-03-29
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2041-03-29
Also published as: CN112961218B

Abstract

本发明公开了一种具有广谱杀菌活性的肽及其制备方法与应用，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述肽的制备方法，是根据所述肽的氨基酸序列SEQ ID NO.1，标准固相肽合成程序人工合成所述肽；或是将包括SEQ ID NO.2所示序列的121‑162位核苷酸的编码所述肽的核苷酸序列克隆表达载体，并将重组后的DNA转化入宿主细胞，进行重组表达，纯化后获得所述肽。所述肽的应用为在制备抗金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和革兰氏阳性菌感染药物中的应用。本发明提供的肽具有广谱抗菌性、无溶血性、避免细菌产生耐药性且最小抑菌浓度低等特点，具有较大的应用空间。

Description

具有广谱杀菌活性的肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有广谱杀菌活性的肽及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，抗生素滥用现象普遍存在，导致细菌出现耐药性。抗菌肽的发现，成为替代抗生素的潜在开发药物。传统抗菌肽存在很多缺陷，例如，某些抗菌肽的抗菌效果具有单一性，只对某种菌株有抑制作用；部分抗菌肽只有在较大浓度的用药量大时才会产生抑菌效果等。细菌耐药性、传统抗生素的缺陷等问题的出现迫使人们研发新型抗菌肽。

胡蜂，别名黄蜂、长腿蜂，虎头蜂等，是一种分布广泛，社会价值高的膜翅目昆虫。胡蜂毒液中含有丰富的生物活性物质，其中包括多种胺类、小肽类和高分子量蛋白质，如酶、过敏原和毒素等。近些年来胡蜂毒液在诸多方面发挥了巨大作用，相关研究表明胡蜂毒液是药理等新型活性物质开发的潜在来源。近年来，胡蜂抗菌肽Mastoparan的应用领域也较为广泛，Mastoparan 是胡蜂蜂毒中的一种由十四个氨基酸组成的单链阳离子十四肽，在抗菌检测和癌症治疗等方面都有显著成效。因此，研究开发新的高效低毒的胡蜂抗菌肽Mastoparan是极其重要的。

本发明旨在提供一种具有广谱杀菌活性的新型肽，并研究其抑菌机制，以给广谱抗菌、抵制抗生素耐药性和肿瘤治疗等方面的新型药物的研发提供模板。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种具有广谱杀菌活性的肽，本发明的第二目的在于提供编码所述肽的基因及其制备方法，本发明的第三目的在于提供所述肽的生物活性的预测方法，本发明的第四目的在于提供所述肽的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，一种具有广谱杀菌活性的肽，所述胡蜂其氨基酸序列为INLRAIAALAKKLL，如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二目的是这样实现的，编码所述肽的基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列的121-162位核苷酸。

本发明编码所述肽的基因的制备方法，包括以下步骤：

1）提取黑尾胡蜂毒液总RNA，进行反转录PCR得到cDNA第一链；

2）以所述cDNA第一链作为模板，进行PCR扩增获得含所述肽编码序列的PCR扩增产物；

3）步骤2的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段，得到目标物。

本发明的第三目的是这样实现的，所述肽的生物活性的预测方法，是通过生物信息学手段分析所述肽的氨基酸序列的理化参数、螺旋轮投影图和三维结构图，从而预测得出所述肽的生物活性。

本发明所述肽的应用是在制备抗金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和革兰氏阳性菌感染药物中等抗菌制剂中的应用。

本发明的有益效果为：

1）本发明提供了一种新肽，本发明通过生物信息学手段，预测得出本新肽具有α-双螺旋结构、带有正电荷、两亲性等特征，进一步预测得出其具有抗菌活性，本预测活性的方法能够避免实验损耗，降低实验成本。

2）本发明根据生物活性预测结果，进一步对本发明的肽进行抑菌活性检测，检测结果证实了预测结果，并且从检测结果可知本发明的肽具有广谱抗菌性且最小抑菌浓度低、无溶血性以及避免细菌产生耐药性等特点，属于胡蜂抗菌肽Mastoparan家族，在制备抑菌药物上具有较大的应用空间。

3）本发明通过研究所述肽作用于大肠杆菌的菌体细胞膜的破裂机制以及菌体DNA的损伤机制，发现本发明的肽对细菌的抑制作用与传统抗生素的作用机制不同，传统抗生素只对细菌起到抑制作用，而本发明的肽直接破坏细胞壁膜，杀死细胞。因此，本发明的肽不会造成细菌产生耐药性。本研究为机制为进一步研究抗菌肽及的作用机制以及研制新型抗菌肽药物提供了新的思路及方向。

附图说明

图1为本发明肽的 DNA及相应氨基酸序列表；

图2为本发明肽的HPLC图谱；

图3为本发明肽的MS质谱图；

图4为本发明肽的螺旋轮投影图；

图5为本发明肽的亲、疏水性分析图；

图6为本发明肽的三维结构图；

图7为本发明肽的化学结构图；

图8为本发明肽的PI染色图；

图9为本发明不同浓度（ug/ml）肽对大肠杆菌DNA结合的凝胶阻滞分析图。

具体实施例

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明要求保护的肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明编码所述肽的基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列的121-162位核苷酸。

本发明编码所述肽的基因的制备方法，包括以下步骤：

1）提取黑尾胡蜂毒液总RNA，进行反转录PCR得到cDNA第一链；

所述步骤2中，PCR扩增的正向引物为：5' -ATGAGTGCCGAAGCTTTAGCT-3'；反向引物为：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3' ；

其中，N =A, G, C, or T; N-1=A, G, or C。

所述步骤2中，PCR扩增的反应程序如下：94℃ 1分钟，执行92℃ 10秒，53℃ 30秒和72℃ 40秒共30个循环，以及72℃ 10分钟，获得PCR扩增产物。

本发明所述肽的生物活性的预测方法，是通过生物信息学手段分析所述肽的氨基酸序列的理化参数、螺旋轮投影图和三维结构图，从而预测得出所述肽的生物活性。

所述肽的氨基酸序列的理化参数采用ExPASy 的ProtParam tool分析预测；所述肽的螺旋轮结构图采用HeliQuest软件分析预测；所述肽的三维结构采用Swiss软件进行分析预测。

本发明所述肽可以通过以下方法之一制备：

1、根据所述肽的氨基酸序列，标准固相肽合成程序人工合成所述肽。

2、将编码所述肽的核苷酸序列克隆如重组表达载体，并将重组后的DNA转化入宿主细胞，进行重组表达，纯化后获得所述肽。

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1 本发明肽cDNA的获取及测序

1、于云南昆明捕捉10只左右黑尾胡蜂，将具有生物活性的活胡蜂直接放入液氮并在超净台内对其解剖获得毒囊，胡蜂毒囊用锡纸包裹放入液氮直至使用。将十个毒囊放入研磨器中进行研磨，期间一直保持低温液氮状态，研磨完成后向样本中加入TranZol，并使用TransZol Up Plus RNA 试剂盒提取胡蜂毒液的RNA。所获得的RNA用BioPhotometer测定其浓度并保存至-80℃冰箱。

2、使用HiScript II 1^stStand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（Vazyme BiotechCo.,Ltd），将胡蜂毒液中提取出来的RNA模板进行变性以及基因组DNA去除从而合成cDNA一链，具体步骤如下：

1）RNA模板变性（RT-PCR）

在RNase-free 离心罐中配置如下混合液

总RNA 4μL

Oligo(dT)23VN(50μN) 1μL

dd H₂O 7μL

65℃加热5min,迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min得到第一混合液。

2）基因组DNA去除

第一混合液 12μL

4×gDNA wiper Mix 4μL

用移液枪轻轻吹打混匀。42℃ 2min得到第二混合液

3）配置第一链cDNA合成反应液

第二混合液 12μL

10×RT Mix 4μL

Hiscript

Enzyme Mix 2μL

用移液枪轻轻吹打。

4）按下列条件进行第一链cDNA合成反应

50℃ 45min

85℃ 2min

5）-20℃保存。

3、将步骤2得到的cDNA一链的产物、正向引物和反向引物以及2*green mix的合成液在程序为94℃ 1分钟，执行92℃ 10秒，53℃ 30秒和72℃ 40秒共30个循环，以及72℃ 10分钟完成第二次PCR。

构建cDNA文库的正向引物为：5' -ATGAGTGCCGAAGCTTTAGCT-3'；反向引物为：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3' (N =A, G, C, or T; N-1=A, G, or C)；其中正向引物和反向引物均根据NCBI中查到的已知胡蜂天然抗菌肽前体肽的信号肽设计而成。

4、将第二次PCR产物进行凝胶电泳，用凝胶系统观察，如有目标条带在200-300bp则使用Fast Pure Gel DNA Extraction Mini试剂盒进行PCR产物胶回收，所得DNA产物用BioPhotometer测定其浓度并保存至-20℃冰箱。

5、使用pMD^TM19-T载体试剂盒对胡蜂DNA进行克隆，并将连接产物加入到大肠杆菌DH5a感受态细胞（Takara）中进行表达，使用蓝白斑进行筛选，挑选出白色菌落于1ml含1 ‰Amp的LB培养基中孵育6小时，并送测序公司测序。

所得到的测序结果如序列表2所示。将序列测序结果与所使用引物的原序列通过软件DNAMAN进行氨基酸翻译及序列比对（图1），发现新的由十四个氨基酸组成的阳离子十四肽：INLRAIAALAKKLL，该序列如SEQ ID NO：1所示。通过在NCBI蛋白质数据库进行搜索比对，发现该肽为新肽，数据库中并无相同序列的肽。

实施例2 本发明肽的合成

按照标准固相肽合成程序人工合成所述肽，合成肽经分离提纯得到得到纯度为98%的肽。利用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）对所述肽分子量和纯度进行鉴定。所述肽合成由吉尔生化有限公司完成，样品纯度为98%，分子量为1507.93，其HPLC图如图2所示，其MS质谱分析图见图3。

实施例3 本发明肽的结构特性分析

通过使用生物信息学手段，对所述肽的理化参数进行分析：采用ExPASy 的ProtParam tool对所述肽的结构进行在线分析：多肽的螺旋轮结构图由HeliQuest软件分析；多肽序列的三维结构由Swiss软件进行预测。通过分析MP-LR氨基酸序列的理化参数、螺旋轮投影图和三位结构图预测所述肽是否具有抑菌活性。具体理化参数见表1。

结果分析：通过使用ExPASy-ProtParam tool蛋白质理化性质在线分析工具，可以得到五个多肽的各种理化参数。其中不稳定系数值小于40时，可判断该序列为稳定蛋白。由表1可知，所述肽的预测分子量与上述MS实测分子量完全一致。所述肽的系数值都小于40，可初步预测这五种蛋白质为稳定蛋白。根据总平均亲水性（Grand average ofhydropathicity）特指氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的定律可知，五种抗菌肽均有一定的疏水性。所述肽带有三个正电荷。这些理化参数特征与报道过的抗菌肽存在很多共性，如稳定蛋白、带有2-7个正电荷、具有一定的疏水性等；所述肽具有典型抗菌肽两亲性的特征，从图4螺旋轮投影图可观察到亲水性残基Arg (R)和Lys (K) 位于螺旋结构的一侧；疏水性残疾Ala (A)、Ile (I)和Leu (L)残基位于螺旋的另一侧。可初步说明所述肽具有两亲性；另外，图5说明抗菌肽MP-LR的亲水、疏水性特征均表现为N端具有强亲水性，C端具有强疏水性，说明其具有两亲性的特征，这种两亲性特征是所有传统抗菌肽所具有的共性特征。因此，图4和图5均可预测其具有抗菌活性。图6表明其具有典型抗菌肽所有的α-双螺旋结构特征。图7为本发明肽的化学结构式。通过这些理化特征和参数性质可预测其具有抑菌活性，有望成为新型胡蜂抗菌肽。

表1本发明肽的理化参数分析

实施例4 本发明肽的体外抑菌活性检测

检测方法：取对数生长的大肠杆菌菌液高速离心3分钟获得菌体沉淀，并使用1*PBS溶液离心洗涤3次；洗涤完成后，使用MHB肉汤培养基重悬菌体并使其浓度达到实验要求：OD₆₀₀=1；随后用MH肉汤培养基稀释100倍，使菌液含菌量约为10⁶ CFU/mL。配置浓度为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL的所述肽的缓冲液；取等体积不同浓度的抗菌肽和菌液混合并加入到96孔细菌培养板，阴性对照组只添加大肠杆菌重悬液，稀释1000倍的氨苄霉抗生素作为阳性对照，每个实验组重复三次。将96孔细菌培养板置于37 ℃恒温培养箱培养16 -18小时后，使用多功能酶标仪测定每孔混合液在600nm波长下的吸光值。最后根据公式：抑菌率=（阳性对照OD值-试验OD值）/（阳性对照OD值-阴性对照OD值）*100%得到所述肽在不同浓度下的抑菌率，并比较得出所述肽的最小抑菌浓度。

结果及分析：

所述肽的最小抑菌浓度如表3所示，所述肽对于金黄色葡萄球菌的最小抑菌率为16ug/ml，对于枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为128ug/ml，对于粪肠球菌的最小抑菌浓度为256ul/ml，以及对于大肠杆菌的最小抑菌浓度为16ug/ml。通过最小抑菌浓度（MIC）测得所述肽对革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和革兰氏阳性菌的大肠杆菌都有显著的抑制作用，证明所述肽为新型胡蜂抗菌肽，且具有广谱抗菌性，命名为胡蜂抗菌肽MP-LR。

表3 胡蜂抗菌肽MP-LR最小抑菌浓度

实施例5 胡蜂抗菌肽MP-LR的红细胞溶血性检测

检测方法：取1ml脱脂绵羊血（Solarbio）低速离心弃去上清液获得红细胞沉淀，用PBS缓冲液洗涤红细胞2-3次直至上清为淡黄色，将洗涤后的红细胞配置成2%的红细胞悬液。配置浓度为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL的抗菌肽缓冲液；并将MP-LR抗菌肽溶液与红细胞悬液混合并于37℃ 孵育30小时；孵育结束后，将混合液低速离心5分钟，取上清于96孔细胞培养板，使用多功能酶标仪测定上清液在540nm波长下的吸光值；根据公式：溶血率=（Apeptide-APBS）/（A0.1% Trion X-100-APBS）* 100% 计算抗菌肽的溶血率。

结果分析：根据公式测得MP-LR胡蜂抗菌肽在最大浓度256ug/ml时，对脱脂绵羊红细胞的溶血率为2.5863%。因此，判断该胡蜂抗菌肽MP-LR无溶血性。

实施例6 胡蜂抗菌肽MP-LR对大肠杆菌抑制作用机制

1、菌体细胞膜破裂机制

取对数生长的大肠杆菌菌液高速离心3分钟获得菌体沉淀，并使用1*PBS溶液离心洗涤3次；洗涤完成后，使用1*PBS溶液重悬菌体并稀释其浓度为1×10⁶ CFU/mL。配置浓度为1MIC的抗菌肽缓冲液和作为空白对照组的1*PBS溶液；并将不同浓度的等体积比例的抗菌肽溶液和1*PBS溶液分别与大肠杆菌菌体悬液混合，37℃恒温培养箱孵育2小时；孵育结束后，高速离心3分钟，弃上清，并使用1ml PBS缓冲液重悬菌体终止抗菌肽继续发挥作用；向重悬液体中加入100ul的PI染液，并于37℃恒温培养箱孵育20分钟，孵育结束后，离心弃上清，用PBS溶液洗涤两次弃多余PI染料。吸取10ul重悬液体于载玻片，并使用激光共聚焦显微镜观察破裂细胞染色情况（图8）。

结果分析：胡蜂抗菌肽MP-LR与菌液在37℃恒温培养箱孵育30分钟后，菌体细胞膜破裂，PI染料进入到胞内，对细胞进行染色；通过观察PI染色结果（图8）：添加无菌水的空白对照组并无细胞发出红色荧光；添加1MIC抗菌肽的实验组有大量细胞发出红色荧光；两者差异显著。研究表明：PI染料是一种对DNA染色的细胞核染色试剂，只有当细胞膜破裂时，才能对细菌细胞内的核酸进行染色并发出红色荧光；而拥有完整细胞膜的菌体细胞无法被染色，从而产生显著差别，验证多肽破坏菌体细胞膜的完整性。本次实验中，MP-LR作用与菌体并致其细胞膜的完整性遭到破坏，PI染料进入胞膜内，产生大量的红色荧光，因此可以判断MP-LR是通过破坏细胞膜的完整性来产生抑菌和杀菌的效果。菌体膜破裂的原因可能是由于MP-LR是具有生物活性的聚阳离子分子，可以附着在生物膜上，并通过其α-螺旋结构的带正电荷的侧链形成孔，从而增加细胞膜的通透性；还有一种原因可能是胡蜂多肽可插入到膜脂双层内，造成膜的不稳定性，从而导致胞膜破裂。

2、菌体细胞膜破裂机制菌体DNA损伤机制

取对数生长的大肠杆菌菌液高速离心3分钟获得菌体沉淀，并使用1*PBS溶液离心洗涤3次；洗涤完成后，使用1*PBS溶液重悬菌体并稀释其浓度为1×10⁶ CFU/mL。使用细菌基因组DNA提取试剂盒（Vazyme Biotech Co.,Ltd）。配置浓度为256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL的抗菌肽缓冲液分别与等体积的大肠杆菌DNA溶液混合并于37℃恒温培养箱孵育3小时。孵育结束后，配置1%的琼脂糖凝胶，电压设置为120V，运行40分钟，观察凝胶成像（图9）。

结果分析：由图4可知，含有较大浓度MP-LR的菌体DNA条带呈现消失状态； 1ug/ml、2 ug/ml、4 ug/ml、8 ug/ml、16ug/ml和32 ug/ml的MP-LR与细菌菌体DNA结合时，条带出现弥散和游离状态，且条带颜色暗淡；但当细菌菌体DNA未添加MP-LR的条带(图7中标记为0的条带)清晰、明亮，无迁移、弥散等现象出现，与含有MP-LR的DNA条带形成鲜明对比。说明抗菌肽MP-LR是直接作用于细菌的DNA上。出现这种情况的原因可能是由于MP-LR蛋白质作用于细菌菌体，并附着于菌体双螺旋表面，阻滞菌体DNA 与EB产生互作，致使条带消失或弥散；或者胡蜂抗菌肽MP-LR作用于细菌菌体时使其基因组DNA产生降解，不同浓度的MP-LR对菌体基因组DNA产生降解的程度不同，因此高浓度下的条带消失，较低浓度下的条带弥散和游离。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院西双版纳热带植物园

<120> 具有广谱杀菌活性的肽及其制备方法与应用

<130> 202103

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ile Asn Leu Arg Ala Ile Ala Ala Leu Ala Lys Lys Leu Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aatggaatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga cgattatgag tgccgaagtt 60

ttagctgacc caaaagctga tccattagct ggtccaaatc ctgatgctga tccagaagca 120

ataaacctga gggctattgc agcattggct aagaaactat taggttaaca tatcgtttat 180

tccgaaaatg aaatatatgt tcttgatgaa atgtaaaagt tatattgagt tatgatatta 240

taaattgttg tgcacattga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaca tgtcggccgc 300

ctcggcctct agaataatct ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcactggccg 360

tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 420

cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc 480

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 540

tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 600

agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc 660

tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt 720

tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat 780

aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg 840

tgcgcgaacc cctatttgtt attttcaaat acattcaata tgtatccgct ctgagacata 900

accctgataa tgcttcataa tttgaaaagg aaaagatgag attcaaattt ccgggcgccc 960

tattcctttt tgcgcatttg ctcctgtttt gtccccaaa 999

Claims

1.肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述肽的基因，其特征在于，所述肽的基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示序列的121-162位核苷酸。

3.权利要求2编码所述肽的基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取黑尾胡蜂毒液总RNA，进行反转录PCR得到cDNA第一链；

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤2中，PCR扩增的正向引物为：5'-ATGAGTGCCGAAGCTTTAGCT-3'；反向引物为：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3' ；

其中，N =A, G, C, or T; N-1=A, G, or C。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤2中，PCR扩增的反应程序如下：94℃ 1分钟，执行92℃ 10秒，53℃ 30秒和72℃ 40秒共30个循环，以及72℃ 10分钟，获得PCR扩增产物。

6.权利要求1所述肽的制备方法，其特征在于，是根据所述肽的氨基酸序列SEQ IDNO.1，标准固相肽合成程序人工合成所述肽。

7.权利要求1所述肽的制备方法，其特征在于，是将包括SEQ ID NO.2所示序列的121-162位核苷酸的编码所述肽的核苷酸序列克隆表达载体，并将重组后的DNA转化入宿主细胞，进行重组表达，纯化后获得所述肽。

8.权利要求1所述肽的生物活性的预测方法，其特征在于，是通过生物信息学手段分析所述肽的氨基酸序列的理化参数、螺旋轮投影图和三维结构图，从而预测得出所述肽的生物活性。

9.根据权利要求8所述预测方法，其特征在于，所述肽的氨基酸序列的理化参数采用ExPASy 的ProtParam tool分析预测；所述肽的螺旋轮结构图采用HeliQuest软件分析预测；所述肽的亲水、疏水性分析由ProtScale进行预测；所述肽的三维结构采用Swiss软件进行分析预测。

10.权利要求1所述肽在制备抗金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和革兰氏阳性菌感染药物中的应用。