KR20190077568A - CRISPR-Cas9의 억제제 - Google Patents

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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

Cas9 억제 폴리펩타이드 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

CRISPR-Cas9의 억제제
관련 특허 출원의 상호 참조
본 발명은 2016년 11월 16일에 제출된 미국 가출원 제62/422,850호의 우선권의 이익을 주장하고, 상기 가출원은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
바이러스로부터의 공격을 막는 능력은 세포의 삶의 특징이다. 박테리아는 박테리아 바이러스(파지)에 의한 감염에 저항하기 위해, 제한 효소 및 CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 다수의 메커니즘을 이용한다(문헌 [Labrie, S.J., Samson, J.E., and Moineau, S. (2010). Nat Rev Micro, 8, 317-327]). CRISPR 어레이는, 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문성 반복 서열 사이에 위치한 작은 스페이서 서열로서의 이동 유전 엘리먼트와의, 이전 만남의 서열 특이적 잔존물을 갖는다(문헌 [Mojica, F.J.M et al. (2005). J. Mol. Evol., 60, 174-182]). 이 스페이서는 프로그래밍된 타겟의 결합 및 절단을 용이하게 하는 가이드 RNA를 생성하기 위해 이용된다(문헌 [Brouns, S.J.J et al. (2008). Science, 321, 960-964; Garneau, J.E. et al. (2010). Nature, 468, 67-71]). 면역 기능을 위해 요구되는 CRISPR 연관(cas) 유전자는 CRISPR 어레이에 인접하여 발견된다(문헌 [Marraffini, L.A. (2015). CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature, 526, 55-61], [Wright, A.V., Nunez, J.K., and Doudna, J.A. (2016). Cell, 164, 29-44]). Cas 단백질은 외래 게놈의 파괴를 수행할 뿐만 아니라(문헌 [Garneau, J.E. et al. (2010). Nature, 468, 67-71]), 성숙 CRISPR RNA(crRNA)의 생성(문헌 [Deltcheva; Haurwitz, R.E et al. (2010). Science, 329, 1355-1358]) 및 외래 서열을 CRISPR 어레이에 획득시키는 것(문헌 [Nunez, J.K. et al. (2014). Nat. Struct. Mol. Biol , 21, 528-534], [Yosef, I., Goren, M.G., and Qimron, U. (2012). Nucleic Acids Research, 40, 5569-5576])을 용이하게 한다.
CRISPR-Cas 적응 면역 시스템은 박테리아 세계에서 일반적이고 다양하다. 박테리아 게놈에 걸쳐 RNA 가이드에 의해 지정된 대로 타겟 DNA 또는 RNA 서열을 절단하는 능력을 갖는 6종의 상이한 타입(I-VI)이 확인되었다(문헌 [Abudayyeh, O.O et al. (2016). Science aaf5573], [Makarova, K.S. et al. (2015). Nat Rev Micro, 13, 722-736). Nat Rev Micro, 13, 722-736]). CRISPR-Cas 시스템의 용이한 프로그래밍 가능성이 널리 이용되어, 많은 새로운 유전자 기술의 문을 열었다(문헌 [Barrangou, R., and Doudna, J.A. (2016), Nature Biotechnology, 34, 933-941]). 이러한 기술의 대부분은 스트렙토코커스 파이오진스(Streptococcus pyogenes)(Spy)로부터의 Cas9와, 동물 세포에서의 유전자 편집을 포함하는, 이러한 적용분야의 기초가 되는 조작된 단일 가이드 RNA를 함께 사용한다(문헌 [Cong, L. et al. (2013). Science 339, 819-823], [Jinek, M. et al. (2012). Science, 337, 816-821], [Mali, P. et al. (2013). Science, 339, 823-826], [Qi, L.S. et al. (2013). Cell, 152, 1173-1183]). 추가로, II-A 서브타입 내의 Cas9 오르토로그(ortholog)가 유전자 편집 적용을 위해 조사되었으며(문헌 [Ran, F.A. et al. (2015). Nature 520, 186-191]), Cpf1(타입 V, 문헌 [Zetsche, B. et al. (2015). Cell, 163, 759-771]) 및 C2c2(타입 VI, 문헌 [Abudayyeh, O.O et al. (2016). Science aaf5573], [East-Seletsky, A. et al. (2016). Nature 538, 270-273])와 같은 신규한 클래스 2 CRISPR 단일 단백질 이펙터가 특징 규명되고 있다. 클래스 1 CRISPR-Cas 시스템(타입 I, III, 및 IV)은 RNA 유도 다중 단백질 복합체이고, 따라서 이의 복잡성 때문에 대부분의 게놈 적용분야에서 간과되었다. 그러나, 이 시스템은 모든 박테리아의 약 절반 및 고세균의 ~85%에서 발견되는, 자연에서 가장 일반적인 것이다(문헌 [Makarova, K.S. et al. (2015). Nat Rev Micro, 13, 722-736. Nat Rev Micro, 13, 722-736]).
파지 감염에 대한 박테리아 전쟁에 대응하여, 차례로, 파지는 대개 파지의 숙주 박테리아를 용해시키거나 또는 숙주 박테리아의 게놈에 통합시키는 능력을 향상시키는 박테리아 면역 시스템의 억제제를 코딩한다(문헌 [Samson, J.E. et al. (2013). Nat Rev Micro, 11, 675-687]). 파지 코딩된 "항 CRISPR" 단백질의 제1 예는 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 (클래스 1) 타입 I-E 및 I-F 시스템에 대한 것이다(문헌 [Bondy-Denomy et al. (2013). Nature , 493, 429-432], [Pawluk, A. et al. (2014). mBio 5, e00896]). 놀랍게도, 현재까지 10종의 타입 I-F 항 CRISPR 및 4종의 타입 I-E 항 CRISPR 유전자가 발견되었으며(문헌 [Pawluk, A. et al. (2016). Nature Microbiology, 1, 1-6]), 이들 모두가 이전에 기능이 알려지지 않은 별개의, 작은 단백질(50개 내지 150개의 아미노산)을 코딩한다. 4종의 I-F 항 CRISPR 단백질에 대한 본 발명자의 생화학적 연구는 이 단백질이 다중 단백질 CRISPR-Cas 복합체의 상이한 Cas 단백질과 직접 상호작용하여 타겟 DNA의 인식 또는 절단을 방지한다는 것을 밝혔다(문헌 Bondy-Denomy, J et al. (2015). Nature, 526, 136-139]). 각 단백질은 별개의 서열, 구조, 및 작용 양식을 갖는다(문헌 [Maxwell, K.L. et al. (2016). Nature Communications, 7, 13134], [Wang, X. (2016). Nat. Struct. Mol. Biol 23, 868-870]). 이러한 발견은 CRISPR-Cas 억제제의 독립적인 진화를 지지하고, 더 많은 것이 아직 발견되지 않았다는 것을 암시한다. 이러한 관점에서, 최근의 논문은 P. 에어루기노사(P. aeruginosa) 외부의 항 CRISPR 유전자를 동정하기 위해 시그니쳐 항 CRISPR 연관(aca) 유전자와 예측된 헬릭스-턴-헬릭스(HTH) 모티프의 보존을 이용하였다. 이로 인해 저자들은, 타입 I-F CRISPR-Cas 계통발생에 광범위하게 걸쳐 있는, 프로테오박테리아 전체에 걸친 항 CRISPR을 발견하였다(문헌 [Pawluk, A. et al. (2016). Nature Microbiology, 1, 1-6]). 이는 항 CRISPR이 모든 CRISPR 시스템에 대해 존재할 수 있어서, 이들을 발견할 수 있는 방법이 필요하다는 것을 시사한다.
P. 에어루기노사의 타입 I 항 CRISPR은 통합된 파지 게놈(프로파지)으로부터 발현되어, 숙주 CRISPR-Cas 시스템의 구성적 비활성화를 유도한다(문헌 [(Bondy-Denomy et al. (2013). Nature , 493, 429-432)]). 이는 대개, "셀프 타게팅"(도 1A)이라고 불리는, 프로파지가 동일 세포에서 동시에 발생하는 CRISPR 스페이서와 완전한 동일성을 갖는 DNA 타겟을 갖는 상황을 유도할 수 있다. 이러한 상황은 CRISPR-Cas 비활성화를 생존을 위한 요구조건으로 만들고, 프로파지 항 CRISPR 유전자가 없는 경우와 같이, 숙주 게놈이 프로파지를 타게팅하는 작용으로 절단된다(문헌 [(Bondy-Denomy et al. (2013). Nature , 493, 429-432], [Edgar, R., and Qimron, U. (2010). J. Bacteriol 192, 6291-6294]). 그러나, 항 CRISPR의 발현은 이러한 위험을 중화시켜서, 리소겐의 생존을 허용한다. 본 발명자는 명백한 셀프 타게팅을 갖는 CRISPR 시스템을 보유한 게놈이 새로운 CRISPR-Cas 억제제의 동정을 위한 후보가 될 것이라고 추측했다. 여기에서, 본 발명자는 셀프 타게팅의 사건을 확인하기 위한 생물정보학 접근법을 이용하여, 이전에 알려지지 않은 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes)의 파지 코딩된 CRISPR-Cas9 억제제를 동정하는 것을 기술한다. 본 발명자는 이 억제제 중 2종이 또한 박테리아 및 인간 세포에서 S. 파이오진스(S. pyogenes) Cas9의 활성을 차단할 수 있다는 것을 보여준다.
정의
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 언급한다. 구체적으로 한정되지 않으면, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라, 보존적으로 변형된 이의 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보적인 서열을 내포한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌 [Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)], [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)], 및 [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "유전자"는 폴리펩타이드 사슬을 생산하는 데 관여하는 DNA의 세그먼트를 의미한다. 이는 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론) 뿐만 아니라, 코딩 영역의 앞뒤 영역(리더 및 트레일러)을 포함할 수 있다.
"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 어레이로서 정의된다. 본원에 사용되었듯이, 프로모터는 전사의 시작 부위 근처의 필요한 핵산 서열, 예컨대, 폴리머라제 II 타입 프로모터의 경우, TATA 엘리먼트를 포함한다. 프로모터는 또한 선택적으로 전사의 시작 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 리프레서 엘리먼트를 포함한다. 프로모터는 이종성 프로모터일 수 있다.
"발현 카세트(expression cassette)"는 숙주 세포에서 특정 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 엘리먼트로, 재조합으로 또는 합성으로 생성된 핵산 구조물이다. 발현 카세트는 플라스미드, 바이러스 게놈, 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 카세트는, 경우에 따라 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 전사시키고자 하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 프로모터는 이종성 프로모터일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터에 관하여, "이종성 프로모터"는 자연 생성물에서(예를 들어, 야생형 유기체에서) 발견되는 것과 동일한 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되지 않는 프로모터를 언급한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 세 용어 모두 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체에 뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산 중합체 및 비자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에 사용되었듯이, 상기 용어는 전장(full-length) 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하며, 여기에서 아미노산 잔기는 공유 펩타이드 결합에 의해 연결된다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 언급한다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변경시키지 않고 상응하는 기재된 코돈 중 어떤 것으로든 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산(통상적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG를 제외함)의 각 코돈은 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 기술된 각 서열에 내포되어 있다.
아미노산 서열에 관해서, 당업자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 퍼센티지의 아미노산을 변경, 추가 또는 결실시키는, 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 추가는 "보존적으로 변형된 변이체"로서, 상기 변경이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시킨다는 것을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체, 및 대립유전자에 추가된 것이며, 이들을 배제하지 않는다. 몇몇 경우에, Cas9 또는 sgRNA의 보존적으로 변형된 변이체는 본원에 기술된 바와 같이 증가된 안정성, 어셈블리, 또는 활성을 가질 수 있다.
다음의 8개의 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);
7) 세린(S), 트레오닌(T); 및
8) 시스테인(C), 메티오닌(M)
(예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984)] 참조).
본원에서 아미노산은 이의 일반적으로 공지된 3문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 1문자 기호로 언급될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드도 이의 일반적으로 허용되는 단문자 코드로 언급될 수 있다.
본 발명에서, 아미노산 잔기는 변형되지 않은 야행성 폴리펩타이드 서열에서, 번호가 1인 가장 왼쪽 잔기로부터, 이의 상대적 위치에 따라 번호가 매겨진다.
본원에 사용되었듯이, 두 개 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 기술하는 문맥에서, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 두 개 이상의 서열 또는 지정된 부분서열을 언급한다. "실질적으로 동일한" 두 서열은, 비교 창 또는, 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정된 지정된 영역에 대하여, 최대 일치를 위해 비교되고 정렬될 때, 또는 구체적 영역이 지정되지 않은 경우 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 적어도 60%, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 동일성을 갖는다. 폴리뉴클레오타이드 서열과 관련하여, 이 정의는 또한 시험 서열의 상보서열을 언급한다. 몇몇 경우에, 아미노산 서열과 관련하여, 적어도 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이의 영역, 또는 더 바람직하게는 75개 내지 100개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이의 영역에 대하여 동일성이 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요할 경우, 부분 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있고, 또는 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 그 후 서열 비교 알고리즘은, 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열에 대한 시험 서열의 백분율 서열 동일성을 계산한다. 핵산 및 단백질의 서열 비교를 위해, 하기 언급되는 BLAST 2.0 알고리즘 및 디폴트 파라미터가 사용된다.
본원에 사용되는 "비교 창"은, 20 내지 600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 더 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 세그먼트에 대한 언급을 포함하며, 두 서열이 최적으로 정렬된 후, 서열은 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교될 수 있다.
백분율 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위한 알고리즘은 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 문헌 [Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기술된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트 ncbi.nlm.nih.gov에서 공개적으로 이용할 수 있다. 상기 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드와 정렬될 때 몇몇 양의 값의 역치 점수 T와 일치하거나 만족하는, 쿼리 서열에서 길이가 W인 짧은 워드를 확인함으로써 고득점 서열 쌍(HSP)을 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는 인접 워드 역치로 언급된다(문헌 [Altschul et al., supra]). 이러한 초기 인접 워드 히트(hit)는 검색을 시작하는 시드(seed)로서 작용하여, 이를 포함하는 더 긴 HSP를 검색한다. 그 후 워드 히트는 누적 정렬 점수를 증가시킬 수 있을 때까지 각 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 뉴클레오타이드 서열의 경우, 누적 점수는 파라미터 M(일치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치하는 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 누적 점수를 계산하기 위해 점수 매트릭스가 사용된다. 누적 정렬 점수가 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 떨어질 때; 하나 이상의 음의 점수를 갖는 잔기 정렬의 누적 때문에 누적 점수가 0 이하가 될 때; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달할 때, 각 방향의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정한다. (뉴클레오타이드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 28의 워드 크기(W), 10의 기대값(E), M=1, N=-2, 및 두 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다. 아미노산 서열에 대해서는, BLASTP 프로그램은 3의 워드 크기(W), 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 점수 매트릭스를 디폴트로서 사용한다(문헌 [Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)] 참조).
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌 [Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는, 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 시험 핵산과 참조 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만일 경우, 핵산이 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
"CRISPR/Cas" 시스템은 외래 핵산에 대한 방어를 위한 박테리아 시스템의 클래스를 언급한다. CRISPR/Cas 시스템은 다양한 범위의 세균 및 고세균 유기체에서 발견된다. CRISPR/Cas 시스템은 타입 I, II, III, V, 및 VI 서브타입을 포함한다. 야생형 타입 II CRISPR/Cas 시스템은 외래 핵산을 인식하고 절단하기 위해 가이드 및 활성화 RNA와의 복합체로 RNA 매개 뉴클레아제 Cas9 RNA를 이용한다.
Cas9 동족체는 액티노박테리아(Actinobacteria), 애퀴피케(Aquificae), 박테로이데테스-클로로비(Bacteroidetes-Chlorobi), 클라미디아-베루코마이크로비아(Chlamydiae-Verrucomicrobia), 클로플렉시(Chlroflexi), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 퍼미큐테스(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes), 및 써모토개(Thermotogae)의 분류학적 군의 박테리아를 포함하는, 그러나 이에 한정되지 않는 다양한 진정 세균에서 발견된다. 예시적 Cas9 폴리펩타이드는 스트렙토코커스 파이오진스 Cas9 폴리펩타이드이다. 추가적인 Cas9 단백질 및 이들의 동족체는 예를 들어 문헌 [Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737], [Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477], [Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9], [Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7] 및 [Jinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21]에 기술된다. Cas9 단백질은 뉴클레아제 결손일 수 있다. 예를 들어, Cas9 단백질은 타겟 DNA를 니킹(nick)하지만, 이중 가닥의 파괴를 유발하지는 않는 니킹 엔도뉴클레아제일 수 있다. Cas9는 또한 뉴클레아제 활성이 없는 프로그램 가능한 DNA 결합 단백질인 "데드(dead) Cas9"(dCas9)를 생성하도록 비활성화된 두 뉴클레아제 도메인을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, dCas9 DNA 결합은 본원에 기술되는 폴리펩타이드에 의해 억제된다.
발명의 요약
한 측면에서, 세포의 Cas9 폴리펩타이드를 억제하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 세포로 Cas9 억제 폴리펩타이드를 도입함으로써, 세포에서 Cas9 폴리펩타이드를 억제하는 단계를 포함하며, 여기에서 Cas9 억제 폴리펩타이드는 세포에 대해 이종성이며, Cas9 억제 폴리펩타이드는 실질적으로(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%) 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상의 서열과 동일하다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 세포에서 Cas9 억제 폴리펩타이드와 Cas9 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 세포에서 Cas9 억제 폴리펩타이드와 CRISPR-Cas9 시스템의 다른 구성요소를 접촉시켜, 간접적으로 Cas9 폴리펩타이드의 활성을 억제하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드는 서열 번호 1-170 중 하나를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 세포는 도입 전 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 Cas9 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 유도성이고, 상기 방법은 도입 전 세포를, 세포에서 Cas9 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 시약 또는 조건과 접촉시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 세포는 도입 후 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 유도성이고, 상기 방법은 도입 후 세포를, 세포에서 Cas9 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 시약 또는 조건과 접촉시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 도입은 세포 내에 존재하고 세포에 대해 이종성인 발현 카세트로부터 세포에서 Cas9 억제 폴리펩타이드를 발현시키는 것을 포함하며, 여기에서 발현 카세트는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이고, 도입은 세포와 Cas9 억제 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 시약을 접촉시키는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 도입은 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 RNA를 세포로 도입하는 것과 RNA로부터 세포에서 Cas9 억제 폴리펩타이드를 발현시키는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 도입은 Cas9 억제 폴리펩타이드를 세포로 삽입하는 것 또는 세포와 Cas9 억제 폴리펩타이드를 접촉시키는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 혈액 또는 유도 만능 줄기 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 체외에서 일어난다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 도입 및 접촉 후에 포유동물에게 도입된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 포유동물에 대해 자가이다.
Cas9 억제 폴리펩타이드를 포함하는 세포(선택적으로 단리됨)가 또한 제공되는데, 여기에서 Cas9 억제 폴리펩타이드는 세포에 대해 이종성이고, Cas9 억제 폴리펩타이드는 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상과 실질적으로 동일하다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 진핵 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다.
Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드는 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상과 실질적으로 동일하다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 이종성이다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 유도성이다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA이다.
앞서 또는 본원의 다른 곳에 기재된 발현 카세트를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
(선택적으로 단리되는) Cas9 억제 폴리펩타이드가 또한 제공된다. 몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드는 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상과 실질적으로 동일하다.
앞서 또는 본원의 다른 곳에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다.
앞서 또는 본원의 다른 곳에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 전달 비이클(vehicle)이 또한 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 전달 비이클은 리포솜 또는 나노입자이다.
다른 측면들은 본 명세서의 나머지에 기술된다.
도 1A-C: 리스테리아 모노사이토진스에서의 CRISPR-Cas9 게놈 셀프 타게팅(ST)의 개관.
도 1A: 게놈 셀프 타게팅의 원리를 도시한 개략도로서, 이동 유전자 엘리먼트(MGE)가 동일한 게놈의 CRISPR 어레이에서 스페이서에 대한 타겟 서열을 갖는다. 이 "셀프 타게팅 게놈"의 CRISPR-Cas9 기능은 계속적인 세포 생존을 위해서는 아마도 비활성이다.
도 1B: L. 모노사이토진스(L. monocytogenes) 게놈에서, cas9 연결 셀프 타게팅을 갖는 게놈의 존재도(적색) 및 ST가 없는 게놈의 존재도(회색).
도 1C: ST 이벤트의 예로서, 균주 J0161의 CRISPR 어레이의 스페이서 16은 레지던트 프로파지(ΦJ0161a)(스페이서 서열: crRNA(서열 번호 171), 프로토스페이서 및 프로토스페이서 상보서열(서열 번호 172-173))과 완벽한 PAM 및 프로토스페이서 일치를 갖는다.
도 2A-D: L. 모노사이토진스 J0161로부터의 프로파지가 2개의 CRISPR-Cas9 억제 유전자를 포함한다.
도 2A: L. 모노사이토진스 10403s의 타입 II-A CRISPR-Cas 좌위. tracrRNA 및 CRISPR 어레이를 따라, 30개의 스페이서를 포함하는 4개의 cas 유전자가 표시된다. 전사의 예측된 방향은 검은 화살표로 표시된다. 후속 실험은 비타겟 플라스미드(pNT), 및 이 균주에서 프로토스페이서와 일치하는 스페이서 1을 갖는 타겟 플라스미드(pT)를 이용한다.
도 2B: CRISPR-Cas 타겟(pT) 또는 비타겟(pNT) 플라스미드가 L. 모노사이토진스(L. monocytogenes) 10403s의 파지 큐어드(Φcure) 균주로 전기천공된(electroporate) 후의 형질전환된 콜로니의 대표도이고, 야생형(wt) J0161(ΦJ0161a 프로파지를 포함함)은 셀프 타게팅을 나타내기 위해 적색으로 도시된다. 분석된 Φcure 10403s 변이체는 cas9 결실 균주(Δcas9), ΦJ0161a의 리소겐(::ΦJ0161a), ΦJ0161a로부터의 개별적인 CRISPR-Cas9 억제제 유전자를 구성적으로 발현시키는 균주(+acrIIA1, +acrIIA2) 및 CRISPR-Cas9 억제제 유전자가 결실된 ΦJ0161a의 리소겐(::ΦJ0161aΔacrIIA1-2)을 포함한다. wt 및 Φcure 10403s의 비교를 위해 도 7을 참조한다.
도 2C: 10403s Φcure 및 wt J0161 균주를 형질전환 효율에 대해 평가하였다. 10403s Φcure cas9 결실 균주(Δcas9), 구성적으로 발현된 cas9(Δcas9+cas9) 및 이들 균주의 ΦJ0161a 리소겐(::ΦJ0161a)이 분석되었다. 오차 막대는 세 개의 생물학적 반복실험의 표준편차를 반영한다. L.D.: 검출 한계.
도 2D: L. 모노사이토진스 10403s 및 J0161로부터의 두 유사한 프로파지로부터의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 비교. ΦJ0161의 10개의 단편을 포함하는 특유의 유전자(적색)를 10403s에서 CRISPR-Cas9 억제에 대해 시험하였다. n.e.: CRISPR-Cas9 활성에 영향 없음, tox.: 발현되었을 때 독성인 단편, t.: 셀프 타겟 프로토스페이서의 위치. 둘러싸인 단편은 독립적으로 CRISPR-Cas 활성을 억제할 수 있는 두 유전자(acrAII1, acrAII2)와 함께 항 CRISPR 활성을 나타내었다. 보존된(회색) 유전자는 시험하지 않았다. 참조를 위해, 세포 용해, 캡시드(capsid) 어셈블리 및 숙주 통합(int.)에 관여하는 파지 유전자가 라벨링되었다.
도 3A-C: acrIIA 유전자의 게놈 조직화 및 출현율.
도 3A: acrIIA1(1)의 게놈 컨텍스트(context) 및 L. 모노사이토진스로부터의 이의 동족체(orfD)가 수직 정렬로 acrIIA1 동족체와 함께 카툰으로서 스케일링되어 도시된다. 전형적으로, acrIIA 유전자는 파지 리신(ply) 유전자에 인접하게 또는 가까이 프로파지에서 코딩된다. acrIIA1 및 orfD(acrIIA1-4, orfA-E)의 게놈 이웃이 도시된다. 개별 유전자(***)를 L. 모노사이토진스 10403s에서 CRISPR-Cas9 억제에 대해 검정하였다(도 9 참조). 히든 마르코프 모델(HMM) 예측 소프트웨어를 사용하여, 헬릭스-턴-헬릭스(HTH) 및 AP2 DNA 결합 모티프가 몇몇 단백질에서 검출되었다(문헌 [Soding, J., Biegert, A., and Lupas, A.N. (2005). Nucleic Acids Research, 33, W244-W248]).
도 3B: 각 acrIIA 유전자 동시 발생 빈도의 원형 그래프 표현.
도 3C: L. 모노사이토진스 판-게놈에서의 acrIIA 및 cas9 유전자의 출현율에 대한 원형 그래프 표현. 관련 등록 번호에 대해서는 보충 표 1(표 S1)을 참조한다.
도 4A: AcrIIA1-4 동족체의 계통발생 분석.
(도 4A) AcrIIA1에 대한 GenBank 내의 모든 비중복 단백질 서열을 쿼리(query)하기 위한 반복적인 psi-BLASTp 검색 후에 확인된 전장 단백질 서열의 계통발생적 재구성.
(도 4B) AcrIIA2, (도 4C) AcrIIA3, 및 도 4D AcrIIA4에 대한 유사한 트리를 구성하기 위해 BLASTp가 사용되었다(방법 참조). 선택된 부트스트래핑(bootstrapping) 지원 값은 채워진 타원(≥90%), 빈 직사각형(≥70%) 또는 점선(<70%)으로 표시된다. 박스 표시된 서열 패밀리는 항 CRISPR 기능에 대해 시험된 패밀리를 나타낸다. 다른 동족체는 트리 아래에 기재된 게놈에 존재하는 별개의 서열 패밀리를 나타낸다.
도 5A-D: 스트렙토코커스 파이오진스 dCas9 및 Cas9의 억제.
도 5A: 스트렙토코커스 파이오진스(Spy) dCas9와 염색체 적색 형광 단백질(RFP) 유전자를 타게팅하는 가이드 RNA를 갖는 E. 콜라이(E. coli) BW25113의 단세포 형광을 측정하는 실험 설정의 개략도.
도 5B: 후보(orf) 및 검증된(acrIIA) 유전자를 dCas9에 기초한 리프레션을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 얻어진 측정치는 각 후보 유전자에 대하여 가이드 RNA가 없는 대조군에 대해 정규화된 단봉형 세포집단의 단일 세포의 중간 RFP 형광 값을 반영한다. 오차 막대는 적어도 세 개의 생물학적 반복실험의 표준편차를 나타낸다. 유전자 확인 정보에 대해서는 도 2 및 도 9를 참조한다.
도 5C: 독시사이클린 유도성 eGFP 카세트를 갖는 HEK293T 세포를, 상이한 비로 5개의 코돈 최적화 파지 유전자 중 하나를 코딩하는 발현 구조물과 함께, 단일 전사체 tracrRNA/eGFP 타게팅 가이드 RNA 및 NLS-SpyCas9를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시킨 실험 설정의 개략도. eGFP 양성 세포의 백분율은 유동 세포 분석법에 의해 유도된 지 12시간 후에 측정되었다.
도 5D: eGFP 양성 세포의 평균 백분율은 생물학적 삼중 반복실험에 대해 +/- 표준편차로 도시된다. 1:1 및 3:1의 Cas9/sgRNA 플라스미드에 대한 비로, 억제제 플라스미드의 증가되는 양(ng)을 왼쪽에서 오른쪽으로 첨가하였다. 파지 ORF가 없는 것을 베이스라인으로, 형질감염에 대해 데이터를 정규화하였다.
도 6은 Cas9의 AcrIIA 억제의 카툰 도시이다.
도 7A-F: 리스테리아 모노사이토진스 J0161에서의 CRISPR-Cas9에 의한 셀프 타게팅은, 도 1과 관련하여, 기능 손실 돌연변이와 관련이 없다.
도 7A: 스트렙토코커스 파이오진스 SF370(Spy_SF370), 리스테리아 모노사이토진스 10403s(Lmo_10403s), 리스테리아 모노사이토진스 J0161(Lmo_J0161) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)(Lin_Clip11262)로부터의 타입 II-A CRISPR_cas 장소의 비교. Cas9 단백질 서열 사이의 퍼센트 동일성이 도시된다.
도 7B: 셀프 타게팅 균주 Lmo J0161의 CRISPR 어레이. CRISPRDetect 웹 유틸리티에 의해 예측되는 타입 II-A CRISPR 어레이가 도시된다(스페이서_어레이: 서열 번호 174-192, 각각; 반복_서열: 서열 번호 193). 셀프 타게팅 스페이서(넘버 16(서열 번호 189))가 박스 표시된다. 타겟 인식을 담당하는 RNA 코딩 뉴클레오타이드가 굵은 글씨로 표시된다.
도 7C: L. 모노사이토진스 J0161에 의한 셀프 타게팅을 도시하는, 변형된 CRISPRtarget 결과물. 예측된 crRNA 프로세싱 부위는 쐐기 아이콘으로 식별된다.(서열: crRNA(서열 번호 194), 타겟 RNA 및 타겟 RNA 상보서열(서열 번호 195-196)).
도 7D: tracrRNA 좌위의 정렬. (Spy_SF370(서열 번호 197); Lmo_10403s(서열 번호 198); Lmo_J0161(서열 번호 199): Lin_Clip11262(서열 번호 200)).
도 7E: CRISPR 좌위의 정렬. (Spy_SF370(서열 번호 201); Lmo_10403s(서열 번호 202); Lmo_J0161(서열 번호 203): Lin_Clip11262(서열 번호 204)).
도 7F: Cas9 단백질 서열의 정렬. 필수 화학 작용가를 가진 잔기가 박스 표시된다. (Spy_SF370(서열 번호 205); Lmo_10403s(서열 번호 206); Lmo_J0161(서열 번호 207): Lin_Clip11262(서열 번호 208)).
도 8: Φ10403s 프로파지는, 도 2A-D와 관련하여, L. 모노사이토진스 10403s에서의 플라스미드 타게팅에 영향을 미치지 않는다. 타겟(pT; pRAU31) 또는 비타겟(pNT; pRAU29) 플라스미드에 대한 형질전환 및 선별 후의 콜로니를 도시하는 대표 플레이트. 10403s의 야생형(wt) 및 비용원성(Φcure) 균주가 분석되었다. 플라스미드 및 균주 디자인 및 명명법에 관한 추가 정보를 위해 표 S1을 참조한다.
도 9: 도 2와 관련하여, L. 모노사이토진스 10403s에서의 CRISPR-Cas9 억제 활성에 대해 선별된 ΦJ0161a 프로파지의 단편. 타겟(pT; pRAU31) 또는 비타겟(pNT; pRAU29) 플라스미드에 대한 형질전환 및 선별 후의 콜로니를 도시하는 대표 플레이트. 도 2D에서 명명된 것처럼, 모든 파지 단편에 대해 DNA 서열 정보가 제공된다. 플라스미드 및 균주 디자인 및 명명법에 관한 추가 정보를 위해 표 S1을 참조한다.
도 10A-B: 도 2B 및 도 3A와 관련하여, L. 모노사이토진스 10403s에서의 CRISPR-Cas9 억제 활성에 대해 선별된 개별적인 유전자. 타겟(pT; pRAU31) 또는 비타겟(pNT; pRAU29) 플라스미드에 대한 형질전환 및 선별 후의 콜로니를 도시하는 대표 플레이트. 모든 후보 타입 II-A CRISPR-Cas 억제제에 대하여, 주어진 이름, 좌위 태그, 등록 번호 및 DNA 서열 정보가 제공된다. 플라스미드 및 균주 디자인 및 명명법에 관한 추가 정보를 위해 표 S1을 참조한다.
도 11A-B: 도 5와 관련하여, E. 콜라이의 S. 파이오진스로부터의 AcrIIA3 동족체의 독성.
도 11A: AcrIIA 단백질 발현의 존재 또는 부재 하에서의 E. 콜라이 CRISPRi 리포터 균주에 대한 단일 세포 RFP 형광 값의 분포. AcrIIA 단백질의 발현은 CRISPRi 활성의 균일한 파괴를 나타내는 집단 형광의 sgRNA(CRISPRi 넉다운 없음) 상태로의 단봉형 이동으로 이어진다. AcrIIA 억제제 발현의 존재 또는 부재 하에, CRISPRi를 유도하기 위해 IPTG의 존재 하에 균주를 2.5시간 동안 성장시켰다.
도 11B: Spy AcrIIA3의 발현은 E. 콜라이에서 독성을 나타낸다. IPTG(CRISPRi 유도) 및 아라비노스(AcrIIA3 유도)의 존재 하에, sgRNA의 존재 또는 부재 하에서 Spy AcrIIA3는 독성을 나타내며, 이는 Spy AcrIIA3의 독성이 CRISPRi 활성과는 무관하다는 것을 나타낸다.
도 12: 도 2 및 도 3과 관련한, pPL2oexL에 대한 벡터 맵 파일. L. 모노사이토진스 10403s에서의 CRISPR-Cas9 억제를 시험할 유전자 및 파지 단편을 pHyper와 FLAG 태그 사이의 pPL2oexL에 클로닝하였다. 네이티브 종결 코돈이 pPL2oexL 유도체에 포함되었다.
도 13: acrIIA1은 퍼미큐테스 동족체 전반에 매우 널리 퍼져 있으며, 동족체가 발견되는 유기체에서 Cas9 기능을 억제하는 것 같다. 항 CRISPR 기능을 갖는 acrIIA 유전자의 새로운 동족체를 확인하기 위해, 여기에 도시된 계통발생 트리로부터의 별개의 멤버를 세포 기반 검정법에서 항 CRISPR 활성에 대해 시험하였다. 공지된 항 CRISPR 유전자의 동족체는, SpyCas9에 대해 직접적인 활성을 갖는 것들을 확인하기 위해 외래 박테리아 시스템(슈도모나스 에어루기노사)에서 시험되고 있다.
도 14: 이종성 숙주(슈도모나스 에어루기노사)에서 JBD30 특이 sgRNA를 갖는 SpyCas9에 의한, 대조군 파지(D3) 또는 타겟 파지(JBD30)의 10배 희석을 도시하는 파지 플라크 검정. 표시된 항 CRISPR acrIIA4(양성 대조군) 또는 acrIIA1의 발현은 SpyCas9를 비활성화시킨다.
도 15A-B: 15A) 상이한 리스테리아(Listeria) 이동 엘리먼트에서 발견되는 acrIIA2 동족체의 다중 서열 정렬. (AcrIIA2a.1(서열 번호 69); AcrIIA2a.2(서열 번호 84); AcrIIA2b.1(서열 번호 108); AcrIIA2b.3(서열 번호 209); AcrIIA2c.1(서열 번호 97); 및 AcrIIA2c.2(서열 번호 98)). 시험된 동족체는 유색 화살표로 표시되고, 결과 요약은 정렬 아래에 도시된다. 15B) 상이한 동족체와 이의 등록 번호 사이의 서열 동일성(아미노산 수준에서)을 요약한 표.
도 16: SpyCas9 및 sgRNA 타게팅 파지 JBD30을 발현시키는 P. 에어루기노사의 론(lawn)의 상부에 스포팅된, 10배 계열 희석 파지 JBD30을 이용한 박테리오파지 플라크 검정. CRISPR 활성이 없으면 파지는 플라크를 형성할 것이다. Cas9 및 sgRNA는 왼쪽에서 오른쪽으로(0.001%, 0.01%, 0.1%) 아라비노스의 증가하는 양에 따라 유도된다. Cas9(Δcas9)가 없는 경우, 파지는 완전히 플라크를 형성하지만, Cas9가 존재하고 항 CRISPR(벡터)이 없는 경우, Cas9가 유도됨에 따라 플라크 형성이 감소된다. acrIIA4(양성 대조군)의 제공은 모든 수준에서 Cas9를 완전히 차단한다. acrIIA2b.3만이 활성에 대하여 acrIIA4와 유사하다. 원래의 acrIIA2a.1은 부분적으로만 활성이 있고, acrIIA2b.1에서 약간의 향상이 보여진다.
도 17: 스트렙토코커스(Streptococcus) 종에서 발견된 acrIIA3b의 동족체를 SpyCas9 및 sgRNA를 발현시키는 이종성 시스템(P. 에어루기노사)에서의 항 CRISPR 활성에 대해 시험하였다. 결과 요약(도 6의 데이터)은 표에 제시되는데, 이는 항 CRISPR에 대한 원래의 종, S. 파이오진스에 대한 상기 종에서의 Cas9의 서열 동일성, 및 항 CRISPR에 대한 유사한 정보를 나타낸다. acrIIA3a 및 acrIIA3b의 이전에 관찰된 독성을 감안하여, 이 새로운 단백질은 독성(독성?) 및 항 CRISPR 기능(acr?)에 대해 평가되었다.
도 18: LB 한천 플레이트에서의 박테리아 세포의 스포팅 적정. SpyCas9는 P. 에어루기노사 게놈을 타게팅하는 sgRNA로 프로그래밍되어, 세포를 죽인다. 세포는 항 CRISPR이 기능할 경우에만 살아남는다. 플레이트는 비유도(왼쪽 컬럼), ACR 유도만(중간 컬럼, ACR 독성 시험), 또는 Cas9/sgRNA/ACR 유도 플레이트(오른쪽 컬럼, ACR 기능 시험) 상에 플레이팅된, 세포의 10배 계열 희석을 보여준다. 항 CRISPR이 Cas9 기능을 차단하지 않는 경우, Cas9에 의해 절단된 게놈은 죽게 된다. 가장 오른쪽 패널의 콜로니는 ACR 활성을 나타낸다.
도 19: 실시예 2로부터의 몇몇 데이터의 요약.
Cas9 뉴클레아제의 여러 폴리펩타이드 억제제("Cas9 억제 폴리펩타이드")가 파지로부터 확인되었다. 파지로부터 처음 발견된 Cas9 억제 폴리펩타이드를 AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, 및 AcrIIA4로 명명하였다.
본원에 기술되는 Cas9 억제 폴리펩타이드는 원하지 않는 Cas9 활성을 억제하기 위해 여러 측면에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 Cas9 억제 폴리펩타이드는 게놈 편집에서 Cas9를 조절하여, Cas9 억제 폴리펩타이드의 도입 전 약간의 Cas9 활성을 허용하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이는 Cas9의 오프 타겟(off-target) 효과를 제한하는 데 도움이 될 수 있다. 이러한 용도 및 다른 용도는 아래에 상세하게 기술된다.
실시예 및 서열 목록에 기재된 바와 같이, 많은 Cas9 억제 폴리펩타이드가 발견되었다. 예시적 Cas9 억제 폴리펩타이드의 예는 서열 번호 1-169 중 어느 하나, 또는 실질적으로(예를 들어, 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 리스트된 서열 중 하나를 갖는 것 이외에, 폴리펩타이드는 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 양쪽 모두에 다른 아미노산 서열 또는 다른 화학 모이어티(예를 들어, 검출 가능한 라벨)를 포함할 것이다. 추가적 아미노산 서열은 태그, 검출 가능한 마커, 또는 핵 내 위치 확인 신호 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
실시예에 언급된 바와 같이, 많은 Cas9 억제 폴리펩타이드는 S. 파이오진스(Spy) Cas9 뿐만 아니라 L. 모노사이토진스 Cas9를 억제하는 것으로 나타났다. 본원에 기술된 Cas9 억제 폴리펩타이드는 또한 다른 블락(block) II-A Cas9 단백질을 유사하게 억제하는 것으로 여겨지고 예상된다. 본원에 사용되었듯이, "Cas9 억제 폴리펩타이드"는 형질전환 효율 검정에서 L. 모노사이토진스의 Cas9 효소의 기능을 억제하는 단백질이다. 타겟 DNA 서열 및 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 갖는 플라스미드가 손상되지 않은 Cas9 기능을 갖는 균주를 형질전환하는 데 사용되는 경우, 형질전환 이벤트는 Cas9에 의해 방지되어, 선별 하에 미미한 콜로니를 생성한다. 이는 L. 모노사이토진스의 형질전환에 사용되었을 때 정상 크기의 콜로니를 생성하는, 비타겟 DNA 서열을 갖는 플라스미드와 비교된다. Cas9 억제제의 발현은 Cas9 활성을 중화시키고, 타겟 및 비타겟 플라스미드 모두의 형질전환된, 정상 크기의 콜로니를 유도한다. Cas9 억제 폴리펩타이드의 억제 활성이 다른 방법으로 측정될 수 있다고 여겨지지만, 실시예에 자세히 제시되는 상기 검정은, Cas9 억제 폴리펩타이드가 활성을 갖는지 여부를 결정하는 검정이다.
Cas9 억제 폴리펩타이드는 임의의 세포에 도입되어 그 세포에서 Cas9를 억제할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 Cas9 억제 폴리펩타이드가 세포에 도입되는 경우 Cas9 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드가 세포에 도입되고 그 후 Cas9 폴리펩타이드가 세포에 도입된다.
세포로의 Cas9 억제 폴리펩타이드의 도입은 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드 그 자체가 세포로 도입된다. 세포로 폴리펩타이드를 도입하기 위한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 전기천공법(electroporation), 또는 세포로의 리포솜 또는 나노입자 전달이 이용될 수 있다. 다른 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 세포로 도입되고 그 후 Cas9 억제 폴리펩타이드가 세포에서 발현된다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다.
몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드는 발현 카세트에 의해 코딩된 RNA로부터의 세포에서 발현되며, 여기에서 발현 카세트는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 이종성이다. 프로모터의 선택은 이것이 발현될 세포 및 원하는 발현 패턴에 의존한다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현이 선택된 조건 하에서 발현될 수 있도록, 프로모터는 유도성 또는 억제성이다. 몇몇 실시예에서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현이 활성화되거나 또는 증가할 수 있도록, 프로모터는 유도성 프로모터이다.
유도성 프로모터는 특정 분자, 예컨대 독시사이클린, 테트라사이클린, 금속 이온, 알콜, 또는 스테로이드 화합물의 존재 또는 부재에 의해 활성화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 유도성 프로모터는 환경 조건, 예컨대 빛 또는 온도에 의해 활성화되는 프로모터이다. 추가 실시예에서, 프로모터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현이 낮거나 검출될 수 없는 수준으로 감소되거나 또는 제거될 수 있도록, 억제성 프로모터이다. 억제성 프로모터는 리프레서(repressor) 분자의 직접 결합(예컨대 트립토판의 존재 하에 trp 리프레서와 trp 오퍼레이터(operator)의 결합)에 의해 억제될 수 있다. 특정 실시예에서, 억제성 프로모터는 테트라사이클린 억제성 프로모터이다. 다른 실시예에서, 억제성 프로모터는 환경 조건, 예컨대 저산소 또는 금속 이온에 노출에 의해 억제성을 갖는 프로모터이다.
몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 발현 카세트의 일부로서)는 벡터에 의해 세포로 전달된다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 예시적 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 및 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드 또는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 세포 전달 시스템의 일부로서 또는 그 안에서 전달된다. 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 리포솜 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 또는 수용체-매개 전달과 같이, 본 발명의 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다.
예시적 리포솜 전달 방법은 문헌 [Metselaar et al., Mini Rev. Med. Chem. 2(4):319-29 (2002)], [O'Hagen et al., Expert Rev. Vaccines 2(2):269-83 (2003)], [O'Hagan, Curr. Drug Targets Infjct. Disord. 1(3):273-86 (2001)], [Zho et al., Biosci Rep. 22(2):355-69 (2002)], [Chikh et al., Biosci Rep. 22(2):339-53 (2002)], [Bungener et al., Biosci. Rep. 22(2):323-38 (2002)], [Park, Biosci Rep. 22(2):267-81 (2002)], [Ulrich, Biosci. Rep. 22(2):129-50], [Lofthouse, Adv. Drug Deliv. Rev. 54(6):863-70 (2002)], [Zhou et al., J. Inmunmunother. 25(4):289-303 (2002)], [Singh et al., Pharm Res. 19(6):715-28 (2002)], [Wong et al., Curr. Med. Chem. 8(9):1123-36 (2001)], 및 [Zhou et al., Immunonmethods (3):229-35 (1994)]에 기술된다.
금, 산화철, 티타늄, 하이드로겔, 및 인산칼슘 나노입자 전달 방법을 포함하는, 예시적 나노입자 전달 방법은, 문헌 [Wagner and Bhaduri, Tissue Engineering 18(1): 1-14 (2012)(무기 나노입자를 기술함)], [Ding et al., Mol Ther e-pub (2014)(금 나노입자를 기술함)], [Zhang et al., Langmuir 30(3):839-45 (2014)(이산화티타늄 나노입자를 기술함)], [Xie et al., Curr Pharm Biotechnol 14(10):918-25 (2014)(생분해성 인산칼슘 나노입자를 기술함)], 및 [Sizovs et al., J Am Chem Soc 136(1):234-40 (2014)]에 기술된다.
원핵 세포로의 본원에 기술된 Cas9 억제 폴리펩타이드의 도입은 단백질 또는 핵산을 원핵생물에 도입하는 데 사용되는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 전달 벡터(예를 들어, 박테리오파지)에 의해 원핵 세포로 전달된다. 몇몇 실시양태에서, 원핵생물의 Cas9를 억제하는 것은 파지가 박테리아를 죽이는 것을 돕거나 다른 파지가 박테리아를 죽이는 것을 도울 수 있다.
본원에 기술된 Cas9 억제 폴리펩타이드는 Cas9를 포함하거나, 발현시키거나, 또는 발현시킬 것이라 예상되는 임의의 세포로 도입될 수 있다. 예시적 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적 원핵 세포는 생물공학적 목적, 원하는 대사물, E. 콜라이 및 인간 병원체의 생산을 위해 사용되는 원핵 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 원핵 세포의 예는 예를 들어, 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 sp.(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움 sp.(Corynebacterium sp.), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코커스 아우레스(Staphylococcus aureus), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 엔테로코커스 sp.(Enterococcus sp.), 리스테리아 모노사이토진스, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 스트렙토코커스 sp.(Streptococcus sp.), 또는 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)를 포함할 수 있다. 예시적 진핵 세포는 예를 들어, 동물(예를 들어, 포유동물) 세포 또는 식물 세포를 포함할 수 있다. 예시적 포유동물 세포는 인간, 비인간 영장류, 마우스(mouse), 및 래트(rat) 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 세포는 배양 세포 또는 일차 세포일 수 있다. 예시적 세포 타입은 유도 만능 세포, 줄기 세포 또는 전구 세포, 및 T-세포 또는 B-세포를 포함하는(그러나 이에 한정되지 않는) 혈구를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 세포는 동물(예를 들어, 선택적으로 유전자 수복이 필요한 인간)로부터 제거되고, 그 후 유전자 편집을 위해 Cas9, 및 선택적으로 가이드 RNA가 체외에서 세포로 도입되고, Cas9 억제 폴리펩타이드가 세포로 도입된다. 몇몇 실시양태에서, 세포(들)는 그 후 동일한 동물(자가) 또는 상이한 동물(동종)에 도입된다.
본원에 기술된 임의의 실시양태에서, Cas9 폴리펩타이드는 세포로 도입되어, Cas9 DNA의 결합 및/또는 절단(및 선택적으로 편집)을 가능하게 한 후, 본원에 기재된 것과 같은 Cas9 억제 폴리펩타이드를 도입한다. 따라서 세포에서의 활성 Cas9의 존재의 이러한 타이밍은, 후속적으로 세포에 Cas9 억제 폴리펩타이드를 공급하여 Cas9를 비활성화시킴으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 이는 비타겟 염색체 서열이 결합되거나 변경되도록 하는 Cas9 "오프 타겟" 효과를 감소시키는 데 유용할 수 있다. Cas9 억제 폴리펩타이드를 도입할 때 종료되는 제한된 "버스트(burst)"로 Cas9 활성을 제한함으로써, 오프 타겟 효과를 제한할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Cas9 폴리펩타이드 및 Cas9 억제 폴리펩타이드는 상이한 유도제에 의해 조절되는, 상이한 유도성 프로모터로부터 발현된다. 상기 실시양태는 먼저 Cas9 폴리펩타이드의 발현을 개시하도록 한 후, 선택적으로 Cas9 발현 유도제를 제거하면서, 나중에 Cas9 억제 폴리펩타이드를 유도한다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 Cas9 억제 폴리펩타이드는 동물(예를 들어, 인간) 또는 식물에 도입(예를 들어, 투여)될 수 있다. 이는 예를 들어, CRISPR/Cas9 유전자 편집이 체내에서 수행되거나, 또는 개체가 원하지 않는 Cas9에 노출되는 상황, 예를 들어 Cas9를 포함하는 생물 무기가 방출되는 경우, 체내에서 Cas9 활성을 제어하는 데 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, Cas9 억제 폴리펩타이드 또는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 약학적 조성물로서 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물은, Cas9 억제 폴리펩타이드 또는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 리포솜, 나노입자 또는, 본원에 기술되거나 공지된 다른 전달 비이클과 같은 전달 시스템을 포함한다. 상기 조성물은 예를 들어, 주사(예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 또는 피내), 흡입, 경피 투여, 직장 투여, 또는 경구 투여를 포함하는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 경로를 사용하여 포유동물(예를 들어, 인간)에 직접 투여되어 Cas9를 억제할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는, 부분적으로, 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물의 다양한 적합한 제제가 존재한다(예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989] 참조).
실시예
실시예 1
결과
리스테리아 모노사이토진스에서의 CRISPR-Cas9는 외래 DNA를 타게팅한다
리스테리아 모노사이토진스는 잘 특징지어진 파지 개체군을 가진 조건적 세포 내 식품 매개 병원균이다. 많은 L. 모노사이토진스 분리 균주는 타입 II-A CRISPR-Cas 시스템을 가지며(문헌 [Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065]), 시스템의 CRISPR 스페이서는 많은 독성 파지, 약독 파지, 및 통합된 파지에 대한 동일성을 갖는다(문헌 [Di, H. et al. (2014) Biochem Biophys Res Commun, 454, 399-403] 및 [Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065]). 그러나, 정규적 CRISPR-Cas 기능에 대한 실험적 증거가 없다. 본 발명자는 L. 모노사이토진스의 275개의 게놈을 분석했고, 게놈의 15%(n=41)에서 타입 II-A CRISPR-Cas 시스템(Lmo Cas9)을 확인했다(도 1B). 흥미롭게도, CRISPR 반복, PAM, tracrRNA, Cas9, 및 연관 프로모터가 명백한 비활성화 돌연변이가 없어서 CRISPR-Cas9가 기능할 것이라 예상됨에도 불구하고(도 6A-E), 본 발명자는 셀프 타게팅의 예(도 1B 및 1C)를 갖는 8개의 게놈(전체의 3%)을 확인했다. 본 발명자는 이러한 균주가 스페이서-프로토스페이서 쌍의 안정한 공존을 가능하게 하는 CRISPR-Cas9의 억제제를 갖는다고 예측했다.
억제제가 L. 모노사이토진스의 프로파지에 의해 코딩되는지 시험하기 위해, 본 발명자는 우선 셀프 타게팅을 나타내지 않는 L. 모노사이토진스 균주(10403s)의 억제되지 않은 CRISPR-Cas9의 기능을 확립했다. 이 시스템의 활성을 시험하기 위해, 본 발명자는 Cas9 결합에 필요한 3염기 모티프(도 2A)인 동족 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)와 함께 타겟 프로토스페이서(즉 CRISPR 어레이의 자연 스페이서에 대해 상보적인 서열)를 갖는 플라스미드(pT)를 디자인하였다. 본 발명자는 pT 또는 동일한 플라스미드 백본을 갖는 비타겟 서열을 보유한 대조군 플라스미드(pNT)로 10403s의 형질전환 효율을 측정하였다. 다운스트림 분석을 단순화하기 위해, 모든 다운스트림 실험에 대해 10403s의 프로파지 큐어드 버전(Φcure)이 사용되었는데, 이 검정에서 wt10403s와 구별할 수 없었기 때문이다(도 7). 연장된 인큐베이션 시 나타난 콜로니의 수는 같았지만(도 2C, 추가 분석을 위해 고찰 참조), pT로의 형질전환은 pNT에 비해 미미한 콜로니를 형성시켰다(도 2B, 가장 왼쪽 패널). 이 표현형이 CRISPR-Cas9 간섭의 결과였는지 확인하기 위해, 본 발명자는 cas9 결실 균주를 제작했다. pT 및 pNT에 의한 균주의 형질전환은 구별할 수 없는 크기의 콜로니를 생성하였다(도 2B 2번째 왼쪽 패널). 그러나, 구성적으로 활성인 프로모터 하에서 L. 모노사이토진스 염색체에 다시 cas9를 부가하면 pT에 의한 형질전환이 완전히 억제되었다(도 2C). 종합하여, 이 실험들은 Cas9가 내인성 및 과발현 수준 모두에서 L. 모노사이토진스 균주 10403s에서 기능적이며, 프로토스페이서를 갖는 플라스미드에 의한 형질전환을 제한한다는 것을 입증한다.
레지던트 프로파지는 L. 모노사이토진스에서 CRISPR-Cas9를 비활성화시킨다
CRISPR-Cas9가 셀프 타게팅 스페이서를 갖는 균주에서 무력화될 수 있는지 결정하기 위해, 본 발명자는 동일한 게놈에서 스페이서 16이 프로파지(ΦJ0161a)와 완벽하게 일치하는 L. 모노사이토진스 균주 J0161에서 면역 기능을 조사하였다(도 1C). 본 발명자는 J0161에서 어떠한 명백히 유해한 CRISPR-Cas 돌연변이도 검출할 수 없었는데, 이는 이러한 셀프 타게팅 시나리오가 억제의 결과이며 기능 상실이 아니라는 것을 암시한다(도 6B-F). J0161의 타입 II-A CRISPR 어레이는 10403s의 그것과 구별되기 때문에, J0161에서 CRISPR-Cas9의 기능을 시험하기 위해 J0161 특이 타겟 플라스미드(pTJ0161)가 사용되었다. 셀프 타게팅에 의해 암시된 비활성화와 일관되게, pTJ0161과 pNT를 구별할 수 있는 형질전환 효율 또는 콜로니 크기에서 유의한 차이가 없었다(도 2B 및 2C, 가장 오른쪽 패널). 따라서, 본 발명자는 J0161 게놈이 Cas9 억제제를 코딩할 수 있다고 추론했다.
J0161에서의 CRISPR-Cas9 비활성화에 대한 유전적 기초를 찾기 위해, 본 발명자는 억제제 유전자의 가능한 출처로서의 프로파지 ΦJ0161a에 집중했는데, 이것이 균주에 셀프 타겟 서열을 포함하기 때문이다. ΦJ0161a가 억제제를 포함하는지 결정하기 위해, 10403s의 프로파지 큐어드 균주를 ΦJ0161a로 용원화하고 플라스미드 형질전환에 의한 CRISPR-Cas9 기능성을 검정하였다. Φcure 10403s 균주가 pT를 타게팅하지만, ΦJ0161a의 획득은 CRISPR-Cas9 기능을 비활성화하기에 충분하며(도 2B, 왼쪽으로부터 세 번째 패널 및 도 2C, 왼쪽으로부터 네 번째), 이는 이 프로파지가 CRISPR-Cas9의 억제제를 코딩한다는 것을 암시한다. 또한 ΦJ0161a 프로파지는 cas9를 구성적으로 발현시키는 균주에서 플라스미드 타게팅을 비활성화시켰는데, 이는 cas9 프로모터의 자연 조절을 붕괴시킴으로써 억제 메커니즘이 작동하지 않는다는 것을 암시한다(도 2C, 왼쪽으로부터 다섯 번째).
ΦJ0161a가 CRISPR-Cas9 기능을 억제하고 내인성 프로파지 Φ10403s가 그러지 않는다는 것을 감안하여, 본 발명자는 차이의 영역을 확인하기 위해 이 두 밀접하게 관련된 파지의 게놈을 비교하였다(도 2D). >40% 단백질 서열 동일성을 갖는 39개의 코어 파지 유전자를 공유하는 것 외에도, 10개의 중첩되지 않는 특유의 유전자 클러스터가 확인되었다(클러스터 경계는 클러스터당 1개 내지 12개의 유전자를 갖는 예측된 오페론 구조에 기반하여 선택되었다). 각 클러스터는 프로파지 큐어드 10403s의 게놈에 클로닝 및 통합되었으며, CRISPR-Cas9 기능에 대해 검정되었다. 열 개의 단편 중 7개가 L. 모노사이토진스로 성공적으로 도입되었지만, 3개의 단편은 L. 모노사이토진스 게놈에 삽입될 수 없었는데, 단리될 때 독성이 있었을 것으로 추정된다. 플라스미드 형질전환 검정은 ΦJ0161a 단편 1이 CRISPR-Cas9를 억제할 수 있는 유일한 단편임을 보여주었으며, 이는 이 단편이 적어도 하나의 CRISPR-Cas9 억제제를 코딩한다는 것을 나타낸다(도 2D, 도 8). 이 네 유전자 단편으로부터 개별 유전자를 발현시켜 두 개의 항 CRISPR 유전자, LMOG_03146 및 LMOG_03147(각각 본원에서 acrIIA1 및 acrIIA2로 언급됨; 도 2B 및 2D)을 최종적으로 확인하였다. 10403s::ΦJ0161a 리소겐으로부터 acrIIA1 및 acrIIA2 모두를 결실시키면 CRISPR-Cas9 기능이 회복되었는데, 이는 이것이 ΦJ0161a의 유일한 항 CRISPR 유전자임을 입증한다(도 2B).
항 CRISPR 좌위는 L. 모노사이토진스에 널리 퍼져있다
추가 타입 II-A 항 CRISPR을 확인하기 위해, 관련된 L. 모노사이토진스 프로파지에서 acrIIA1 및 acrIIA2의 것과 유사한 게놈 위치를 조사하였다. 고도로 보존된 유전자 순서의 작은 오페론(2개 내지 5개의 유전자) 내에 acrIIA1을 함유하는 반복적 항 CRISPR(acr) 좌위가 왼쪽 통합 부위와 세포 용해에 관여하는 유전자 사이에서 확인되었다(도 3A). 본 발명자는 acr 좌위에 보존된 5개의 새로운 단백질 패밀리를 확인하였다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자는 10403s 게놈에 대표를 클로닝 및 통합하고, pT 및 pNT의 형질전환 효율을 검정하였다. 2개의 새로운 유전자는 CRISPR 비활성화가 가능한 것으로 확인되었지만(acrIIA3 및 acrIIA4), 나머지 3개(orfC, D, E)는 그렇지 않았다(도 3A, 도 9).
L. 모노사이토진스에서의 CRISPR-Cas9 비활성화가 만연하는지를 결정하기 위해, 본 발명자는 다음으로 각 항 CRISPR에 대해 보존 패턴을 분석하였다. 각 acrIIA 유전자는 별개로 CRISPR-Cas9를 비활성화시키기에 충분했지만, 본 발명자는 대부분의 acr 좌위에서 acrIIA1이 공통적으로 존재함을 관찰하였다. acrIIA2-4의 거의 모든 경우(91%)가 헬릭스-턴-헬릭스(HTH) 모티프 함유 acrIIA1의 업스트림에서 발견되었으며, 이는 이 유전자가 acr 좌위에 대한 마커(marker)일 수 있음을 암시한다(도 3B). 본 발명자가 119 acr 좌위에서 관찰한 가장 일반적인 시나리오는 acr 좌위의 66%에 해당하는 acrIIA1-2 또는 acrIIA1-2-3이었다. 전체적으로, acrIIA 유전자는 L. 모노사이토진스 게놈의 25%에서 확인되었으며, L. 모노사이토진스 cas9 함유 균주의 약 50%가 동일한 게놈에서 적어도 하나의 항 CRISPR을 갖는다(도 3C). 다중 acrIIA-코딩 프로파지를 갖는 L. 모노사이토진스 게놈의 많은 사례도 또한 확인되었다(보충 표 1(표 S1)). 또한, 적어도 하나의 acrIIA 유전자는 초기에 확인된 셀프 타게팅의 모든 8가지 사례의 게놈에서 발견되었으며(도 1B, 보충 표 1), 이는 이들 시나리오가 얼마나 안정적인지 설명한다. 종합하면, 이 데이터는 L. 모노사이토진스에서 CRISPR-Cas9의 광범위한 프로파지 매개 비활성화를 암시한다.
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이전의 HTH 함유 항 CRISPR 연관(aca) 유전자는, 이 aca 유전자가 항 CRISPR 활성 자체를 갖지 않았음에도 불구하고, 새로운 타입 I 항 CRISPR 유전자를 확인하기 위한 마커로서 사용되었다(문헌 [Pawluk, A. et al. (2016). Nature Microbiology, 1, 1-6]). 본 발명자는 acrIIA1이 그러한 마커의 역할을 수행할 수 있다고 가정하였다. acrIIA1의 종합적 계통발생 분석이 수행되어, 이동 엘리먼트 및 코어 게놈 모두에서, 퍼미큐테스 전반에 걸쳐 광범위하게 검출된 동족체를 밝혔다(도 4A). 먼 관계에 있는 acrIIA1 동족체 패밀리가 리스테리아 게놈에서 확인되었고, acr 좌위 멤버로서 독립적으로 확인된 HTH 함유 유전자인 orfD에 의해 예시된다(도 3A). 이 유전자는 기능 검정에서 항 CRISPR 활성이 없었지만, 플라스미드 pLMIV에서 acrIIA4와 이것의 동시발생은 넓은 acrIIA1/orfD 수퍼패밀리(superfamily)가 새로운 acr 유전자를 확인하기 위한 마커로서 사용될 수 있다는 것을 암시한다(도 3A). 이러한 시스템에서 HTH 함유 유전자가 새로운 항 CRISPR 발견을 위한 효과적인 마커로서 역할을 할지 결정하기 위해서, 후속 연구가 필요할 것이다.
acrIIA2-4의 상동성 랜드스케이프를 결정하기 위해, 유사한 계통발생 분석이 수행되었다. 퍼미큐테스 코어 게놈 전반에 걸쳐 널리 퍼진 acrIIA1과는 다르게, 이 3가지 다른 acr 유전자는 주로 리스테리아의 프로파지로 국한되었다. 리스테리아 시포파지(긴 테일을 갖는, 비수축성 파지 패밀리)에서만 발견되는 3개의 별개의 acrIIA2의 서열 패밀리가 확인된 한편(도 4B), 2개의 acrIIA3 패밀리가 시포파지(siphophage) 리스테리아 및 스트렙토코커스의 게놈에서 관찰되었다(도 4C). 마지막으로, acrIIA4는 2개의 별개의 서열 패밀리에서 관찰되었는데, 하나는 리스테리아 시포파지 및 플라스미드에서, 그리고 다른 하나는 절대 독성 미오파지(긴 비수축성 테일을 갖는 파지)의 그룹에서 관찰되었다(도 4D). acrIIA2 및 acrIIA3은 거의 항상 acrIIA1과 함께 발견되었지만, acrIIA4는 리스테리아의 파지 및 이동 엘리먼트에서 acrIIA1 동족체가 없는 경우에 종종 발생했다. 예를 들어, 독성 파지의 acrIIA4의 패밀리는 예측된 단백질에서 ~70개 아미노산의 C-말단 연장부를 가지고 HTH 함유 유전자 acrIIA1 또는 orfD와 함께 발생하지 않는다는 점에서 독특하며, 이는 이러한 acrIIA4 패밀리 간의 잠재적인 역학적 및 진화론적 차이를 암시한다. 종합하면, 이러한 분석들은 특이성 결정요인에 대해 상동성 acr 유전자를 조사하기 위한 충분한 서열 공간을 밝히고, L. 모노사이토진스에서 cas9와 이동 엘리먼트 사이의 적극적인 군비 경쟁(arms race)을 시사한다.
AcrIIA2, AcrIIA3, 및 AcrIIA4는 S. 파이오진스 Cas9를 억제한다
Lmo Cas9 AcrIIA 단백질의 다능성을 확인하기 위해, 본 발명자는 이러한 억제제가 S. 파이오진스(Spy, Lmo Cas9와 53%의 동일성)로부터의 관련된 Cas9 단백질에서 기능하는지 알아보았다. 이 오르토로그는 프로그래밍 가능한 유전자 억제를 위한 촉매 비활성화 돌연변이(dCas9)에 의한 프로그래밍 가능한 유전자 억제 뿐만 아니라(문헌 [Gilbert, L.A. et al. (2013). Cell 154, 442-451], [Qi, L.S. et al. (2013). Cell, 152, 1173-1183]), RNA 가이드 뉴클레아제와 같은 생물공학 응용분야에 널리 사용되어 왔다(문헌 [Barrangou, R., and Doudna, J.A. (2016), Nature Biotechnology, 34, 933-941]). Spy dCas9를 갖는 E. 콜라이 균주를 사용하여, 본 발명자는 AcrIIA 단백질이 dCas9가 염색체 RFP 리포터 유전자의 전사를 방해하는 것을 차단하는지 시험했다(도 5A). 억제제가 없는 유전적 배경에서, sgRNA 및 dCas9의 존재는, 가이드 RNA가 없는 균주에 비해, RPF 형광을 2.6%로 감소시켰다. 가이드가 없는 대조군의 85%의 형광으로 acrIIA4가 거의 완벽하게 dCas9를 차단하는 반면, 형광을 25%로 상승시키면서 acrIIA2는 dCas9 기능을 부분적으로 차단하였다(도 5B). 단백질이 E. 콜라이에 대해 독성이기 때문에, 본 발명자는 acrIIA3으로부터 의미있는 데이터를 얻을 수 없었다. 이는 유동 세포 분석법 동안 기록된 세포 카운트를 낮추었으며(도 10a 참조), 형광 측정치의 큰 가변성을 초래했다. Lmo_acrIIA3과의 45%의 서열 동일성을 갖는 S. 파이오진스로부터의 AcrIIA3의 동족체(등록 번호: AND04610.1) 또한 시험되었지만, E. 콜라이의 증식이 나빠졌다(도 10b). acrIIA3 독성의 메커니즘은 아직 밝혀지지 않은 채로 남아있다. 본 발명자는 acrIIA2 및 acrIIA4가 E. 콜라이에서 Spy dCas9를 상이한 정도로 억제한다고 결론지었다.
진핵 세포에서의 Spy Cas9의 공통된 적용을 고려할 때, 본 발명자는 다음으로 인간 세포에서 유전자 편집을 차단하는 AcrIIA 단백질의 능력에 대해 시험하였다. 유도성 eGFP 리포터 유전자를 갖는 HEK293T 세포를, 인간 코돈 최적화 AcrIIA 단백질을 발현시키는 벡터의 존재 또는 부재 하에, Spy Cas9 및 sgRNA 타게팅 eGFP 모두를 발현시키는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 유전자 편집을 36시간 동안 진행시킨 후, eGFP를 12시간 동안 유도하고, 그 후 세포 형광을 유동 세포 분석법으로 측정하였다(도 5C). Cas9 및 eGFP sgRNA의 존재 하에, acrIIA2 또는 acrIIA4의 동시 발현은 Cas9 기반 유전자 편집을 방해하였지만, 유전자 편집은 GFP 양성 세포의 수를 25% 감소시켰다(도 5D). 본 발명자는 추가로 이 검정에서 acrIIA3의 S. 파이오진스 동족체를 시험하였는데, 이는 인간 세포에서는 독성이 없었지만, Cas9 기능에 영향을 미치지 않았다. acrIIA1은 인간 세포에서 비기능적이었고, L. 모노사이토진스에서 항 CRISPR 활성을 갖지 않는 음성 대조군인 orfA도 마찬가지였다. E. 콜라이에서의 dCas9 실험과 함께 종합하면, 이들 데이터는 이종성 숙주에서 오르토로그 Cas9의 기능을 억제하는 AcrIIA2 및 AcrIIA4 단백질의 유용성을 입증한다. 따라서, 이러한 시약은 CRISPR-Cas9 게놈 엔지니어링 툴키트(toolkit)에 새로운 툴을 제공한다.
고찰
박테리아 면역 시스템의 파지 코딩 억제제는 이러한 두 개체 사이의 진화적 군비 경쟁에서의 강력한 선택적 압력 때문에 나타난다(문헌 [Samson, J.E. et al. (2013). Nat Rev Micro, 11, 675-687]). 타입 I CRISPR-Cas 시스템에서의 파지 코딩 항 CRISPR의 처음 확인은 더 많은 CRISPR 억제제가 존재한다는 것을 암시했지만, 이를 발견할 방법이 부족했다. 여기에서, 본 발명자는 CRISPR-Cas 억제제 유전자(도 1A)에 대한 게놈 마커로서 "셀프 타게팅"을 사용하는 생물정보학 전략을 제시한다. 이러한 접근은 셀프 타게팅을 갖는 모든 게놈(도 3C)을 포함하여, 모든 Cas9 코딩 L. 모노사이토진스 게놈의 절반에 집단적으로 존재하는 4가지 상이한 유형의 타입 II-A CRISPR-Cas9 억제제(도 3A)의 확인으로 이어졌다. 셀프 타게팅의 허용오차를 위한 별개의 메커니즘이 타입 III 시스템에 대해 기술되었지만(문헌 [Goldberg, G.W. et al. (2014). Nature 514, 633-637], [Samai, P. et al. (2015). Cell, 161, 1164-1174]), 본 발명자는 이러한 접근이 다른 CRISPR-Cas 시스템의 acr 유전자를 확인하는 데 도움이 될 것이라 예상한다.
AcrIIA 단백질의 확인을 용이하게 하기 위해, 본 발명자는 우선 L. 모노사이토진스의 기능적 CRISPR-Cas9 시스템을 입증하였다(도 2B). 이 유기체의 CRISPR-Cas에 대한 이전 연구는 타입 I-B 시스템 및 cas 유전자가 없는 연관된 I-B 유래 CRISPR 오르판(orphan) 어레이에 초점을 두었다(문헌 [Mandin, P. et al. (2007). Nucleic Acids Research, 35, 962-974], [Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065]). 이전에 어느 시스템에 대해서도 정규 CRISPR-Cas 기능이 확립되지 않았지만, 오르판 어레이는 비코딩 RNA를 생성하기 위해 숙주 리보뉴클레아제에 의해 처리되는 것으로 나타났다(문헌 [Mandin, P. et al. (2007). Nucleic Acids Research, 35, 962-974], [Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065]). II-A CRISPR-Cas 시스템의 기능을 관찰하기 위해, 본 발명자는 표준 형질전환 효율 검정을 사용하였고, 이는 균주 10403s에서의 Cas9 기능이 서열 특이 방식으로 플라스미드의 형질전환을 제한하기에 충분하다는 것을 보여주었다(도 2A-C). pT에 의한 10403s의 형질전환 동안 관찰된 작은 콜로니 표현형을 고려할 때, 본 발명자는 cas9 발현의 내인성 수준이 플라스미드를 완전히 제거하기에 충분하지 않아서, 작은 콜로니로 플라스미드를 유지할 수 있다고 추측하였다. 이를 확인하면서, 이 검정에서 cas9의 증가된 발현이 형질전환체를 완전히 제거하였다(도 2C). ΦJ0161이 이 과발현된 CRISPR-Cas9 시스템을 억제할 수 있다는 것을 고려할 때, 본 발명자는 확인된 억제제가 내인성 및 과발현된 Cas9 기능 모두를 차단할 수 있다고 결론지었다.
후보 항 CRISPR 유전자를 확인하기 위해, CRISPR 활성 균주 10403s부터 균주 J0161 균주로부터 CRISPR을 억제하는 프로파지까지 관련된 프로파지를 비교하였고, 제거 클로닝 접근 방법을 이용했다(도 2D). 2개의 단리된 acr 유전자의 동정이 ΦJ0161에 존재하는 acrIIA1 및 acrIIA2 유전자에 대해 확인되었다. 더 많은 항 CRISPR을 찾는 데 있어서, 단백질 자체 사이의 서열 보존이 없음에도 불구하고, 본 발명자는 관련 파지에 보존된 게놈 포지셔닝이 별개의 타입 II-A Cas9 억제제 단백질의 확인을 위한 좋은 대용물이라는 것을 발견하였다(도 3A). 이는 이전의 타입 I-F 및 I-E 항 CRISPR의 연구에서 관찰되었다(문헌 [Bondy-Denomy et al. (2013). Nature , 493, 429-432], [Pawluk, A. et al. (2014). mBio 5, e00896]). L. 모노사이토진스에서, 프로파지에 Cas9 억제제가 많이 출현하는 것은 CRISPR-Cas9 기능의 광범위한 비활성화를 암시한다(도 3C). 현재, 본 발명자는 다른 항 CRISPR과 함께 acrIIA1의 공통적인 동시 발생을 설명하기 위한 역학적 연계가 있는지에 대해 이해하지 못한다(도 3A 및 3B). 이 유전자가 플라스미드 챌린지 검정에서 CRISPR-Cas9 기능을 비활성화하기에 충분하지만, 본 발명자는 감염 또는 용원 중에 이것이 다른 acrIIA 유전자의 보조인자 또는 조절제로서 작용하여, 관찰된 게놈 연관성을 설명할 수 있다고 추측한다. AcrIIA1이, 사실상, 이러한 점에 있어 이중 기능성 단백질인지, 그리고 더 광범위하게는, 수퍼패밀리가 acr 유전자의 마커인지 이해하기 위해, 후속 연구가 필요할 것이다.
계통발생 분석은 리스테리아 이동 엘리먼트의 이동 엘리먼트에서 acrIIA2-4의 공통 발생을 입증한다(도 4). 이는 아마도 Cas9 기반 타게팅 및 적응을 차단함으로써 이 유기체에서 수평 유전자 전달을 용이하게 할 것이다(문헌 [Heler, R. et al. (2015) Nature 519, 199-202]). 이 acrIIA 유전자가 처음 동정된 프로파지의 패밀리 외에도, 먼 시포파지, 미오파지 및 플라스미드에서 동족체가 또한 발견되었다. 특히, 독성 미오파지에 의해 코딩된 acrIIA4 동족체는 주변에 acrIIA1 수퍼패밀리 동족체를 갖지 않았다. 또한, 리스테리아 이외의 속(genus)에서 acrIIA1 및 acrIIA3 동족체의 존재는 CRISPR-Cas9 비활성화가 퍼미큐테스에서 아주 흔한 것일 수 있음을 입증한다.
CRISPR-Cas9 기능을 비활성화하기 위해, 많은 메커니즘들이 이론적으로 가능하다. 조작된 엘리먼트(즉 cas9 프로모터, sgRNA 디자인 및 프로모터)를 갖는 이종성 숙주에서 acrIIA2 및 acrIIA4의 효능을 입증함으로써, 본 발명자는 전사 억제는 아닐 것 같다고 결론지었다. 타입 I 항 CRISPR은 간섭에 필요한 Cas 단백질에 직접 결합하고 DNA 결합 또는 DNA 절단을 방지함으로써 기능한다(문헌 [Bondy-Denomy, J et al. (2015). Nature, 526, 136-139]). 더 나아가, 인간 세포에서 기능하는 능력을 고려하여, 본 발명자는 acrIIA2 및 acrIIA4에 대해 유사한 메커니즘을 예상한다. dCas9 기반 검정과 비교하여 인간 세포에서 절단 기반 Cas9 분석에서 acrIIA2의 향상된 효능은, Cas9 기능의 완전한 비활성화로서 나타나는 절단 억제와 함께, 이것이 어느 정도 결합 및 절단을 모두 억제할 수 있음을 암시한다. AcrIIA4의 경우, DNA 결합이 Cas9와의 직접적인 상호작용을 통한 것인지 여부가 남아있지만, DNA 결합은 분명히 억제된다.
타입 II-A 억제제의 확인 및 향후 역학적인 해부는 자연적 및 조작된 세팅에서 정규적 CRISPR-Cas9 기능을 연구하기 위한 가치있는 새로운 시약을 제공할 것이다. E. 콜라이 및 인간 세포에서 Spy Cas9를 차단하는 AcrIIA 단백질의 능력은 이러한 단백질이 Cas9에 대해 번역 후의 "오프 스위치(off-switch)"를 제공할 수 있다는 것을 암시한다. 이것은 게놈 공학을 제어하기 위해 진핵생물 시스템에 적용될 수 있는 강력한 시스템에 대한 규제 층을 추가할 수 있다. CRISPR-Cas9 툴박스(toolbox)에 이러한 새로운 추가는 dCas9 결합이 게놈 좌위에 미치는 영향을 특이적으로 반전시키거나, 또는 Cas9가 핵에서 활성화되어 오프 타겟 유전자 편집을 감소시키는 시간의 양을 제한하는 것과 같은 새로운 적용을 가능하게 한다. 파지 박테리아 군비 경쟁으로부터 본 발명자에게 제공된 풍부한 툴을 활용하는 것을 지속하기 위한 억제제 단백질의 탐색을 확대하는 것이 중요할 것이다.
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실험 모델 및 세부 사항
미생물
리스테리아 모노사이토진스 균주를 뇌-심장 주입(BHI) 배지에서 배양하였다. E. 콜라이 균주를 LB 배지에서 배양하였다.
세포주
인간 배아 신장 293 플러스 T 세포 항원(HEK293T, CRL-3216, ATCC) 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS, Atlanta Biologicals) 및 50 ㎍/mL의 페니실린/스트렙토마이신(P/S, UCSF CCF)이 보충된 둘베코 변형 이글(Dulbecco's Modified Eagle's) 배지(DMEM)에서 배양하였다.
실시예 2
본 발명자는 유전자 편집에 널리 사용되는 Cas9의 스트렙토코커스 파이오진스 오르토로그에 대해 항 CRISPR 기능을 보유한 acrIIA1-4의 동족체(도 13)를 확인하고자 하였다.
도 14: AcrIIA1은 이종성 시스템(즉 자연 유기체 외래)에서 항 Cas9 활성을 보유한다. 이전에는, 이 단백질은 E. 콜라이 또는 인간 세포에서 항 Cas9 기능을 갖지 않았다. 이러한 불일치에 대한 이유는 아직 밝혀지지 않았지만, 양성 대조군 AcrIIA4와 비교할 때, Cas9를 타게팅하면서, AcrIIA1은 이 이종성 시스템(P. 에어루기노사)에서 매우 잘 기능한다.
도 15: 자연적 서열 공간을 넓게 샘플링하기 위해 AcrIIA2 동족체를 서열 정렬을 통해 확인하였다. 원래의 단백질 이외에 3개의 동족체를 시험하였고, 파지 플라크 검정을 사용하여 도 16에 도시되었듯이, 원래 단백질인 AcrIIA2a와 비교하여, AcrIIA2b.1 및 AcrIIA2b.3은 강력한 항 SpyCas9 활성을 갖는다.
도 17: AcrIIA3 동족체인 AcrIIA3b.2, 3b.3, 3b.4를 확인하기 위해, 유사한 상동성 조사가 수행되었다. 박테리아가 플레이트 상에 스포팅한 검정과 함께 도 18에 도시되었듯이, 이러한 3개의 새로운 항 CRISPR 단백질은 독성이 없고 박테리아에서 활발하게 작용한다. 논문에서 확인된 AcrIIA4는 Cas9에 강력히 결합하는 강력하고 넓은 스펙트럼의 Cas9 억제제이다(문헌 [Dong et al Nature] 및 [Shin et al Science Advances] 참조). 하나의 동족체(AcrIIA4b)는 적당한 항 Cas9 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
도 19는 실시예 2에 기술된 결과를 요약한다.
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본원에 기술된 실시예 및 실시양태들은 단지 예시를 목적으로 한 것이며, 이에 대한 다양한 수정 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 본 발명의 정신 및 범위, 및 첨부된 청구범위의 범위에 포함될 것이라는 것이 이해되어야 한다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조에 의해 포함된다.
서열
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SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Bondy-Denomy, Joseph Rauch, Benjamin <120> Inhibitors of CRISPR-Cas9 <130> 1064235 <150> US 62/422,850 <151> 2016-11-16 <160> 209 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 1 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Val Asn Ile Lys Lys 115 120 125 Asp Val Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Leu 145 <210> 2 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 2 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Thr Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Val Asn Ile Lys Lys 115 120 125 Asp Val Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Leu 145 <210> 3 <211> 148 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 3 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Asn Ile Glu Val Leu Pro Phe 100 105 110 Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Val Asn Ile Gly Lys Asp 115 120 125 Val Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys Lys 130 135 140 Asn Glu Leu Leu 145 <210> 4 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 4 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Val Asn Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Leu 145 <210> 5 <211> 148 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 5 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu 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Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Val Asn Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Leu 145 <210> 7 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 7 Met Ala Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Lys His Val Asn Ile Lys Lys 115 120 125 Asp Val Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Leu 145 <210> 8 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 8 Met Ser Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asn Lys Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Val Asn Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Leu 145 <210> 9 <211> 147 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 9 Met Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr Arg Tyr 1 5 10 15 Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys Asp Gln 20 25 30 Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg Ser Leu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu Leu Glu 50 55 60 Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His Leu Leu 65 70 75 80 Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu Tyr Cys 85 90 95 Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro Phe Thr 100 105 110 Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Lys His Val Asn Ile Lys Lys Asp Val 115 120 125 Cys Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys Lys Asn 130 135 140 Glu Leu Leu 145 <210> 10 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 10 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr 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Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Thr His Val Asp Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Arg Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Leu Ile 145 <210> 12 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 12 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Ser Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Leu 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<212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 15 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Ser Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Thr 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Ala Asp Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Lys Lys Ala Leu Asn Asn Ala Ile Ala Val Leu Lys Ala Lys 130 135 140 Lys Glu Glu Leu Leu 145 <210> 16 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 16 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Ser Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Leu Ile Ser Gly Leu Ser Val Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Glu Lys Asn Ser Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Thr 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Asn Glu Glu His Ala Asp Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Lys Lys Thr Leu Asn Asn Ala Ile Ala Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Glu Glu Leu Leu 145 <210> 17 <211> 144 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 17 Met Thr Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Pro Leu Asn Lys Tyr Thr 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Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 21 Met Ser Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Thr Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ala Leu Ala Leu Ile Thr Gly Met Pro Ile Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Leu Glu Lys Asn Ala Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys His 65 70 75 80 Leu Leu Asp Thr Tyr Lys Leu Ser Phe Pro Ala Gln Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Ser Glu Thr His Val Asp Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Gln Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Phe Met 145 <210> 22 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 22 Met Ser Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 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Ala Leu Ile Thr Gly Met Pro Ile Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Leu Glu Lys Asn Ala Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys Gln 65 70 75 80 Leu Leu Asp Thr His Lys Leu Ser Phe Pro Ala His Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Val Asn Ile Glu Val Leu Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Ser Glu Thr His Val Asp Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Arg Lys Ala Leu Glu Asn Ala Ile Thr Val Leu Lys Glu Lys 130 135 140 Lys Asn Glu Phe Ile 145 <210> 24 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 24 Met Ser Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asp Leu Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Lys 20 25 30 Asp Gln Asn Glu Lys Thr Leu Asn Lys Tyr Thr Val Ser Ile Leu Arg 35 40 45 Ala Leu Ala Leu Ile Thr Gly Met Pro Ile Ser Asp Val Leu Phe Glu 50 55 60 Leu Glu Asp Leu Glu Lys Asn Ala Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys Gln 65 70 75 80 Leu Leu Asp Thr 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<220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 63 Met Ser Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Ser Lys Thr 1 5 10 15 Arg Tyr Gln Leu Ser Lys Leu Thr Gly Ile Ser Gln Asn Thr Leu Asn 20 25 30 Asp Tyr Asn Lys Lys Glu Leu Asn Lys Tyr Ser Val Ser Phe Leu Arg 35 40 45 Ser Leu Ser Phe Ala Thr Gly Glu Ser Val Thr Asp Ile Leu Leu Glu 50 55 60 Leu Ala Glu Leu Glu Lys Asp Tyr Asp Asp Leu Ala Gly Phe Lys Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Ala Phe Pro Ala Leu Glu Phe Glu Leu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ile Lys Glu Phe Glu Ser Ala Asn Ile Glu Ile Ser Pro 100 105 110 Phe Thr Phe Asn Arg Phe Glu Ser Glu Thr His Thr Asp Ile Glu Lys 115 120 125 Asp Val Lys Lys Ala Leu Gln Asn Ala Val Thr Val Leu Glu Glu Arg 130 135 140 Lys Glu Glu Leu Leu 145 <210> 64 <211> 159 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 64 Met Ser Ile Lys Leu Leu Asp Glu Phe Leu Lys Lys His Asn 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<223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 102 Met Thr Ile Thr Thr Ala Gln Lys Arg Tyr Tyr Asp Ala Met Asn Glu 1 5 10 15 Phe Glu Ala Ile Ile Ser Lys Glu Leu Glu Gln Thr Pro Ala Phe Ser 20 25 30 Gln Asp Leu Leu Asn Asp Ser Asp Tyr Leu Ala Val Thr Lys Asn Glu 35 40 45 Ala Tyr Ala Val Ala Leu Cys Leu Leu Asp Asp Asp Lys Leu Tyr Leu 50 55 60 Asp Glu Thr Leu Val His Ser Thr Arg Leu Asp Ile Glu Asp Glu Thr 65 70 75 80 Tyr Tyr Ile Asn Phe Val Val Thr Asn Glu Asp Asp Phe Lys Leu Ala 85 90 95 Thr Asp Glu Asp Lys Glu Lys His Asp Lys Gln Glu Val Ile Ile Lys 100 105 110 Ser Gly Leu Asn 115 <210> 103 <211> 116 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 103 Met Thr Ile Thr Thr Ala Gln Lys Arg Tyr Tyr Asp Ala Met Asn Glu 1 5 10 15 Phe Glu Ala Ile Thr Ser Lys Glu Leu Glu Gln Thr Pro Ala Phe Ser 20 25 30 Gln Asp Leu Leu Asn Asp Ser Asp Tyr Leu Ala Val Thr Lys Asn Glu 35 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<223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 117 Met Tyr Asn Lys Ala Glu Ile Met Lys Gln Ala Trp Asn Trp Phe Asn 1 5 10 15 Asp Ser Asn Ile Trp Leu Ser Asp Ile Glu Trp Val Ser Tyr Thr Asp 20 25 30 Lys Glu Lys Ser Phe Ser Val Cys Leu Lys Ala Ala Trp Ser Lys Ala 35 40 45 Lys Glu Glu Val Glu Glu Phe Lys Lys Glu Ser Lys Tyr Ile Ala Lys 50 55 60 Ser Glu Glu Leu Lys Ala Trp Asn Trp Ala Glu Arg Lys Leu Gly Leu 65 70 75 80 Arg Phe Asn Ile Ser Asp Asp Glu Lys Phe Thr Ser Val Lys Asp Glu 85 90 95 Thr Lys Ile Asn Phe Gly Leu Ser Val Trp Ala Cys Ala Met Lys Ala 100 105 110 Val Lys Leu His Asn Asp Leu Phe Pro Gln Thr Ala Ala 115 120 125 <210> 118 <211> 118 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 118 Met Lys Gln Ala Trp Asn Trp Phe Asn Asp Ser Asn Ile Trp Leu Ser 1 5 10 15 Asp Ile Glu Trp Val Ser Tyr Thr Asp Lys Glu Lys Ser Phe Ser Val 20 25 30 Cys Leu Lys Ala Ala Trp 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20 25 30 Ala Asp Leu Thr Thr Leu Asn Lys Leu Ser Val Ile Asn Ile Lys Lys 35 40 45 Ile Ser Glu Ala Val Gly Glu Thr Pro Gly Glu Val Leu Asp Asp Leu 50 55 60 Ile Lys Phe Glu Glu Arg Val Glu Lys Met Asn Ile Ser Glu Leu Ile 65 70 75 80 Arg Glu Ile Lys Asn Lys Asp Tyr Ala Val Arg Leu Glu Gly Thr Asp 85 90 95 Asp Asn Ser Ile Thr Lys Leu Ile Ile Asp Val Asp Asn Asp Gly Asn 100 105 110 Glu Tyr Val Ile Ser Glu Ser Lys Asn Glu Ser Ile Ala Glu Lys Phe 115 120 125 Ala Ser Thr Phe Lys Asn Gly Trp Asn Lys Glu Tyr Glu Asp Glu Glu 130 135 140 Glu Phe Tyr Asn Asp Met Gln Ser Ile Ile Leu Lys Ser Glu Leu Asn 145 150 155 160 <210> 157 <211> 86 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 157 Met Asn Leu Lys Glu Leu Val Arg Glu Ile Lys Asn Lys Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ser Gly Thr Asp Ser Asn Ser Ile Thr Gln Leu Ile Ile 20 25 30 His Val Asn Asn Asp Gly Asn Glu Tyr Gly Ile Ser Glu Ser Asn Phe 35 40 45 Glu Ser Ile Val Glu Lys Phe Val Ser Thr Phe Glu Asn Gly Trp Asp 50 55 60 Gly Ala Tyr Glu Asp Glu Glu Glu Phe Tyr Asn Asp Met Gln Asp Ile 65 70 75 80 Val Asn Arg His Phe Lys 85 <210> 158 <211> 86 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 158 Met Asn Leu Lys Glu Leu Val Arg Glu Ile Lys Asn Lys Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ser Gly Thr Asp Ser Asn Ser Ile Thr Gln Leu Ile Ile 20 25 30 His Val Asn Asn Asp Gly Asn Glu Tyr Gly Ile Ser Glu Ser Asn Phe 35 40 45 Glu Ser Ile Val Glu Lys Phe Val Ser Asn Phe Glu Asn Gly Trp Asp 50 55 60 Gly Ala Tyr Glu Asp Glu Glu Glu Phe Tyr Asn Asp Met Gln Asp Ile 65 70 75 80 Val Asn Arg His Phe Lys 85 <210> 159 <211> 151 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 159 Met Lys Ile Asn Glu Leu Val Arg Glu Ile Lys Ser Arg Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Val Arg Leu Asn Gly Thr Asp Ser Asn Ser Ile Thr Lys Leu Ile Ile 20 25 30 Asp Val Asn Asn Asp Gly Asn Glu Tyr Val Ile Ser Glu Arg Gln Asp 35 40 45 Thr Ser Ile Val Glu Ser Phe Ala Asp Ser Phe Ile Asp Gly Trp Thr 50 55 60 Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Glu Asp Phe Tyr Asn Asp Met Gln Glu Ile 65 70 75 80 Ala Gln Asp Ile Ile Leu Glu Thr Leu Lys Glu Ala Phe Glu Asn Asn 85 90 95 Asn Tyr Asn Thr Asp Glu Val Asp Thr Asp Leu Phe Asp Gly Tyr Gln 100 105 110 Ile Lys Leu Ala Met Glu Tyr Asp Asn Ile Gly Glu Leu Ala Thr Ser 115 120 125 Val Asn Lys Thr Lys His Phe Thr Ala Tyr Met Asp Ala Ser Thr Asp 130 135 140 Phe Met Ile Ile Glu Lys Tyr 145 150 <210> 160 <211> 147 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 160 Met Ser Ile Ile Ala Ile Lys Lys Glu Ile His Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Ile Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Asp Glu Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asn Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Val Ala Leu Lys Glu Ile Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Thr Gly Ala Leu Phe Cys Gln Asp Ile Thr Thr Tyr Asp Phe Thr Ile 85 90 95 Asp Asp Val Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asp Lys Pro Thr Phe Glu 100 105 110 Glu Asp Ala Glu Asp Leu Ile Ile Glu Phe Asp Ser Thr Cys Phe Trp 115 120 125 Asp Ala Thr Val Glu Asn Asp Lys Ile Lys Ile Thr Val Arg Asn Lys 130 135 140 Ser Arg Tyr 145 <210> 161 <211> 99 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 161 Met Ser Ile Ile Ala Ile Lys Lys Glu Ile His Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Ile Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Asp Glu Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asn Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Ile Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Ile Asp Val Leu Tyr Asn Leu Asp Ile Thr Thr Tyr Asn Phe Thr Ile 85 90 95 Asp Asp Ser <210> 162 <211> 147 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 162 Met Ser Ile Ile Ala Ile Lys Lys Glu Ile His Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Ile Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Asp Glu Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asn Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Ile Ala Leu Glu Glu Ile Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Thr Gly Ala Leu Phe Cys Gln Asp Ile Thr Thr Tyr Asp Phe Thr Ile 85 90 95 Asp Asp Val Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asp Lys Pro Thr Phe Glu 100 105 110 Glu Asp Ala Glu Asp Leu Ile Ile Glu Phe Asp Ser Thr Cys Phe Trp 115 120 125 Asp Ala Thr Val Glu Asn Asp Lys Ile Lys Ile Thr Val Arg Asn Lys 130 135 140 Ser Arg Tyr 145 <210> 163 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 163 Met Ser Ile Ile Ala Ile Asn Lys Glu Ile Arg Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Ile Ala Gln Ile Asn Phe Glu Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Asp Glu Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asn Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Ile Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Ile Asp Val Leu Tyr Asn Leu Asp Ile Thr Thr Tyr Asn Phe Thr Ile 85 90 95 Asp Asp Val Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asn Lys Pro Ile Asp Glu 100 105 110 Glu Glu Thr Glu Asp Leu Val Gln Glu Phe Asn Val Thr Cys Phe Trp 115 120 125 Asp Ala Thr Val Glu Asp Asp Lys Val Lys Val Thr Ile Arg Asn Lys 130 135 140 Asn Arg Ala Ile Ser 145 <210> 164 <211> 146 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 164 Met Ser Thr Thr Ala Ile Asn Lys Glu Ile His Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Ile Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Glu Lys Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asp Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Ile Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Ile Asp Val Leu Tyr Asn Leu Asp Ile Thr Thr Tyr Asn Phe Thr Ile 85 90 95 Asp Asp Val Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asn Lys Pro Ile Asp Glu 100 105 110 Glu Glu Thr Glu Asp Leu Val Gln Glu Phe Asn Val Thr Cys Phe Trp 115 120 125 Asn Ala Ile Val Glu Asp Asp Lys Val Lys Ile Thr Val Arg Asn Lys 130 135 140 Ser Lys 145 <210> 165 <211> 146 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 165 Met Ser Thr Thr Ala Ile Asn Lys Glu Ile His Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Ile Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Glu Glu Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asp Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Ile Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Ile Asp Val Leu Tyr Asn Leu Asp Ile Thr Thr Tyr Asn Phe Thr Ile 85 90 95 Asp Asp Val Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asn Lys Pro Ile Asp Glu 100 105 110 Glu Glu Thr Glu Asp Leu Val Gln Glu Phe Asn Val Thr Cys Phe Trp 115 120 125 Asn Ala Ile Val Glu Asp Asp Lys Val Lys Ile Thr Val Arg Asn Lys 130 135 140 Ser Lys 145 <210> 166 <211> 146 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 166 Met Ser Thr Thr Ala Ile Asn Lys Glu Ile His Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Val Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Glu Glu Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asp Gly Thr Tyr Lys Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Ile Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Ile Asp Thr Leu Tyr Asn Leu Asp Ile Thr Thr Tyr Asp Phe Thr Ile 85 90 95 Asp Asp Ile Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asp Lys Pro Thr Asp Arg 100 105 110 Glu Glu Thr Glu Asp Leu Val Gln Glu Phe Asn Val Thr Cys Phe Trp 115 120 125 Asn Ala Ile Val Glu Asp Asp Lys Val Lys Val Thr Val Arg Asn Lys 130 135 140 Ser Lys 145 <210> 167 <211> 130 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (112)..(112) <223> Xaa is any amino acid <400> 167 Met Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Ile Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 1 5 10 15 Thr Gly Asn Glu Tyr Pro Leu Pro Ala Thr Trp Asp Glu Phe Ile Glu 20 25 30 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asn Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 35 40 45 Phe Asn Asp Met Gln Glu Val Ala Leu Lys Glu Ile Leu Asp Glu Leu 50 55 60 Ile Asp Val Leu Tyr Asn Leu Asp Ile Thr Thr Tyr Asn Phe Thr Ile 65 70 75 80 Asp Asp Val Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asn Lys Pro Thr Asp Glu 85 90 95 Glu Asp Ala Glu Asp Leu Val Ile Glu Phe Asp Ser Thr Cys Phe Xaa 100 105 110 Asp Ala Thr Val Glu Asn Asp Lys Ile Lys Val Thr Val Arg Asn Lys 115 120 125 Ser Lys 130 <210> 168 <211> 149 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 168 Met Ser Thr Thr Ala Ile Asn Lys Glu Ile His Ala Lys Gly Tyr Lys 1 5 10 15 Val Thr Gly Thr His Gln Gly Tyr Met Ala Gln Ile Asn Phe Asp Gly 20 25 30 Thr Gly Asn Glu Phe Pro Leu Pro Ala Thr Trp Glu Glu Phe Ile Glu 35 40 45 Thr Phe Lys Asp Gly Trp Asp Gly Thr Tyr Glu Asp Glu Gln Ala Phe 50 55 60 Phe Asn Asp Met Gln Glu Val Ala Leu Glu Glu Leu Leu Asp Glu Leu 65 70 75 80 Thr Asp Val Phe Tyr Asn Leu Asp Ile Thr Ala Tyr Asp Phe Thr Val 85 90 95 Asp Asp Val Lys Lys Lys Val Ile Thr Leu Asp Lys Pro Thr Asp Arg 100 105 110 Glu Glu Thr Glu Asp Leu Val Gln Glu Phe Lys Ala Thr Cys Phe Trp 115 120 125 Asn Ala Val Val Glu Asp Asp Lys Val Lys Val Thr Ile Arg Asn Lys 130 135 140 Asn Arg Ala Ile Ser 145 <210> 169 <211> 119 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 169 Met Gln Phe Val Val Thr Asn Lys Ser Glu Leu Phe Lys Phe Ala Trp 1 5 10 15 Lys Ile Phe Lys Ala Asn Lys Asp Ile Ala Phe Ser Glu Cys Leu Gln 20 25 30 Asn Ala Trp Phe Gln Tyr Lys Arg Tyr Leu Asn Arg Glu Ala Ile Lys 35 40 45 Ala Ala Gln Gln Arg Lys Leu Ala Lys Phe Ile Ala Asp Thr Glu Asn 50 55 60 Glu Glu Val Lys Ala Trp Asn Trp Ala Glu Lys Lys Leu Gly Val Ala 65 70 75 80 Leu Asn Leu Thr Asp Ala Glu Lys Glu Arg Asn Val Arg Asn Met Tyr 85 90 95 Lys Glu Met Trp Asn Ala Asn Val Trp Ala Thr Ala Ile Lys Ala Val 100 105 110 Lys Leu His Met Glu Ile Gly 115 <210> 170 <211> 148 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 170 Met Asn Glu Leu Arg Ser Leu Glu Met Ser Ile Asn Ala Lys Lys Tyr 1 5 10 15 Asp Thr Arg Leu Glu Ser Gly Asn Arg Val Leu Asn Ile Gly Phe Gly 20 25 30 Asp Gly Glu Asp Tyr Pro Val Cys Ser Ser Ser Arg Tyr Ser Leu Lys 35 40 45 Glu Ser Phe Ile Glu Cys Phe Lys Asp Gly Trp Ser Gly Thr Tyr Arg 50 55 60 Asp Glu Lys Glu Leu Met Glu Asp Met Gln Glu Ile Ala Gln Glu Leu 65 70 75 80 Ile Leu Glu Glu Leu Thr Asp Ile Phe Glu Tyr Tyr Glu Phe Asn Thr 85 90 95 Asp Glu Ile Asp Thr Asp Leu Phe Lys Gly Phe Thr Phe Asp Val Asp 100 105 110 Ser Asp Leu Glu Asp Ser Met Ala Leu Met Lys Ala Ile Asn Ala Thr 115 120 125 Lys Tyr Phe Glu Ala Arg Ser Ser Ser Trp Tyr Ala Ser Phe Glu Val 130 135 140 Ser Tyr Ile Gly 145 <210> 171 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic crRNA spacer sequence <400> 171 gauagcaaga uggauaguua guuuuaga 28 <210> 172 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic protospacer sequence (phiJ0161a prophage)) <400> 172 acgctccgta actatccatc ttgctatctg tatatg 36 <210> 173 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic protospacer sequence (phiJ0161a prophage)) - complement <400> 173 catatacaga tagcaagatg gatagttacg gagcgt 36 <210> 174 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 174 tggttctttc gctttcacaa gatacttttg 30 <210> 175 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 175 acccgtttct gatgaacgat acactgttgt 30 <210> 176 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 176 catctatcaa gctacaaatt ggatgtacac 30 <210> 177 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 177 aagacgaagt gaacgaagag tctttcccag 30 <210> 178 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 178 taacgtttgg aaccctaggc attatgttgc 30 <210> 179 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 179 gagaatgcaa gaattaatta atgagtacag 30 <210> 180 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 180 tgttgttata aacactgtta actgttgttc 30 <210> 181 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 181 tctatgcctt gatattttaa atgaccgagt 30 <210> 182 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 182 taagcaagtt gcagataaga aaaccatgtc 30 <210> 183 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 183 ttttgatgat gaaccagaat ggatttatta 30 <210> 184 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 184 ctatccgcaa acacatgttg atggcgtcgt 30 <210> 185 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 185 aaaaaaatat taacacgaat tagatactaa 30 <210> 186 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 186 caaggcactt ttcatttttt gaacacgcca 30 <210> 187 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 187 aactgttgtg ccttcctttg cgtgcacttg 30 <210> 188 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 188 tctttttgat gtattcattt attgttagaa 30 <210> 189 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B; includes self-targeting spacer <400> 189 agcatataca gatagcaaga tggatagtta 30 <210> 190 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 190 ttcaaggtca agatcaagag caagaatgcc 30 <210> 191 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 191 cgtcgcataa tactgttcct ctgccgttcg 30 <210> 192 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 192 gaatattctt ccccccatga ctaacaggg 29 <210> 193 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic spacer sequence from FIG. 7B <400> 193 gttttagagc tatgttattt tgaatgctac caaaac 36 <210> 194 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic crRNA spacer sequence <400> 194 agcauauaca gauagcaaga uggauaguua guuuuaga 38 <210> 195 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic target DNA sequence <400> 195 acgctccgta actatccatc ttgctatctg tatatgcttt tgcaga 46 <210> 196 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic target DNA sequence (complement) <400> 196 tctgcaaaag catatacaga tagcaagatg gatagttacg gagcgt 46 <210> 197 <211> 154 <212> DNA <213> Streptocococcus pyogenes <400> 197 tatggctgat aaatttcttt gaatttctcc ttgattattt gttataaaag ttataaaata 60 atcttgttgg aaccattcaa aacagcatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa 120 cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tttt 154 <210> 198 <211> 157 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 198 catattcttc atcccttcaa cctgttttta gttgcattct ttttataatt tggtacaatg 60 tatatattgt tagtattcaa aataacatag caagttaaaa taaggctttg tccgttatca 120 acttttaatt aagtagcgct gtttcggcgc ttttttt 157 <210> 199 <211> 157 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 199 catattcttc atcccttcaa cctgttttta gttgcattct ttttataatt tggtacaatg 60 tatatattgt tagtattcaa aataacatag caagttaaaa taaggctttg tccgttatca 120 acttttaatt aagtagcgct gtttcggcgc ttttttt 157 <210> 200 <211> 157 <212> DNA <213> Listeria innocua <400> 200 catattcttc atcccttcaa cctattttta gttgcattct ttttataatt tggtacaatg 60 tatatattgt tagtattcaa aataacatag caagttaaaa taaggctttg tccgttatca 120 acttttaatt aagtagcgct gtttcggcgc ttttttt 157 <210> 201 <211> 246 <212> DNA <213> Streptocococcus pyogenes <400> 201 ttagatgaag attatttctt aataactaaa aatatggtat aatactctta ataaatgcag 60 taatacaggg gcttttcaag actgaagtct agctgagaca aatagtgcga ttacgaaatt 120 ttttagacaa aaatagtcta cgaggtttta gagctatgct gttttgaatg gtcccaaaac 180 tgcgctggtt gatttcttct tgcgcttttt gttttagagc tatgctgttt tgaatggtcc 240 caaaac 246 <210> 202 <211> 233 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 202 taaggtaacc gctgttcttt gaaaacaaaa taaattttat gtaaaccata aaatagcatt 60 caaaattgaa atcttgctat ggatgaatgg cgcgattacg gaatcttgga ggaaagaaaa 120 aattctgcga ggttttagag ctatgttatt ttgaatgcta ccaaaactcg tgatttcttc 180 ctcatgcgcg cttttgagtt ttagagctat gttattttga atgctaccaa aac 233 <210> 203 <211> 233 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 203 taaggtaacc gctgttcttt gaaaacaaaa taaattttat gtaaaccata aaatagcatt 60 caaaattgaa atcttgctat ggatgaatgg cgcgattacg gaatcttgga ggaaagaaaa 120 aattctgcga ggttttagag ctatgttatt ttgaatgcta ccaaaactgg ttctttcgct 180 ttcacaagat acttttggtt ttagagctat gttattttga atgctaccaa aac 233 <210> 204 <211> 231 <212> DNA <213> Listeria innocua <400> 204 tagagttcaa atgatctttg aaaactaaat agattttatg tgaaccataa aataagcatt 60 caaaattgaa atcttgctat ggatgaatgg cgcgattacg aaatctagga gaataaaaaa 120 ttctacgagg ttttagagct atgttatttt gaatgctaac aaaaccgtag cgctttggta 180 actttgccta ggatagtttt agagctatgt tattttgaat gctaacaaaa c 231 <210> 205 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptocococcus pyogenes <400> 205 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu 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Asn Asn Arg Leu Tyr Leu 805 810 815 Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Met Tyr Thr Gly Gln Glu Leu Asp 820 825 830 Ile His Asn Leu Ser Asn Tyr Asp Ile Asp His Ile Val Pro Gln Ser 835 840 845 Phe Ile Thr Asp Asn Ser Ile Asp Asn Leu Val Leu Thr Ser Ser Ala 850 855 860 Gly Asn Arg Glu Lys Gly Gly Asp Val Pro Pro Leu Glu Ile Val Arg 865 870 875 880 Lys Arg Lys Val Phe Trp Glu Lys Leu Tyr Gln Gly Asn Leu Met Ser 885 890 895 Lys Arg Lys Phe Asp Tyr Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Thr 900 905 910 Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Ile His Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg 915 920 925 Gln Ile Thr Lys Asn Val Ala Asn Ile Leu Tyr Gln Arg Phe Asn Lys 930 935 940 Glu Thr Asp Asn His Gly Asn Thr Met Glu Gln Val Arg Ile Val Thr 945 950 955 960 Leu Lys Ser Ala Leu Val Ser Gln Phe Arg Lys Gln Phe Gln Leu Tyr 965 970 975 Lys Val Arg Glu Val Asn Gly Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu 980 985 990 Asn Gly Val Val Ala Asn Thr Leu Leu Lys Val Tyr Pro Gln Leu Glu 995 1000 1005 Pro Glu Phe Val Tyr Gly Glu Tyr His Gln Phe Asp Trp Phe Lys 1010 1015 1020 Ala Asn Lys Ala Thr Ala Lys Lys Gln Phe Tyr Thr Asn Ile Met 1025 1030 1035 Leu Phe Phe Ala Gln Lys Glu Arg Ile Ile Asp Glu Asn Gly Glu 1040 1045 1050 Ile Leu Trp Asp Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Ile Lys Lys Val Leu 1055 1060 1065 Asp Tyr Arg Gln Met Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Ile Gln Lys 1070 1075 1080 Gly Glu Phe Ser Lys Ala Thr Ile Lys Pro Lys Gly Asn Ser Ser 1085 1090 1095 Lys Leu Ile Pro Arg Lys Glu Asn Trp Asp Pro Met Lys Tyr Gly 1100 1105 1110 Gly Leu Asp Ser Pro Asn Met Ala Tyr Ala Val Ile Ile Glu His 1115 1120 1125 Ala Lys Gly Lys Lys Lys Ile Val Ile Glu Lys Lys Leu Ile Gln 1130 1135 1140 Ile Asn Ile Met Glu Arg Lys Met Phe Glu Lys Asp Glu Glu Ala 1145 1150 1155 Phe Leu Glu Glu Lys Gly Tyr Arg His Pro Lys Val Leu Thr Lys 1160 1165 1170 Leu Pro Lys Tyr Thr Leu Tyr Glu Cys Glu Lys Gly Arg Arg Arg 1175 1180 1185 Met Leu Ala Ser Ala Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Gln Leu Val 1190 1195 1200 Leu Ser Asn His Leu Val Ser Leu Leu Tyr His Ala Lys Asn Cys 1205 1210 1215 Glu Ala Ser Asp Gly Lys Ser Leu Lys Tyr Ile Glu Ala His Arg 1220 1225 1230 Glu Thr Phe Ser Glu Leu Leu Ala Gln Val Ser Glu Phe Ala Thr 1235 1240 1245 Arg Tyr Thr Leu Ala Asp Ala Asn Leu Ser Lys Ile Asn Asn Leu 1250 1255 1260 Phe Glu Gln Asn Lys Glu Gly Asp Ile Lys Ala Ile Ala Gln Ser 1265 1270 1275 Phe Val Asp Leu Met Ala Phe Asn Ala Met Gly Ala Pro Ala Ser 1280 1285 1290 Phe Lys Phe Phe Glu Ala Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Asn 1295 1300 1305 Leu Lys Glu Leu Leu Ser Ser Thr Ile Ile Tyr Gln Ser Ile Thr 1310 1315 1320 Gly Leu Tyr Glu Ser Arg Lys Arg Leu Asp Asp 1325 1330 <210> 208 <211> 1334 <212> PRT <213> Listeria innocua <400> 208 Met Lys Lys Pro Tyr Thr Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Leu Thr Asp Gln Tyr Asp Leu Val Lys Arg Lys Met 20 25 30 Lys Ile Ala Gly Asp Ser Glu Lys Lys Gln Ile Lys Lys Asn Phe Trp 35 40 45 Gly Val Arg Leu Phe Asp Glu Gly Gln Thr Ala Ala Asp Arg Arg Met 50 55 60 Ala Arg Thr Ala Arg Arg Arg Ile Glu Arg Arg Arg Asn Arg Ile Ser 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Gly Ile Phe Ala Glu Glu Met Ser Lys Thr Asp Ala Asn 85 90 95 Phe Phe Cys Arg Leu Ser Asp Ser Phe Tyr Val Asp Asn Glu Lys Arg 100 105 110 Asn Ser Arg His Pro Phe Phe Ala Thr Ile Glu Glu Glu Val Glu Tyr 115 120 125 His Lys Asn Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Glu Glu Leu Val Asn 130 135 140 Ser Ser Glu Lys Ala Asp Leu Arg Leu Val Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Ile Ile Lys Tyr Arg Gly Asn Phe Leu Ile Glu Gly Ala Leu Asp Thr 165 170 175 Gln Asn Thr Ser Val Asp Gly Ile Tyr Lys Gln Phe Ile Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Val Phe Ala Ser Gly Ile Glu Asp Gly Ser Leu Lys Lys Leu 195 200 205 Glu Asp Asn Lys Asp Val Ala Lys Ile Leu Val Glu Lys Val Thr Arg 210 215 220 Lys Glu Lys Leu Glu Arg Ile Leu Lys Leu Tyr Pro Gly Glu Lys Ser 225 230 235 240 Ala Gly Met Phe Ala Gln Phe Ile Ser Leu Ile Val Gly Ser Lys Gly 245 250 255 Asn Phe Gln Lys Pro Phe Asp Leu Ile Glu Lys Ser Asp Ile Glu Cys 260 265 270 Ala Lys Asp Ser Tyr Glu Glu Asp Leu Glu Ser Leu Leu Ala Leu Ile 275 280 285 Gly Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Phe Val Ala Ala Lys Asn Ala Tyr Ser 290 295 300 Ala Val Val Leu Ser Ser Ile Ile Thr Val Ala Glu Thr Glu Thr Asn 305 310 315 320 Ala Lys Leu Ser Ala Ser Met Ile Glu Arg Phe Asp Thr His Glu Glu 325 330 335 Asp Leu Gly Glu Leu Lys Ala Phe Ile Lys Leu His Leu Pro Lys His 340 345 350 Tyr Glu Glu Ile Phe Ser Asn Thr Glu Lys His Gly Tyr Ala Gly Tyr 355 360 365 Ile Asp Gly Lys Thr Lys Gln Ala Asp Phe Tyr Lys Tyr Met Lys Met 370 375 380 Thr Leu Glu Asn Ile Glu Gly Ala Asp Tyr Phe Ile Ala Lys Ile Glu 385 390 395 400 Lys Glu Asn Phe Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ala Ile 405 410 415 Pro His Gln Leu His Leu Glu Glu Leu Glu Ala Ile Leu His Gln Gln 420 425 430 Ala Lys Tyr Tyr Pro Phe Leu Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Ile Lys Ser 435 440 445 Leu Val Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Phe Val Gly Pro Leu Ala Asn Gly 450 455 460 Gln Ser Glu Phe Ala Trp Leu Thr Arg Lys Ala Asp Gly Glu Ile Arg 465 470 475 480 Pro Trp Asn Ile Glu Glu Lys Val Asp Phe Gly Lys Ser Ala Val Asp 485 490 495 Phe Ile Glu Lys Met Thr Asn Lys Asp Thr Tyr Leu Pro Lys Glu Asn 500 505 510 Val Leu Pro Lys His Ser Leu Cys Tyr Gln Lys Tyr Leu Val Tyr Asn 515 520 525 Glu Leu Thr Lys Val Arg Tyr Ile Asn Asp Gln Gly Lys Thr Ser Tyr 530 535 540 Phe Ser Gly Gln Glu Lys Glu Gln Ile Phe Asn Asp Leu Phe Lys Gln 545 550 555 560 Lys Arg Lys Val Lys Lys Lys Asp Leu Glu Leu Phe Leu Arg Asn Met 565 570 575 Ser His Val Glu Ser Pro Thr Ile Glu Gly Leu Glu Asp Ser Phe Asn 580 585 590 Ser Ser Tyr Ser Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Val Gly Ile Lys Gln 595 600 605 Glu Ile Leu Asp Asn Pro Val Asn Thr Glu Met Leu Glu Asn Ile Val 610 615 620 Lys Ile Leu Thr Val Phe Glu Asp Lys Arg Met Ile Lys Glu Gln Leu 625 630 635 640 Gln Gln Phe Ser Asp Val Leu Asp Gly Val Val Leu Lys Lys Leu Glu 645 650 655 Arg Arg His Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Ala Lys Leu Leu Met 660 665 670 Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser His Leu Thr Ile Leu Asp Tyr Leu Met 675 680 685 Asn Asp Asp Gly Leu Asn Arg Asn Leu Met Gln Leu Ile Asn Asp Ser 690 695 700 Asn Leu Ser Phe Lys Ser Ile Ile Glu Lys Glu Gln Val Thr Thr Ala 705 710 715 720 Asp Lys Asp Ile Gln Ser Ile Val Ala Asp Leu Ala Gly Ser Pro Ala 725 730 735 Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Ser Leu Lys Ile Val Asp Glu Leu Val 740 745 750 Ser Val Met Gly Tyr Pro Pro Gln Thr Ile Val Val Glu Met Ala Arg 755 760 765 Glu Asn Gln Thr Thr Gly Lys Gly Lys Asn Asn Ser Arg Pro Arg Tyr 770 775 780 Lys Ser Leu Glu Lys Ala Ile Lys Glu Phe Gly Ser Gln Ile Leu Lys 785 790 795 800 Glu His Pro Thr Asp Asn Gln Glu Leu Arg Asn Asn Arg Leu Tyr Leu 805 810 815 Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Met Tyr Thr Gly Gln Asp Leu Asp 820 825 830 Ile His Asn Leu Ser Asn Tyr Asp Ile Asp His Ile Val Pro Gln Ser 835 840 845 Phe Ile Thr Asp Asn Ser Ile Asp Asn Leu Val Leu Thr Ser Ser Ala 850 855 860 Gly Asn Arg Glu Lys Gly Asp Asp Val Pro Pro Leu Glu Ile Val Arg 865 870 875 880 Lys Arg Lys Val Phe Trp Glu Lys Leu Tyr Gln Gly Asn Leu Met Ser 885 890 895 Lys Arg Lys Phe Asp Tyr Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Thr 900 905 910 Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Ile His Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg 915 920 925 Gln Ile Thr Lys Asn Val Ala Asn Ile Leu His Gln Arg Phe Asn Tyr 930 935 940 Glu Lys Asp Asp His Gly Asn Thr Met Lys Gln Val Arg Ile Val Thr 945 950 955 960 Leu Lys Ser Ala Leu Val Ser Gln Phe Arg Lys Gln Phe Gln Leu Tyr 965 970 975 Lys Val Arg Asp Val Asn Asp Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu 980 985 990 Asn Gly Val Val Ala Asn Thr Leu Leu Lys Val Tyr Pro Gln Leu Glu 995 1000 1005 Pro Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr His Gln Phe Asp Trp Phe Lys 1010 1015 1020 Ala Asn Lys Ala Thr Ala Lys Lys Gln Phe Tyr Thr Asn Ile Met 1025 1030 1035 Leu Phe Phe Ala Gln Lys Asp Arg Ile Ile Asp Glu Asn Gly Glu 1040 1045 1050 Ile Leu Trp Asp Lys Lys Tyr Leu Asp Thr Val Lys Lys Val Met 1055 1060 1065 Ser Tyr Arg Gln Met Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Ile Gln Lys 1070 1075 1080 Gly Glu Phe Ser Lys Ala Thr Ile Lys Pro Lys Gly Asn Ser Ser 1085 1090 1095 Lys Leu Ile Pro Arg Lys Thr Asn Trp Asp Pro Met Lys Tyr Gly 1100 1105 1110 Gly Leu Asp Ser Pro Asn Met Ala Tyr Ala Val Val Ile Glu Tyr 1115 1120 1125 Ala Lys Gly Lys Asn Lys Leu Val Phe Glu Lys Lys Ile Ile Arg 1130 1135 1140 Val Thr Ile Met Glu Arg Lys Ala Phe Glu Lys Asp Glu Lys Ala 1145 1150 1155 Phe Leu Glu Glu Gln Gly Tyr Arg Gln Pro Lys Val Leu Ala Lys 1160 1165 1170 Leu Pro Lys Tyr Thr Leu Tyr Glu Cys Glu Glu Gly Arg Arg Arg 1175 1180 1185 Met Leu Ala Ser Ala Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Gln Gln Val 1190 1195 1200 Leu Pro Asn His Leu Val Thr Leu Leu His His Ala Ala Asn Cys 1205 1210 1215 Glu Val Ser Asp Gly Lys Ser Leu Asp Tyr Ile Glu Ser Asn Arg 1220 1225 1230 Glu Met Phe Ala Glu Leu Leu Ala His Val Ser Glu Phe Ala Lys 1235 1240 1245 Arg Tyr Thr Leu Ala Glu Ala Asn Leu Asn Lys Ile Asn Gln Leu 1250 1255 1260 Phe Glu Gln Asn Lys Glu Gly Asp Ile Lys Ala Ile Ala Gln Ser 1265 1270 1275 Phe Val Asp Leu Met Ala Phe Asn Ala Met Gly Ala Pro Ala Ser 1280 1285 1290 Phe Lys Phe Phe Glu Thr Thr Ile Glu Arg Lys Arg Tyr Asn Asn 1295 1300 1305 Leu Lys Glu Leu Leu Asn Ser Thr Ile Ile Tyr Gln Ser Ile Thr 1310 1315 1320 Gly Leu Tyr Glu Ser Arg Lys Arg Leu Asp Asp 1325 1330 <210> 209 <211> 132 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Unknown bacterial, unknown viral (phage), or synthetic Cas9-inhibiting polypeptide <400> 209 Met Gly Met Thr Thr Ala Arg Lys Lys Phe Tyr Gln Ala Ile Ser Glu 1 5 10 15 Phe Glu Ala Met Thr Gly Lys Asp Val Glu Arg Thr Pro Gln Ile Ala 20 25 30 Asp Glu Val Leu Asn Asp Ala Glu Tyr Ile Ala Phe Thr Lys Thr Glu 35 40 45 Lys Tyr Ala Leu Tyr Leu Cys Thr Ser Asn Val Glu Gly Leu Glu Asp 50 55 60 Arg Tyr Phe Leu Asp Glu Glu Cys Leu Asp Ser Thr Phe Leu Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Asn Glu Thr Tyr Tyr Ile His Phe Leu Gln Glu Thr Glu Phe 85 90 95 Ser Glu Asp Asp Asn Glu Asp Glu Leu Pro Leu Ala Thr Glu Glu Gln 100 105 110 Ile Glu Ala Tyr Asp Lys Gln Glu Glu Leu Lys Ala Val Ile Leu Lys 115 120 125 Lys Glu Leu Asn 130

Claims (36)

  1. 세포에서 Cas9 폴리펩타이드를 억제하는 방법으로서,
    Cas9 억제 폴리펩타이드를 세포로 도입함으로써,
    세포에서 Cas9 폴리펩타이드를 억제하는 단계
    를 포함하고,
    상기 Cas9 억제 폴리펩타이드는 세포에 대해 이종성이며,
    상기 Cas9 억제 폴리펩타이드는 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상과 실질적으로(예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%) 동일한 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포에서 Cas9 억제 폴리펩타이드와 Cas9 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, Cas9 억제 폴리펩타이드가 서열 번호 1-170 중 하나를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 세포가 도입 전 Cas9 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 세포가 Cas9 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 프로모터가 유도성이고, 이 방법은 도입 전 세포를, 세포에서 Cas9 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 작용제 또는 조건과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 세포가 도입 후 Cas9 폴리펩타이드를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 프로모터가 유도성이고, 이 방법은 도입 후 세포를, 세포에서 Cas9 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 작용제 또는 조건과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 도입이, 세포에 존재하고 세포에 대해 이종성인 발현 카세트로부터 세포에서 Cas9 억제 폴리펩타이드를 발현시키는 것을 포함하고, 발현 카세트는 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 프로모터는 유도성 프로모터이고, 도입이 세포와 Cas9 억제 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 작용제를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 도입이 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 RNA를 세포로 도입하는 것, 및 세포에서 상기 RNA로부터 Cas9 억제 폴리펩타이드를 발현시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 도입이 Cas9 억제 폴리펩타이드를 세포로 삽입하는 것 또는 세포와 Cas9 억제 폴리펩타이드를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 진핵 세포인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 세포가 혈액 또는 유도 만능 줄기 세포인 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 체외에서 일어나는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 도입 및 접촉 후 세포를 포유동물에게 도입하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포가 상기 포유동물에 대하여 자가인 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 원핵 세포인 방법.
  21. Cas9 억제 폴리펩타이드를 포함하는 세포로서, Cas9 억제 폴리펩타이드가 상기 세포에 대해 이종성이고, Cas9 억제 폴리펩타이드가 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상과 실질적으로 동일한 것인 세포.
  22. 제21항에 있어서, 진핵 세포인 세포.
  23. 제22항에 있어서, 포유동물 세포인 세포.
  24. 제23항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  25. 제21항에 있어서, 원핵 세포인 세포.
  26. Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, Cas9 억제 폴리펩타이드가 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상과 실질적으로 동일한 것인 폴리뉴클레오타이드.
  27. 제26항에 있어서, 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제27항에 있어서, 프로모터가 Cas9 억제 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 이종성인 것인 폴리뉴클레오타이드.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 프로모터가 유도성인 폴리뉴클레오타이드.
  30. 제26항에 있어서, DNA 또는 RNA인 폴리뉴클레오타이드.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  32. 제31항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  33. 단리된 Cas9 억제 폴리펩타이드로서, 서열 번호 1-170 중 어느 하나 이상과 실질적으로 동일한 단리된 Cas9 억제 폴리펩타이드.
  34. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제33항의 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물.
  35. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제33항의 폴리펩타이드를 포함하는 전달 비이클(vehicle).
  36. 제35항에 있어서, 리포솜 또는 나노입자인 전달 비이클.
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