JP7210029B2 - CRISPR-Cas9の阻害因子 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年11月16日に出願された米国仮特許出願第62/422,850号に対する優先権の恩典を主張し、これはあらゆる目的のために参照により組み入れられる。
ウイルスからの攻撃を防ぐ能力は、細胞生命の顕著な特徴である。細菌は、細菌ウイルス(ファージ)による感染に抵抗するために、制限酵素およびCRISPR-Casシステムを含む複数の機構を用いている (Labrie, S.J., Samson, I.E., and Moineau, S. (2010). Nat Rev Micro, 8, 317-327)。CRISPRアレイは、そのクラスター化された規則的間隔の短いパリンドロームリピートの間に位置する小さなスペーサー配列として、可動遺伝因子との以前の遭遇の配列特異的残遺物を有する (Mojica, F.J.M et al. (2005). J. Mol. Evol., 60, 174-182)。これらのスペーサーは、プログラムされた標的への結合およびその切断を促進するガイドRNAを作製するために利用される(Brouns, S.J.J et al. (2008). Science, 321, 960-964;Garneau, J.E. et al. (2010). Nature, 468, 67-71)。免疫機能に必要なCRISPR関連 (cas) 遺伝子は、CRISPRアレイに隣接して見出される場合が多い(Marraffini, L.A. (2015). CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature, 526, 55-61;Wright, A.V., Nunez, J.K., and Doudna, J.A. (2016). Cell, 164, 29-44)。Casタンパク質は、外来ゲノムの破壊を行うのみならず (Garneau, J.E. et al. (2010). Nature, 468, 67-71)、成熟CRISPR RNA (crRNA) の生成(Deltcheva;Haurwitz, R.E et al (2010). Science, 329, 1355-1358)および外来配列のCRISPRアレイ中への獲得(Nunez, J.K. et al. (2014). Nat. Struct. Mol. Biol , 21, 528-534;Yosef, I., Goren, M.G., and Qimron, U. (2012). Nucleic Acids Research, 40, 5569-5576)も促進する。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸 (DNA) またはリボ核酸 (RNA)、および一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかであるそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に改変された変種(例えば、縮重コドン置換物)、対立遺伝子、オルソログ、SNP、および相補的配列もまた暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換物は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの3番目の位置を混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作製することによって達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991);Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
1) アラニン (A)、グリシン (G);
2) アスパラギン酸 (D)、グルタミン酸 (E);
3) アスパラギン (N)、グルタミン (Q);
4) アルギニン (R)、リジン (K);
5) イソロイシン (I)、ロイシン (L)、メチオニン (M)、バリン (V);
6) フェニルアラニン (F)、チロシン (Y)、トリプトファン (W);
7) セリン (S)、スレオニン (T);および
8) システイン (C)、メチオニン (M)
(例えば、Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984) を参照されたい)。
1つの局面において、細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する方法が提供される。いくつかの態様において、本方法は、細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 1~170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に(例えば、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%)同一であるCas9阻害ポリペプチドを、細胞内に導入し、それによって細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞においてCas9阻害ポリペプチドをCas9ポリペプチドと接触させる段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞においてCas9阻害ポリペプチドをCRISPR-Cas9システムの他の成分と接触させ、それによってCas9ポリペプチド活性を間接的に阻害する段階を含む。
[本発明1001]
細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する方法であって、以下の段階を含む、方法:
該細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 1~170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に(例えば、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%)同一であるCas9阻害ポリペプチドを、細胞内に導入し、それによって細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する段階。
[本発明1002]
細胞においてCas9阻害ポリペプチドをCas9ポリペプチドと接触させる段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
Cas9阻害ポリペプチドがSEQ ID NO: 1~170のうちの1つを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
細胞が、前記導入の前にCas9ポリペプチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
細胞が、Cas9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
プロモーターが誘導性であり、かつ前記方法が、前記導入の前に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
細胞が、前記導入の後にCas9ポリペプチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
プロモーターが誘導性であり、かつ前記方法が、前記導入の後に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記導入が、細胞内に存在しかつ該細胞に対して異種である発現カセットから、該細胞においてCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含み、
該発現カセットが、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、
本発明1001の方法。
[本発明1010]
プロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドの発現を誘導する剤に細胞を接触させることを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドをコードするRNAを細胞内に導入すること、および該細胞において該RNAからCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドを細胞内に挿入すること、またはCas9阻害ポリペプチドに細胞を接触させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
細胞が真核細胞である、本発明1001~1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
細胞が哺乳動物細胞である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
細胞がヒト細胞である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
細胞が血液細胞または人工多能性幹細胞である、本発明1014~1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
エクスビボで行われる、本発明1014~1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
細胞が、前記導入および接触後に哺乳動物内に導入される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
細胞が哺乳動物にとって自己のものである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
細胞が原核細胞である、本発明1001~1012のいずれかの方法。
[本発明1021]
細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 1~170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一であるCas9阻害ポリペプチド
を含む、細胞。
[本発明1022]
真核細胞である、本発明1021の細胞。
[本発明1023]
細胞が哺乳動物細胞である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
細胞がヒト細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
細胞が原核細胞である、本発明1021の方法。
[本発明1026]
SEQ ID NO: 1~170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一であるCas9阻害ポリペプチドをコードする核酸
を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1027]
前記核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、本発明1026のポリヌクレオチド。
[本発明1028]
プロモーターが、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して異種である、本発明1027のポリヌクレオチド。
[本発明1029]
プロモーターが誘導性である、本発明1027または1028のポリヌクレオチド。
[本発明1030]
DNAまたはRNAである、本発明1026のポリヌクレオチド。
[本発明1031]
本発明1027~1029のいずれかの発現カセットを含む、ベクター。
[本発明1032]
ウイルスベクターである、本発明1031のベクター。
[本発明1033]
SEQ ID NO:1~170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一である、単離されたCas9阻害ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1026~1029のいずれかのポリヌクレオチドまたは本発明1033のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
[本発明1035]
本発明1026~1030のいずれかのポリヌクレオチドまたは本発明1033のポリペプチドを含む、送達媒体。
[本発明1036]
リポソームまたはナノ粒子である、本発明1035の送達媒体。
Cas9ヌクレアーゼのいくつかのポリペプチド阻害因子(「Cas9阻害ポリペプチド」)がファージから同定された。ファージから最初に発見されたCas9阻害ポリペプチドは、AcrIIA1、AcrIIA2、AcrIIA3、およびAcrIIA4と命名された。
結果
リステリア・モノサイトゲネスにおけるCRISPR-Cas9は外来DNAを標的とする
リステリア・モノサイトゲネスは、十分に特徴づけられたファージ集団を有する通性細胞内食品媒介性病原体である。多くのリステリア・モノサイトゲネス分離株はII-A型CRISPR-Casシステムを有し (Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065)、それらのCRISPRスペーサーは、多くの毒性、溶原性、および組込みファージとの同一性を有する(Di, H. et al. (2014) Biochem Biophys Res Commun, 454, 399-403;Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065)。しかしながら、規範的なCRISPR-Cas機能の実験的証拠は存在しない。本発明者らはリステリア・モノサイトゲネスの275のゲノムを解析し、ゲノムの15% (n = 41) においてII-A型CRISPR-Cas9システム (Lmo Cas9) を同定した(図1B)。興味深いことに、自己標的指向の例を有する8つのゲノム(全体の3%)を見出したが(図1Bおよび1C)、CRISPRリピート、PAM、tracrRNA、Cas9、および関連プロモーターは明白な不活性化変異を欠いているため、CRISPR-cas9は機能的であると予測される(図6A~E)。これらの株は、スペーサー-プロトスペーサー対の安定した共存を可能にするCRISPR-Cas9の阻害因子を有すると予測した。
自己標的指向スペーサーを有する株においてCRISPR-Cas9が無効にされ得るかどうかを試験するために、そのスペーサー16が同じゲノム中のプロファージ (φJ0161a) と完全に一致するリステリア・モノサイトゲネス株J0161において免疫機能を調べた(図1C)。J0161において明らかに有害なCRISPR-Cas変異を検出することはできず、この自己標的指向シナリオが阻害の結果であり、機能喪失の結果ではないことが示唆された(図6B~F)。J0161のII-A型CRISPRアレイは10403sのものと異なるため、J0161特異的標的指向プラスミド (pTJ0161) を用いてJ0161におけるCRISPR-Cas9の機能を試験した。自己標的指向によって暗に示される不活性化と一致して、形質転換効率にもコロニーサイズにも、pTJ0161とpNTを区別する有意な違いはなかった(図2Bおよび2C、最も右側のパネル)。したがって、本発明者らは、J0161ゲノムがCas9阻害因子をコードすると判断した。
さらなるII-A型抗CRISPRを同定するために、関連リステリア・モノサイトゲネスプロファージにおける、acrIIA1およびacrIIA2のゲノム位置と類似の位置を調べた。左の組込み部位と細胞溶解に関与する遺伝子との間に、遺伝子順序が高度に保存された小さなオペロン(2~5遺伝子)内の、acrIIA1を含有する反復性の抗CRISPR (acr) 遺伝子座が同定された(図3A)。本発明者らは、acr遺伝子座内に保存された5つの新規タンパク質ファミリーを同定した。これらを試験するために、代表的なものをクローニングして10403sゲノム中に組み込み、pTおよびpNTの形質転換効率をアッセイした。CRISPR不活性化の能力がある、2つの新たな遺伝子が同定されたが(acrIIA3およびacrIIA4)、残りの3つ(orfC、D、E)にはこの能力はなかった(図3A、図9)。
Lmo Cas9 AcrIIAタンパク質の多用途性を判定するために、これらの阻害因子が、化膿性連鎖球菌 (Spy) 由来の関連Cas9タンパク質(Lmo Cas9と53%同一)に対して機能的であるかどうかを問うた。このオルソログは、RNAガイドヌクレアーゼとして生物工学的応用のために (Barrangou, R., and Doudna, J. A. (2016), Nature Biotechnology, 34, 933-941)、およびプログラム可能な遺伝子抑制のための触媒不活性化変異体 (dCas9) によるプログラム可能な遺伝子抑制のために(Gilbert, L.A. et al. (2013). Cell 154, 442-451;Qi, L.S. et al. (2013). Cell, 152, 1173-1183)、広く用いられている。Spy dCas9を保有する大腸菌株を用いて、dCas9が染色体RFPレポーター遺伝子の転写を妨げるのをAcrIIAタンパク質が阻止するかどうかを試験した(図5A)。阻害因子を欠く遺伝子背景では、sgRNAおよびdCas9の存在によって、ガイドRNAのない株と比較してRFP蛍光が2.6%まで減少した。acrIIA2はdCas9機能を部分的に阻止し、蛍光発生は25%までである一方、acrIIA4はほぼ完全にdCas9を阻止し、蛍光はガイドなし対照の85%であった(図5B)。acrIIA3は大腸菌に対して毒性であるため、このタンパク質から意味のあるデータを得ることができなかった。これはフローサイトメトリー中に記録された細胞数を減少させ(図10aを参照されたい)、蛍光測定値の大きなばらつきをもたらした。Lmo_acrIIA3と45%の配列同一性を有する化膿性連鎖球菌由来のAcrIIA3の相同体(アクセッション番号:AND04610.1)もまた試験したが、大腸菌の増殖が損なわれた(図10b)。acrIIA3毒性の機構はまだ解明されていない。本発明者らは、acrIIA2およびacrIIA4は大腸菌におけるSpy dCas9を異なる程度まで阻害すると結論づける。
ファージにコードされる細菌免疫系の阻害因子は、これら2つの実体間の進化上の激しい競争における強い選択圧に起因して出現する (Samson, IE. et al. (2013). Nat Rev Micro, 11, 675-687)。I型CRISPR-Casシステムにおいてファージにコードされる抗CRISPRが最初に同定されたことによって、さらなるCRISPR阻害因子が存在することが示唆されたが、それらを発見するための方法は欠如していた。本明細書において、本発明者らは、CRISPR-Cas阻害因子遺伝子のゲノムマーカーとして「自己標的指向」を使用するバイオインフォマティクス戦略を提示する(図1A)。このアプローチにより、4つの異なるII-A型CRISPR-Cas9阻害因子が同定され(図3A)、これらは合わせると、自己標的指向を有する全ゲノムを含む、Cas9をコードする全リステリア・モノサイトゲネスゲノムの半数に存在する(図3C)。本発明者らは、このアプローチが他のCRISPR-Casシステムにおけるacr遺伝子を同定するのに役立つと推定するが、III型システムについては、自己標的指向に対する寛容性のための異なる機構が記載されている(Goldberg, G.W. et al. (2014). Nature 514, 633-637;Samai, P. et al. (2015), Cell, 161, 1164-1174)。
微生物
リステリア・モノサイトゲネス株はブレインハートインフュージョン (BHI) 培地で培養した。大腸菌株はLB培地で培養した。
ヒト胎児腎293+T細胞抗原(HEK293T、CRL-3216、ATCC)細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS、Atlanta Biologicals)および50μg/mL ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S、UCSF CCF)を補充したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) で培養した。
本発明者らは、遺伝子編集に広く用いられるCas9の化膿性連鎖球菌オルソログに対して抗CRISPR機能を有するacrIIA1~4の相同体を同定しようとした(図13)。
Claims (26)
- 細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する方法であって、以下の段階を含み、エクスビボで行われる、方法:
該細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 147~168のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるCas9阻害ポリペプチドを、細胞内に導入し、それによって細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する段階。 - 細胞においてCas9阻害ポリペプチドをCas9ポリペプチドと接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。
- Cas9阻害ポリペプチドがSEQ ID NO: 147~168のアミノ酸配列のうちの1つを含む、請求項1記載の方法。
- 細胞が、前記導入の前にCas9ポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
- 細胞が、Cas9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項4記載の方法。
- プロモーターが誘導性であり、かつ前記方法が、前記導入の前に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む、請求項5記載の方法。
- 細胞が、前記導入の後にCas9ポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
- プロモーターが誘導性であり、かつ前記方法が、前記導入の後に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む、請求項7記載の方法。
- 前記導入が、細胞内に存在しかつ該細胞に対して異種である発現カセットから、該細胞においてCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含み、
該発現カセットが、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、
請求項1記載の方法。 - プロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドの発現を誘導する剤に細胞を接触させることを含む、請求項9記載の方法。
- 前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドをコードするRNAを細胞内に導入すること、および該細胞において該RNAからCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含む、請求項1記載の方法。
- 前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドを細胞内に挿入すること、またはCas9阻害ポリペプチドに細胞を接触させることを含む、請求項1記載の方法。
- 細胞が真核細胞である、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項13記載の方法。
- 細胞がヒト細胞である、請求項14記載の方法。
- 細胞が血液細胞または人工多能性幹細胞である、請求項14~15のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が、前記導入および接触後に非ヒト哺乳動物内に導入されるものである、請求項1~16のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が非ヒト哺乳動物にとって自己のものである、請求項17記載の方法。
- 細胞が原核細胞である、請求項1~12のいずれか一項記載の方法。
- 細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 147~168のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるCas9阻害ポリペプチドを含む、細胞であって、真核細胞である、細胞。
- 細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 147~168のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるCas9阻害ポリペプチドを含む、細胞であって、Cas9ポリペプチドをさらに含む、細胞。
- 真核細胞である、請求項21記載の細胞。
- 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項20または22記載の細胞。
- 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項23記載の細胞。
- 細胞が原核細胞である、請求項21記載の細胞。
- (1) 以下のいずれか1つのポリヌクレオチド、
(i) SEQ ID NO: 147~168のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるCas9阻害ポリペプチドをコードする核酸を含む、ポリヌクレオチド、
(ii) 前記核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、(i)のポリヌクレオチド、
(iii) 前記プロモーターが、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して異種である、(ii)のポリヌクレオチド、
(iv) プロモーターが誘導性である、(ii)または(iii)のポリヌクレオチド、または
(v) DNAまたはRNAである、(i)記載のポリヌクレオチド、
あるいは、
(2) SEQ ID NO: 147~168のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である、単離されたCas9阻害ポリペプチド
を含む、
Cas9を阻害するための薬学的組成物。
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