KR102126481B1

KR102126481B1 - 엔도라이신 항균 활성 최적화를 위한 이스트 디스플레이 발현 체계 구축

Info

Publication number: KR102126481B1
Application number: KR1020180136775A
Authority: KR
Inventors: 전지환; 유상열; 배재우; 장윤지
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-06-25
Also published as: KR20200053730A

Abstract

본 발명은 생명공학기술을 바탕으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 특이적으로 제어하는 박테리오파지 유래 단백질인 엔도라이신을 효모에서 이스트 디스플레이(yeast surface display) 기술로 생산하여, 효모 세포를 직접 병원균에 처리하는 방법으로, 세균 저감 효과를 얻을 수 있는 신규 항균 제제에 관한 것이다.
본 발명은 박테리오파지 자체가 아닌, 엔도라이신 단백질을 사용하여 병원균의 저항성 형성을 방지함으로써, 내성 균주의 확산을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명은 효모를 발현 숙주로 하여 발현된 단백질을 세포 표면에 전개하는 방식을 통해 별도의 분리 정제 과정을 생략함으로써, 생산 공정을 단순화하고, 단백질 활성을 안정적으로 유지하는 효과를 발휘한다.

Description

엔도라이신 항균 활성 최적화를 위한 이스트 디스플레이 발현 체계 구축 {Establishment of Yeast Surface Display Expression System to Optimize Antibacterial Activity of Endolysin}

본 발명은 엔도라이신 항균 활성 최적화를 위한 이스트 디스플레이 발현 체계 구축에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 생명공학기술을 바탕으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 특이적으로 제어하는 박테리오파지 유래 단백질인 엔도라이신을 효모에서 이스트 디스플레이(yeast surface display) 기술로 생산하여, 효모 세포를 직접 병원균에 처리하는 방법으로, 세균 저감 효과를 얻을 수 있는 신규 항균 제제에 관한 것이다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람 양성의 통성혐기성 균이며, 다양한 환경에서 발견되는 병원균으로, 인수공통으로 감염을 일으켜 패혈증, 농양, 독소 증후군 등 심각한 질환을 야기할 수 있다. 황색포도상구균은 병원성뿐만 아니라, 광범위한 항생제 사용으로 인한 내성 균주의 출현 (대표적으로 메티실린 저항성 포도상구균, Methicillin-resistant S. aureus (MRSA))으로 인한 피해를 야기하고 있다. 이를 효과적으로 제어하기 위하여 항생제 대체재의 개발이 진행중이며, 균주 특이성을 갖는 박테리오파지(bacteriophage)가 유력한 대안으로 주목받고 있다.

박테리오파지는 숙주 내부에서 유전물질을 증폭한 이후 새로운 개체들로 증식하고, 숙주의 세포벽을 용해하여 외부로 용출되는 일련의 과정을 거치는데, 이때 세포벽을 용해하기 위해 엔도라이신(endolysin)이라는 단백질을 사용한다. 엔도라이신은 박테리오파지와 마찬가지로 균주 특이성을 가지며, 세균의 세포벽 중에서도 펩티도글라이칸(peptidoglycan) 구조를 분해하는 성질을 지닌다. 이러한 특성에 기인하여 엔도라이신을 그람 양성균에 처리함으로써 사멸 효과를 보이는 연구들이 수행되어왔다.

대부분의 선행 연구에서는 엔도라이신을 대장균(Escherichia coli)에 클로닝(cloning) 하여 발현 및 생산하고, 이 발현 숙주(expression host)를 용해하여 단백질을 추출한 이후, 어피너티 바인딩(affinity binding), 멤브레인 축합(membrane condensation) 등의 과정을 거쳐 정제, 농축한 결과물을 사용하였다. 또한, 이러한 과정을 통해 확보된 엔도라이신을 안정적으로 보관하기 위해서는 글리세롤을 함유한, 단백질 변성을 최소화하는 조건의 버퍼로 교환하여야만 하였다. 이에, 엔도라이신을 실험실 수준에서 활용하는 방법에 관한 연구는 활발히 수행되었던 반면, 위와 같은 공정을 산업에 적용하는 것에는 어려움이 있어왔다.

또한, 종래 항생제 대체재로서의 박테리오파지 연구는 병원균이 박테리오파지에 대한 저항성을 형성하는 문제 때문에, 박테리오파지를 칵테일로 혼합하는 방법으로 항균 효과를 개선하거나, 강력한 항균 능력을 보유하는 신규 박테리오파지를 발굴하는 방식으로 저항성 문제를 해결할 뿐이었다. 또한, 기존 엔도라이신 연구 및 활용 기술에서는 생산량 및 분리 정제 공정의 효율성 문제와 정제 단백질의 안정성 문제가 대두되고 있는 실정이다.

한편, 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 가장 단순한 진핵생물의 하나로, 생명과학 연구에서 모델 생물(model organism)로 널리 사용되고 있다. 특히, 외래 유전자를 발현하여 단백질을 생산하고 엔지니어하는 연구가 다양하게 진행되고 있는데, 항체 엔지니어링 연구에서 널리 사용되는 기법으로 이스트 표면 디스플레이(yeast surface display, YSD)가 존재한다.

이는 1997년 Dane Wittrup에 의해 고안된 이스트 발현 시스템 (yeast expression system)으로, 본래 효모 세포가 교배(mating)에 사용하기 위해 세포 표면에 발현하는 앵커 단백질(anchor protein)인 Aga2p를 개량하여, 목적 단백질이 Aga2p와 복합체를 이루어 Aga2p의 C-terminal region에 결합된 형태로 발현되도록 클로닝함으로써, 이스트 세포 표면에 해당 단백질이 전개된 결과물을 얻는 기술이다.

이때, 항체의 random mutant library를 사용하여, 항원에 높은 어피니티를 갖는 항체를 디스플레이하고 있는 효모 세포주를 선별하여 단백질 공학을 이루어낼 수 있다. 항체 엔지니어링 이외에도, 대사효소(metabolic enzyme)를 YSD를 통해 발현하여 부동화(immobilization) 효과를 노리거나, 바이오 에탄올(bioethanol) 등의 바이오매스 생산성을 향상시키는 방향으로 연구가 진행된 바 있다.

그러나 YSD에 기반하여 항균 제제를 만드는 연구는 보고된 바가 없다. 비록 바이오 에탄올 생산 과정에서, 효모에서 엔도라이신을 생산하여 세균 감염에 의한 오염을 억제하는 연구가 보고되기는 하였으나, 이는 단순히 엔도라이신을 발현한 효모를 사용했을 뿐, YSD를 사용하지 않았고, 그 대상 또한 병원균이 아니었다는 점에서 본 발명과 차이를 보인다.

대한민국등록특허 제10-1796279호(2017.11.03)에는, 새로운 호스트 바인딩 도메인을 갖는 포도상구균 박테리오파지 SA11 유래의 엔도라이신 LysSA11 및 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물에 관하여 기재되어 있다. 대한민국등록특허 제10-1001023호(2010.12.07)에는, 효모 표면 발현 시스템을 이용한 파스튜렐라증 치료 또는 예방용 백신에 관하여 기재되어 있다.

본 발명은 숙주 특이성을 갖는 박테리오파지 유래 단백질인 엔도라이신(endolysin)을 이스트 표면 디스플레이(yeast surface display) 기술을 활용하여 효모(Saccharomyces cerevisiae) 세포에서 발현시키고, 최적 효소 활성을 나타낼 수 있는 단백질 결합방향을 고려하여 세포 표면에 전개함으로써, 별도의 단백질 추출, 정제 공정 없이 효모 세포를 대상 병원균에 처리함에 따라 사멸 효과를 보이는 신규 항균 제제 생산 기술을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다.

본 발명의 발현 카세트에 있어, 상기 프로모터는, 바람직하게 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 구성된 GAL1-GAL10 프로모터인 것이 좋다.

본 발명의 발현 카세트에 있어, 상기 Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자는, 바람직하게 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 구성된 것이 좋다.

본 발명의 발현 카세트에 있어, 상기 엔도라이신 암호화 유전자는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 구성된 LysSA11 엔도라이신 암호화 유전자인 것이 좋다.

본 발명의 발현 카세트에 있어, 상기 Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자는, 바람직하게 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 구성된 것이 좋다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드를 제공하는데, 본 발명의 상기 플라스미드는, 바람직하게 pYD5인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 제공하는데, 상기 재조합 효모는, 바람직하게 항균 활성이 부여된 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 효모에 있어, 상기 항균 활성은, 바람직하게 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성일 수 있다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 포함하는 사료 첨가제 또는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 박테리오파지 자체가 아닌, 엔도라이신 단백질을 사용하여 병원균의 저항성 형성을 방지함으로써, 내성 균주의 확산을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명은 효모를 발현 숙주로 하여 발현된 단백질을 세포 표면에 전개하는 방식을 통해 별도의 분리 정제 과정을 생략함으로써, 생산 공정을 단순화하고, 단백질 활성을 안정적으로 유지하는 효과를 발휘한다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 벡터의 모식도이다.
도 2는 실시예 1에서 제조한 항균 효모 세포주의 용균 활성 효과를 나타낸 결과이다 (ATCC 13301: Staphylococcus aureus ATCC 13301, pCTCON: 엔도라이신 유전자를 도입하지 않은 pCTCON을 삽입한 S. cerevisiae EBY100, pCTCON_LysSA11: 엔도라이신 유전자를 도입한 pCTCON을 삽입한 S. cerevisiae EBY100).
도 3은 실시예 2에서 제조한 백터의 모식도이다.
도 4는 본 발명 항균 미생물 세포주의 구축 및 검증 방법을 보여주는 모식도이다.
도 5는 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주의 용균 활성 효과를 나타낸 결과이다 (ATCC 13301: Staphylococcus aureus ATCC 13301, pYD5: 엔도라이신 유전자를 도입하지 않은 pYD5를 삽입한 S. cerevisiae EBY100, pYD5_LysSA11: 엔도라이신 유전자를 도입한 pYD5를 삽입한 S. cerevisiae EBY100).
도 6은 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주에서의 엔도라이신-앵커 프로테인 복합체의 발현을 확인한 결과이다.
도 7은 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주에서의 엔도라이신 세포 표면 전개를 확인한 결과이다.
도 8은 냉장 조건에서 보관 기간에 따른 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주의 용균 활성을 확인한 결과이다.

기존의 박테리오파지를 활용한 항균 제제는 2종 이상의 박테리오파지를 혼합하여 구성되는데(phage cocktail), 이는 숙주 세균이 박테리오파지에 대항하여 저항성을 형성하는 점을 최소화하기 위함이다. 그러나 박테리오파지 자체를 사용하는 이상, 필연적으로 숙주 세균은 변이를 통해 저항성을 획득하는 문제가 발생한다.

한편, 파지 유래 항균 단백질인 엔도라이신은 최적 활성 조건에서 멸균 능력이 우수한 경우가 다수 보고된 바 있다. 그러나 단백질의 생산, 추출, 정제, 농축 과정이 매우 노동 집약적이며, 대량 생산에 적합하지 않은 단점이 있다. 또한, 순수 단백질은 보관 및 최적 활성 유지가 어렵기 때문에, 항균 제제로써 사용시 pH 및 염 농도가 최적화된 버퍼에 희석하여야 하며, 보관 시 글리세롤이 포함된 버퍼로 치환하여야 한다. 심지어, 글리세롤을 첨가한 버퍼에 보관하더라도, 재사용시 다시 최적 활성 버퍼로 치환이 필요하며, 일련의 과정에서 엔도라이신의 효소 활성이 심각하게 저해되므로 상업화를 위해서는 이러한 특성을 보완할 필요가 있었다.

이에, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공하고자 한다. 본 발명의 발현카세트는 상기와 같은 구성요소들을 포함하여 이루어지는데, 필요에 의해 당업계에서 널리 활용되고 있는 여타의 구성요소를 더 포함할 수도 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "발현카세트(expression cassette)"는 자체적으로 발현되는데 필요한 요소를 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드 구조체를 의미한다.

본 발명의 발현 카세트에 있어, 상기 프로모터는, 바람직하게 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 구성된 GAL1-GAL10 프로모터인 것이 좋고, 상기 Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자는, 바람직하게 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 구성된 것이 좋으며, 상기 엔도라이신 암호화 유전자는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 구성된 LysSA11 엔도라이신 암호화 유전자인 것이 좋고, 상기 Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자는, 바람직하게 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 구성된 것이 좋다.

본 발명의 실험에 의할 경우, LysSA11 엔도라이신을 앵커 단백질의 C-말단에 결합되도록 설계하면, 세균 사멸효과가 대조군들에 비해 우수한 것으로 나타나지 않았다. 이는 엔도라이신을 YSD 기술로 발현할 경우, 엔도라이신과 앵커 단백질의 오리엔테이션(orientation)이 효소 활성 (항균 활성)에 지대한 영향을 미치는 것을 의미하는 것으로, 엔도라이신 단백질의 구조적 특성을 고려하였을 때, 앵커 단백질의 C-말단에 엔도라이신을 결합하는 방법은 효소 활성 (항균 활성)을 극대화하기 어려운 배치임을 하기 실시예 1에서 확인한 것이다. 따라서, 본 발명자는 이를 보완하여 본 발명과 같은 엔도라이신의 특성에 최적화된 앵커-엔도라이신 구조를 고안한 것이다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 발현 카세트가 삽입된 플라스미드를 제공하는데, 본 발명의 상기 플라스미드는, 바람직하게 pYD5인 것이 좋다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 제공하는데, 상기 효모는 일 예로, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

한편, 상기 재조합 효모는, 본 발명에서와 같은 재조합 과정을 통해 엔도라이신을 함유하게 되어, 항균 활성이 부여되어 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 효모는 항균제로 사용될 수 있는 것이다. 본 발명의 재조합 효모에 있어, 상기 항균 활성은, 바람직하게 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성인 것일 수 있다.

재조합 효모, 즉 재조합 사카로마이세스 세레비지애에서는 GAL1-GAL10 프로모터에 의해 발현이 유도되고, 순서대로 Aga2p 앵커 단백질의 시그널 펩타이드, 엔도라이신, Aga2p 앵커 단백질의 머튜어 펩타이드(mature peptide, 효모 세포 표면에 결합한다)가 결합된 형태로 단백질이 합성된다. 이후, 효모 세포의 외부로 단백질이 운반되는 과정에서 엔도라이신의 N-말단에 결합된 Aga2p 시그널 펩타이드는 제거된다. 이를 통해 엔도라이신은 효모 표면에 그 활성을 나타내기에 적절한 위치로 배향되어 앵커링(anchoring)될 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용한 LysSA11은 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 SA11에서 유래한 엔도라이신으로, 단백질의 N-말단에 CHAP(cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases) 도메인과 C-말단에 CBD(cell-wall binding domain)가 위치한 구조를 갖는다. 이 구조에서, CHAP 도메인이 세균 세포벽의 펩티도글리칸을 용해하는 기능을 나타낸다.

본 발명에서 구축된 재조합 효모는 약 36시간 배양한 결과, 70% 이상의 효모 세포가 표면에 높은 농도로 엔도라이신을 발현하고 있음을 확인하였다. 이후, 별도로 세포의 용해 및 단백질의 추출, 정제 과정을 거치지 않고, 단순히 세포를 원심분리하여, 배양액을 제거하고, 엔도라이신의 최적 활성 버퍼로 치환하는 과정을 통해 항균 미생물 제제를 생산할 수 있었다.

본 발명에서는 이 재조합 효모를 사용하여 4시간 이내에 1.15×10⁵마리의 황색포도상구균을 사멸할 수 있으며, 그 효과가 10시간 이상 길게 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 재조합 효모를 별도의 storage buffer(일반적으로 단백질 변성을 방지하기 위하여 glycerol 이 포함됨)가 아닌, 당초 사용한 엔도라이신 최적 활성 버퍼 상에서 4℃에 보관할 경우 14일 이상 그 활성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 재조합 효모는 항균 미생물 제제로서의 용도를 가지며, 간소화된 공정을 토대로 생산 효율성을 향상시키는 특징이 있는 것이다. 또한, 세포 표면에 엔도라이신을 전개하는 방식으로 단백질 활성을 안정적으로 유지함으로써 보관상의 문제를 해결하여, 산업용 항균 제제로의 활용 가능성을 제시한다. 특히, 본 발명의 재조합 효모를 활용하여 새로운 항생제 내성균의 출현을 억제함으로써 지속 가능한 항균 효과를 기대할 수 있다. 또한, 효모 즉 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)는 FDA에서 지정한 GRAS(Generally Regarded As Safe) 생물이기 때문에, 안전한 산업용 항균 제제로 활용될 수 있다. 즉, 본 발명에서는 본 발명의 구성을 통해, 병원균의 저항성 형성을 방지함으로써, 내성 균주의 확산을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명은 효모를 발현 숙주로 하여, 발현된 단백질을 세포 표면에 전개하는 방식을 통해 별도의 분리 정제 과정을 생략함으로써, 생산 공정을 단순화하고, 단백질 활성을 안정적으로 유지할 수 있는 것이다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 본 발명의 균주를 함유하기만 하면, 그 제형에 특별히 국한되지 않으나, 대상 식품은 포도상구균에 의해 오염되기 쉬운 식품이면 더욱 적용 가능하다.

한편, 본 발명의 식품 조성물은 일 예로, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 사탕, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 유제품류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 본 발명의 균주를 함유하기만 하면, 그 제형에 특별히 국한되지 않는다.

또한, 본 발명의 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이 중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 약학 조성물이 약제인 경우, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPENSIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 상기 약학 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.00001 내지 100㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.

한편, 본 발명은 5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 프로모터, Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 엔도라이신 암호화 유전자, Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 발현 카세트가 삽입된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 포함하는 사료 첨가제 또는 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 첨가제 또는 사료 조성물은 본 발명의 엔도라이신 LysSA11을 함유하기만 하면, 그 제형에 특별히 국한되지 않는다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

< 실시예 1: 엔도라이신이 앵커 단백질의 C-말단에 위치한 항균 효모 세포주의 구축>

상용 벡터인 pCTCON 플라스미드에 엔도라이신 유전자 LysSA11 (서열번호 3)를 삽입하고자 하였는데, pCTCON 내에 존재하는 앵커 단백질 Aga2p의 C-말단에 엔도라이신 유전자 LysSA11를 삽입하여 pCTCON_LysSA11 플라스미드 제조하였다 (도 1). 이후, 이를 클로닝 호스트인 대장균 (chemically competent E. coli)에 42℃에서 heat-shock 형질전환(transformation)하고, 1㎖의 SOC(Super Optimal broth with Catabolite repression) 배지를 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 220 rpm의 속도로 배양한 후, 100㎍/㎖ 농도의 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 아가 배지에 스프레드(spread)한 것을 37℃의 정치배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 도 1은 본 실시예 1에서 제조한 벡터의 모식도이다.

배양 후, 배지 상에 형성된 대장균 군락을 무작위로 취하여 PCR을 거쳐 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하고, 염기서열을 분석하여 엔도라이신 유전자가 정상적으로 도입된 균주를 선별하였다. 이후, 선별된 균주를 100㎍/㎖ 농도의 암피실린이 첨가된 3㎖의 LB 배지에 투입하여 37℃에서 220 rpm으로 12시간 동안 배양하고, 플라스미드 미니 프렙 (plasmid mini prep)을 통해 플라스미드를 추출하였다.

이를 사카로마이세스 세레비지애 (chemically competent S. cerevisiae) EBY100 숙주에 42℃에서 heat-shock 형질전환(transformation)하고, 1㎖의 YPD(Yeast extract Peptone Dextrose) 배지를 첨가하여 1시간 동안 30℃에서 250rpm의 속도로 배양한 이후, 트립토판이 결여된 SDCAA(2% glucose) 아가 배지에 스프레드하여 30℃에서 72시간 동안 배양하였다.

한편, 배지 상에 형성된 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 군락을 무작위로 취하여 PCR과 염기서열 분석을 통해 엔도라이신 유전자가 정상적으로 도입된 세포주를 선별하였다. 본 실험에서는 엔도라이신 유전자를 도입하지 않은 벡터를 음성대조군으로 사용하였다.

한편, 상기 본 발명에서 사용한 발현 숙주는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) EBY100 세포주로, 미국 ATCC(American Type Culture Collection)에서 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) MYA-4941이라는 번호로 관리중인 것을 분양받아 사용하였다. 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) EBY100 세포는 앵커 단백질 Aga2p와 이황화 결합을 형성하는 Aga1p를 세포벽에 발현하며, 트립토판(tryptophan) 영양요구균주이다.

이상과 같이 형질전환된 균주를 가지고, 세균 사멸효과를 확인하는 실험을 수행하고자 하였다. 항균 활성의 실험은 하기 실험예 1에 기재된 방법으로 수행하였다.

실험 결과는 도 2와 같이 나타났는데, 도 2에서 보는 바와 같이 LysSA11 엔도라이신을 발현한 효모 세포를 대상 세균에 처리하였을 때, 가시적인 세균 사멸 효과를 확인하기 어려웠다. 도 2는 실시예 1에서 제조한 항균 효모 세포주의 용균 활성 효과를 나타낸 결과이다 (ATCC 13301: Staphylococcus aureus ATCC 13301, pCTCON: 엔도라이신 유전자를 도입하지 않은 pCTCON을 삽입한 S. cerevisiae EBY100, pCTCON_LysSA11: 엔도라이신 유전자를 도입한 pCTCON을 삽입한 S. cerevisiae EBY100).

본 실험에 사용된 플라스미드는 LysSA11 엔도라이신이 앵커 단백질의 C-말단에 결합되도록 설계된 pCTCON 플라스미드인데, 도 2에서 보는 바와 같이 세균 사멸효과가 대조군들에 비해 우수한 것으로 나타나지 않았다. 이는 엔도라이신을 YSD 기술로 발현할 경우, 엔도라이신과 앵커 단백질의 오리엔테이션(orientation)이 효소 활성 (항균 활성)에 지대한 영향을 미치는 것을 의미하는 것으로, 엔도라이신 단백질의 구조적 특성을 고려하였을 때, 앵커 단백질의 C-말단에 엔도라이신을 결합하는 방법은 효소 활성 (항균 활성)을 극대화하기 어려운 배치이므로, 이를 보완하여 엔도라이신의 특성에 최적화된 앵커-엔도라이신 구조를 고안해야 할 필요가 있음을 의미한다.

< 실시예 2: 본 발명의 항균 효모 세포주의 구축>

엔도라이신의 특성에 최적화된 앵커-엔도라이신(anchor-endolysin) 구조를 고안하기 위하여, 벡터를 pYD5 플라스미드(Wang, Z., et al. (2005). "A new yeast display vector permitting free scFv amino termini can augment ligand binding affinities." Protein Engineering, Design and Selection 18(7): 337-343.)로 교체하여 하기와 같이 형질전환을 시도하였다. 상기 실시예 1에서 사용한 pCTCON 플라스미드는 앵커 단백질인 Aga2p가 시그날 펩타이드와 머튜어 펩타이드로 나눠지지 않은 것인데, pYD5 플라스미드는 Aga2p가 시그날 펩타이와 머튜어 펩타이드로 분리되어 있어, 그 사이에 엔도라이신 유전자 LysSA11을 삽입할 수 있는 장점이 있다.

즉, LysSA11의 5' 말단부가 pYD5 플라스미드 상의 Aga2p 시그널 펩타이드 염기서열의 3' 말단부에 연결되고, 엔도라이신 염기서열의 3' 말단부 이후로 에피토프(epitope), 링커 펩타이드(linker peptide), Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide)의 염기서열이 순차적으로 배치되도록 삽입하여 pYD5_LysSA11을 구축한 것이다 (도 3). 도 3은 실시예 2에서 제조한 백터의 모식도이다.

한편, 하기 표 1은 본 실시예 2에서 사용한 유전자들의 서열번호를 나타낸 것이다.

실시예 2의 벡터 구축에 이용된 유전자 서열

유전자 명칭	핵산 서열
GAL1-GAL10 promoter	서열번호1
Aga2p signal peptide	서열번호2
LysSA11	서열번호3
Aga2p mature peptide	서열번호4

상기에서 제조한 벡터를 대장균 (chemically competent E. coli) 숙주에 42℃에서 heat-shock 형질전환(transformation)하고, 1㎖의 SOC(Super Optimal broth with Catabolite repression) 배지를 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 220 rpm의 속도로 배양한 이후, 100㎍/㎖ 농도의 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 아가 배지에 스프레드(spread)한 것을 37℃의 정치배양기에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지 상에 형성된 대장균 군락을 무작위로 취하여 PCR을 거쳐 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하고, 염기서열을 분석하여 엔도라이신 유전자가 정상적으로 도입된 균주를 선별하였다.

이후, 선별된 균주를 100㎍/㎖ 농도의 암피실린이 첨가된 3㎖의 LB 배지에 투입하여 37℃에서 220 rpm으로 12시간 동안 배양하고, 플라스미드 미니 프렙 (plasmid mini prep)을 통해 플라스미드를 추출하였다. 이를 사카로마이세스 세레비지애 (chemically competent S. cerevisiae) EBY100 숙주에 42℃에서 heat-shock 형질전환(transformation)하고, 1㎖의 YPD(Yeast extract Peptone Dextrose) 배지를 첨가하여 1시간 동안 30℃에서 250rpm의 속도로 배양한 이후, 트립토판이 결여된 SDCAA(2% glucose) 아가 배지에 스프레드하여 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배지 상에 형성된 사카로마이세스 세레비지애 군락을 무작위로 취하여 PCR과 염기서열 분석을 통해 엔도라이신 유전자가 정상적으로 도입된 세포주를 선별하였다. 본 발명에서는 pYD5 플라스미드에 엔도라이신 유전자를 도입하지 않은 벡터를 음성대조군으로 사용하였다.

< 실험예 1: 항균 효모 세포주의 검증 및 용균 활성 확인>

(1) 효모 세포주의 용균 활성 확인

대상 세균인 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus , S. aureus)에 대한 용균 활성을 확인하기 위해 36시간 동안 SGCAA(2% galactose)에서 배양한 효모를 15㎖ 취하여 25℃에서 6,000 x g의 속도로 5분간 원심분리하고, 동일 부피의 엔도라이신 활성 버퍼(100mM phosphate, 200mM NaCl, pH 7.4)로 1회 세척한 다음, 10⁹ CFU(colony forming unit)/㎖의 농도로 상기 버퍼에 재부유하였다.

황색포도상구균은 3㎖의 TSB(tryptic soy broth)에서 단일 군집(single colony)을 37℃에서 220 rpm의 속도로 12시간 동안 배양한 것을 3㎖의 TSB에 2시간 동안 계대 배양하여 10⁸ CFU/㎖의 농도로 배양된 것을 1㎖ 취하여 상기 버퍼로 3회 세척하고, 상기 버퍼에 연속 희석하여 10⁶ CFU/㎖의 농도로 만들었다. 이를 100㎕씩 효모 부유액에 혼합하여 최종적으로 1㎖에 10⁵ CFU/㎖ 황색포도상구균과 10⁹ CFU/㎖ 사카로마이세스 세레비지애가 포함된 혼합물을 만들고, 로타리믹서(rotary mixer)에서 20 rpm으로 25℃, 5시간 동안 반응시키면서, 매 30분 간격으로 샘플링하여 황색포도상구균 선택 배지인 Baird-Parker 아가에 돗팅(dotting)하고, 이를 37℃에서 16시간 동안 정치 배양한 것으로부터 황색포도상구균 군락을 계수하여 시간에 따른 용균 활성을 확인하였다 (도 4). 대조군으로는 pYD5 벡터에 엔도라이신 유전자를 도입하지 않은 효모 세포주 및 황색포도상구균의 혼합물, 황색포도상구균만 버퍼에 10⁵CFU/㎖의 농도로 재부유한 것을 각각 사용하였다. 도 4는 본 발명 항균 미생물 세포주의 구축 및 검증 방법을 보여주는 모식도이다.

실험 결과, 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주의 처리는, 3.5시간 이내에 1×10⁵의 황색포도상구균이 모두 사멸되고, 5시간까지 그 상태가 유지됨으로써, 용균활성을 갖는 것을 알 수 있었다. 그러나, 엔도라이신을 전개하지 않은 효모와 반응시킨 경우 및 효모와 반응시키지 않은 경우는, 모두에서 초기의 황색포도상구균의 수가 유지되는 것을 확인하였다 (도 5). 도 5는 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주의 용균 활성 효과를 나타낸 결과이다 (ATCC 13301: Staphylococcus aureus ATCC 13301, pYD5: 엔도라이신 유전자를 도입하지 않은 pYD5를 삽입한 S. cerevisiae EBY100, pYD5_LysSA11: 엔도라이신 유전자를 도입한 pYD5를 삽입한 S. cerevisiae EBY100).

(2) 형질 도입된 효모 세포주의 검증

실시예 2에서 선별된 효모 세포주를 5㎖의 SDCAA(2% glucose) 배지에 투입하여 30℃에서 250 rpm으로 24시간 동안 배양하고, 이를 20㎖의 SDCAA 배지에 옮겨 동일 조건으로 계대 배양한 이후, 50㎖의 SDCAA 배지에서 동일 조건으로 최종 계대 배양하였다. 다음으로, 배양액의 효모 세포를 25℃에서 6,000 x g의 속도로 5분간 원심분리하고, 이를 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 2회 세척한 이후, 50㎖의 SGCAA(2% galactose) 배지에 투입하여 30℃에서 250 rpm으로 36시간 동안 배양하였다.

이후, 배양액에서 효모 세포를 취하여 25℃에서 6,000 x g의 속도로 5분간 원심분리하고, 상기 세포를 Y-PER Yeast Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific^TM)을 사용하여 용해하고 단백질을 추출하여 가용성 단백질만을 12% SDS-PAGE gel에 전기영동하여 면역블러팅(immunoblotting)기법으로 확인하였다. 그 결과, GAL1-GAL10 프로모터(promoter)가 정상적으로 기능하여 엔도라이신-앵커 프로테인 복합체가 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 도 6은 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주에서의 엔도라이신-앵커 프로테인 복합체의 발현을 확인한 결과이다.

또한, 상기 세포를 PBSA (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA in PBS)로 고정하고 FITC를 포함하는 항체로 표지하여 Navios flow cytometer (Beckman Coulter)로 고속유세포분석을 수행함으로써, 평균적으로 70% 이상의 효모에서 세포 표면에 엔도라이신 단백질이 전개되어있음을 확인할 수 있었다 (도 7). 도 7은 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주에서의 엔도라이신 세포 표면 전개를 확인한 결과이다.

< 실험예 2: 항균 효모 세포주의 엔도라이신 안정성 확인>

버퍼 상에서 효모 세포에 전개된 엔도라이신의 효소 활성이 얼마나 안정적으로 유지되는지 확인하기 위하여 실험예 1의 (1)에서 수득한 효모의 재부유물을 4℃에서 각각 4, 7, 14일 동안 보관한 것을 가지고, 상기 실험예 1의 (1)과 동일한 방법으로 용균 활성을 확인하였다.

실험 결과, 각 보관 기간에 무관하게 실시예 2의 엔도라이신 전개 효모와 반응시킨 1×10⁵의 황색포도상구균이 3.5시간 이내에 모두 사멸되고 그 수가 다시 회복되지 않았다. 이와 같은 결과를 토대로, 엔도라이신 전개 효모의 용균 활성이 보존 기간의 경과에 따라 줄어들지 않고, 효모 표면에 전개된 엔도라이신의 효소 활성도 매우 안정적으로 유지됨을 알 수 있었다 (도 8). 도 8은 냉장 조건에서 보관 기간에 따른 실시예 2에서 제조한 항균 효모 세포주의 용균 활성을 확인한 결과이다.

< 제제예 1: 엔도라이신 단백질을 효모 세포 표면에 전개한 항균 미생물 액상제제의 제조>

실험예 1의 (1)에서 재부유한 효모 세포를 원심분리하여 상등액을 제거하고, 효소 활성 버퍼(100mM phosphate, 200mM NaCl, pH 7.4)로 1회 세척한 이후 1×10⁹ CFU/㎖의 농도로 상기 버퍼에 재부유하여 항균 미생물 액상 제제를 제조하였다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Establishment of Yeast Surface Display Expression System to Optimize Antibacterial Activity of Endolysin <130> YP-18-179 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 451 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60 cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120 acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180 ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240 ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300 taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360 ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420 ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac c 451 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgcagttac ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg ctagcgtttt agca 54 <210> 3 <211> 756 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> This is from Staphylococcus virus SA11 <400> 3 atgaaagcat cgatgactag aagtgaattt gttcgatttt taaaaagtct agaaggcaaa 60 gcaatagact ttgatggttg gtatggtcag caatgttacg acttagctaa ctatggattt 120 aacaagctct tcccaggtta ttctttaggt ggagcaagtg catgtaacat tccatgggat 180 aataaagcta tgttaaaaga taaagctaga gtagtagaaa atacactatc ctacattcct 240 aaaccaggca ctatggttat ctttaataat tcatacgggg gcggtcatgg tcatgtcgca 300 tgggtactaa gtgcaaacca aaaccaaatt atagtaattg aaaataattg gttaggtgga 360 ggttggactt ggggagatgc tcaaggaggc ggtggctggg agaaagctac cgttagagcc 420 catggttacg actttcctat gtggtttata gaacctaatt tcaaagacga ggtacaaaca 480 acttggaatt ggggaggtaa atttactgct gatagaacga ttaaggtaag acgcacacca 540 ggtttaaggg gttcaatagt aggtgctgaa tcatttattt atagtggtca atatgtaaac 600 tttgaccaag ttattaaagt agacggctat tggtggatta gatttaaata tcctacaaac 660 ccgtcagctg ggaacttcta tatggcagta tgtaaaatca ctgacaagtg ggaacgtatg 720 ctaaaagaga agtattgggg tcgtattaac tggaaa 756 <210> 4 <211> 207 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 caggaactga caactatatg cgagcaaatc ccctcaccaa ctttagaatc gacgccgtac 60 tctttgtcaa cgactactat tttggccaac gggaaggcaa tgcaaggagt ttttgaatat 120 tacaaatcag taacgtttgt cagtaattgc ggttctcacc cctcaacaac tagcaaaggc 180 agccccataa acacacagta tgttttt 207

Claims

5' 말단에서 3' 말단 방향으로, 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 구성된 GAL1-GAL10 프로모터, 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 구성된 Aga2p 시그널 펩타이드 암호화 유전자, 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 구성된 LysSA11 엔도라이신 암호화 유전자, 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 구성된 Aga2p 머튜어 펩타이드(mature peptide) 암호화 유전자가 일렬로 연결되어 구성된 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모를 생산하기 위한 발현 카세트.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항의 발현카세트가 삽입된 플라스미드.
제6항에 있어서,
상기 플라스미드는,
pYD5인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
제6항에 기재된 플라스미드로 형질전환되어, 표면에 엔도라이신을 디스플레이(display)할 수 있는 재조합 효모.
제8항에 있어서,
상기 재조합 효모는,
항균 활성이 부여된 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
제9항에 있어서,
상기 항균 활성은,
황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
제8항의 재조합 효모를 포함하는 항균용 약학 조성물.
제8항의 재조합 효모를 포함하는 식품 조성물.
제8항의 재조합 효모를 포함하는 사료 첨가제 또는 사료 조성물.