KR101788401B1 - 항생제 내성을 갖는 슈도모나스 균속을 용균하는 박테리오파지 - Google Patents

항생제 내성을 갖는 슈도모나스 균속을 용균하는 박테리오파지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 강력한 항균제인 카바페넴(carbapenem)에 대한 내성을 보이는 슈도모나스 균속을 용균시키는 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 신규한 박테리오파지는 강력한 항균제인 카바페넴 내성 슈도모나스 균속에 대하여 특이적 사멸능을 가지므로, 상기한 카바페넴 내성 슈도모나스 균속에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 활용할 수 있다.

Description

항생제 내성을 갖는 슈도모나스 균속을 용균하는 박테리오파지{Lytic bacteriophage specific for Pseudomonas genus resistant to antibiotics}
본 발명은 항균제 중에서도 특히 카바페넴(carbapenem)에 대한 내성을 보이는 슈도모나스 균속을 용균시키는 박테리오파지에 관한 것이다.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 간균으로 포도당 비발효 세균이다. 이들은 토양, 물, 하수 등을 포함한 자연환경, 사람의 피부, 구강, 호흡기계 점막 등에 상재균으로 분포한다. 이들 세균은 신생아, 비장 절제술 시행 환자, 장기간 스테로이드를 투여한 환자, 항암 치료 중인 암환자, 장기 이식 환자, 집중치료실 환자와 같은 면역력이 저하된 고위험군 환자에서의 내인성 기회감염을 일으키는 중요한 병원성 세균이다 [비특허문헌 1].
녹농균이 일으키는 원내 감염증으로는 폐렴, 화상 환자에서의 감염, 뇌수막염, 심내막염 및 균혈증 등이 있고, 인공호흡기, 혈관 내 침습적 조작술, 침구류 및 의료진의 손을 통한 원내 집단 발병이 보고되고 있다 [비특허문헌 2]. 특히, 항암 치료 등으로 인한 면역저하환자가 증가하고 있는 환경에서 녹농균 감염은 호흡기에서 30 내지 60%, 패혈증에서 80 내지 100%의 높은 사망률을 보임이 보고되어 있다.
이들의 국내 분리 빈도는 2007년 7월부터 9월까지 세브란스 병원 자료에 의하면 녹농균 1,114주가 분리되어 가장 빈번한 병원균이었다 (항균제 내성 소식지 59호, www.whonet.org). 2004년 국내 44개 병원 검사실과 1개 지역사회 검사실이 참여한 KONSAR 그룹의 조사 자료에 의하면 Pseudomonas가 전체 원내 분리 병원균 중 Staphylococcusaureus (20.2%), Escherichiacoli(17.7%)에 이어 13.3%가 분리되어 3번째로 흔하였다 [비특허문헌 3].
한편, 카바페넴(carbapenem)은 그 항균 범위가 가장 넓고, ESBL이나 AmpC β-락타마제를 포함한 클래스 A, D 및 D β-락타마제에 안정한 가장 강력한 β-락탐 항균제에 해당한다. 그런데 현재 국내뿐만 아니라 세계적으로 카바페넴(carbapenem) 제제조차 내성을 보이는 다제 내성(multidrug resistant) 녹농균에 의한 감염이 증가하고 있어서 임상적으로 커다란 문제가 되고 있다.
감염증 환자를 감수성을 보이는 항생제로 적절한 치료를 하는 경우 약 90%의 양호한 예후를 기대할 수 있고, 내성을 보이는 항생제로 치료하는 경우는 약 60% 밖에 반응하지 않았다. 이들 세균에 사용할 수 있는 약제는 콜리스틴(colistin), 티제사이클린(tigecyclin)이 남아 있는 실정이나 약제의 부작용 혹은 고가로 인해 그 사용에 어려움이 많다. 더군다나 새로운 항생제 개발이 이미 한계에 도달하고 있으므로 앞으로도 개선의 여지는 매우 적다고 사료된다. 이로써 판단하여 볼 때 항생제 내성 세균의 증가는 광범위한 침습적 시술, 항암 요법, 장기이식 등으로 면역저하 환자가 필연적으로 발생하는 현대 의학의 근간을 흔드는 심각한 문제라고 판단된다.
과거 1960년대와 1970년대 초반까지 항생제 개발에 괄목할 만한 많은 성과가 있었고, 이를 통하여 많은 감염증이 치료되었다. 그러나 40 여년이 지나고 있는 요즘 감염병은 전세계적으로 2번째 흔한 사인이자 [비특허문헌 4], 미국 내에서는 3번째 사인으로 보고되어서 [비특허문헌 5] 그 심각성이 줄어들지 않고 있다. 더군다나 최근 여러 항생제에 내성인 세균이 출현, 증가하고 있어서 약제 선택의 폭이 현저히 줄어들고 있는 실정이다.
비록 항생제가 박테리아에 의한 감염성 질환의 치료에 있어 여전히 주된 방법으로 널리 사용되고 있는 실정이지만, 과도한 항생제의 사용으로 인하여 1980년대부터 많은 항생제 내성 균주가 발생하기 시작했으며 상기 예시된 바와 같이 더 이상 기존 항생제로는 효과적 치료를 기대할 수 없는 일명 슈퍼박테리아(super-bacteria) 또는 슈퍼버그(super-bug)라 불리는 내성균(resistant bacteria)까지 발생하여 사회적으로 크나큰 문제로 대두되고 있다. 이런 이유로 기존 항생제에 대하여 내성을 획득한 박테리아에 의한 질환까지도 치료할 수 있는 새로운 항생 물질의 개발이 시급하다 할 수 있다.
이처럼 내성균이 증가하게 된 주된 원인으로는 무분별한 항생제 오남용(mis- and over-use)으로 인한 사람, 가축, 야생동물, 양식어류, 토양, 하천, 바다 등 환경 전체의 항생제 오염을 들 수 있다. 항생제 과다 사용이 새롭게 개발된 항생제에 대한 박테리아의 내성 획득 시간을 과거보다 더 짧게 만드는 하나의 원인이 되고 있는 것이다. 그러나 보다 더 근본적인 원인은 새롭게 개발된 합성 항생제 대부분이 과거 개발된 항생제의 기본 골격 구조를 그대로 유지하면서 화학적으로 약간의 구조만을 변경시키는 방식으로 개발되고 있는 기술적 한계에 크게 기인하고 있다고 할 수 있다. 현재 시장에 나와 있는 모든 항생제는 내성 문제에 직면하고 있으며, 이에 따라 기존 항생제의 내성 문제에서 자유로운 새로운 계열(class)의 항생제의 개발에 대한 요구가 큰 실정이다. 그럼에도 불구하고 지난 50년 동안 발견된 새로운 항생제 계열은 옥사졸리디논(Oxazolidinones), 고리형 리포펩타이드(cyclic lipopeptides), 프라텐시마이신(platensimycin)의 3 가지뿐이다. 따라서 새로운 항생제 계열에 대한 요구는 여전하다고 할 수 있으며, 이들 새로운 항생제는 현재 일반적으로 사용되는 항생제에 대하여 내성이 생긴 박테리아에도 항균 활성이 있어야 할 것이다.
항생제 오남용 및 이로 인한 내성균 출현 등으로 대표되는 기존 합성 항생제의 문제점이 세계적으로 크게 이슈화되어 있는 상황에서 이에 대한 해결책을 제시해 줄 수 있는 대상으로 주목을 받고 있는 것이 바로 박테리오파지(Bacteriophage) 및 박테리오파지 유래의 리신(Lysin) 단백질이다. 박테리오파지 및 리신 단백질은 기존 항생 물질과는 완전히 다른 계열이라 할 수 있으며 이에 따라 전혀 다른 항균(antibacterial) 작용 기작(mode of action)을 갖고 있다. 따라서 기존 항생제의 사용에서 나타나던 여러 부작용(side effect)이나 문제점을 개선할 수 있을 것으로 기대를 모으고 있다.
박테리오파지는 박테리아를 감염시킬 수 있으며 보통 파지(phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 핵산으로 이루어진 유전물질 중심부를 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조의 유기체이며, 핵산은 단일 사슬이거나 이중 사슬인 DNA 또는 RNA로 되어있다. 박테리오파지는 생존에 숙주(host)가 반드시 필요하며, 모든 박테리아에는 특정 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있다. 박테리오파지는 박테리아의 세포벽(cell wall)의 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층(layer)을 공격하여 세포벽을 파괴함으로써 박테리아를 사멸시킬 수 있다. 박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort와 1917년 프랑스의 d’Herelle에 의해 독립적으로 규명되었으며 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명되었다. 박테리오파지의 항박테리아 활성(antibacterial activity) 때문에 발견 직후부터 인체와 동물의 질병 치료에 사용되었다. 그러나 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 계속된 다양한 항생제의 등장 및 보급화로 인하여 서구에서는 관심이 점차 줄어들게 되었다. 그러나 러시아와 독일 등의 동구권 나라들은 박테리오파지 연구를 계속 해왔으며 관련하여 다수의 제품들이 산업화된 바도 있다. 하지만, 2000년대에 이르러 항생제 내성균 문제가 부각되면서 서구에서도 다시 박테리오파지에 대하여 관심을 갖게 되었으며 그 후 약 7~8년이 흐른 최근, 산업화 사례들이 속속 보고되고 있다. 즉, 박테리오파지가 세계적으로 새롭게 재조명되기 시작한 시기는 2000년대 초반으로, 실질적 산업화 노력이 약 7 ~ 8 여년 정도 진행된 신규한 분야로서, 생명공학기술의 발전과 맞물려 최근 매우 활발히 관련 개발이 진행되고 있는 분야라 할 수 있다.
박테리오파지의 가장 큰 특징으로는, 감염성 박테리아 속에 침투한 다음 박테리아의 세포벽을 파괴하여 박테리아의 사멸을 유도한다는 것이며, 이러한 박테리오파지에 의한 세포 사멸의 기작은 세균의 세포벽 합성을 방해하는 방식의 기존 합성 항생제의 기작과는 완전히 다르다. 따라서 기존 합성 항생제에 대한 감수성에 관계없이 자신의 항균 활성을 발휘할 수 있다. 이로 인하여 특히 기존 항생제에 대하여 이미 내성을 획득한 내성균에 대해서도 항균 효과가 있다. 또한, 박테리아에 대해서는 매우 특이적인 항균 활성을 가지고 있기 때문에 인간을 포함한 동물을 구성하는 세포인 진핵세포(eukaryotic cell)에는 영향을 주지 않는다는 장점을 갖고 있다.
Patrick PR, et al. eds. Manual of Clinical Microbiology. 8th eds. ASM press. 2003 Spencer RC. Predominant pathogens found in the European Prevalence of Infection in Intensive Care Study. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996; 15: 281-5. Lee K. et al. High prevalence of ceftazidime-resistant Klebsiella pneumoniae and increase of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. in Korea: a KONSAR program in 2004. Yonsei Med Journal 2006;47:634 WHO. World Health Report-2002. Geneva: 2002 Pinner RW. Trends in infectious diseases mortality in the United States. JAMA. 1996:275:189
본 발명의 일 목적은 카바페넴 내성 슈도모나스 균속에 대한 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 카바페넴 내성 슈도모나스 균속에 대한 특이적 감염 및 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파지에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 조성물과 질환 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 카바페넴 내성 세균 감염증 치료의 대안 물질로 기존의 화학용법 제제를 보완할 수 있는 박테리오파지를 검토하던 중 카바페넴 내성 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파지를 분리하고, 분리된 박테리오파지의 형태적 및 유전적 특성을 분석하여 이를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 유전체(genome)의 유전자 서열을 제공하며, 더 나아가 카바페넴 내성 녹농균 특이적 사멸능을 갖는 분리된 박테리오파지를 이용하여 카바페넴 내성 녹농균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 이용함으로써 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 카바페넴 내성 녹농균을 선택적으로 사멸시키기 위해 예의 노력한 결과, 병원체로부터 녹농균을 분리하고, 이 녹농균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 신규한 박테리오파지를 선별하였고 이를 YMC11/11/R1836 PAE BP로 명명하였다. 이렇게 선별된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 2015년 3월 23일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터 (기탁번호 KCTC18364P)에 기탁하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면 항생제 내성 슈도모나스 균속에 대하여 선별된 박테리오파지는 서열번호 2 내지 10 중 적어도 하나로 표시되는 유전체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 박테리오파지의 유전체의 핵산 분자 서열을 제공한다 (서열번호 1).
본 발명에서 상기 항생제 내성 슈도모나스 균속에 속하는 균종은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)일 수 있다.
본 발명에서 상기 항생제는 카바페넴일 수 있고, 상기 항생제 내성 슈도모나스 균속이 생산하는 효소는 카바페넴아제일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "핵산 분자"라는 용어는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 항생제 내성 슈도모나스 균속에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용으로서 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 1 × 103 내지 1 × 1010 pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 1 × 106 내지 1 × 109 pfu/㎖의 박테리오파지를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]는 상술한 바와 같이, 항생제 내성 슈도모나스 균속, 바람직하게는 카바페넴 내성 녹농균을 특이적으로 사멸시키므로, 녹농균에 의해 유발되는 다양한 질환의 치료에 효과를 나타낸다.
녹농균은 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 심내막염 및 내인성 기회감염 등을 일으키는 원인균으로서, 본 발명의 약학적 조성물은 녹농균에 의해 유발되는 다양한 질환(녹농균 유발성 질환), 예컨대 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 심내막염 및 내인성 기회감염 등에 대한 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (ⅰ) 녹농균에 의해 유발된 질환의 예방; (ⅱ) 녹농균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅲ) 녹농균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명은 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.
대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그 만큼 항생제로서의 제품수명이 길어질 것으로 기대된다. 따라서, 병원성 세균인 녹농균을 특이적으로 사멸시키는 본 발명의 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 '항생제'라는 용어는 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명은 상기 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.
카바페넴 내성 녹농균에 대하여 특이적 사멸능을 갖는 본 발명의 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원 감염을 막기 위한 병원 및 보건용의 소독제로 유용하게 사용될 수 있고, 또한 일반 생활 소독제, 식품 및 조리 장소 및 설비의 소독제, 축산산업의 축사 소독제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 항생제 내성 슈도모나스 균속에 의해 유발되는 질환의 개선용으로서 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP[KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 1 × 103 내지 1 × 1010 pfu/㎖의 박테리오파지를 포함하며, 바람직하게는 1 × 106 내지 1 × 109 pfu/㎖의 박테리오파지를 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에 포함되는 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP[KCTC18364P]는 상술한 바와 같이, 항생제 내성 슈도모나스 균속, 바람직하게는 카바페넴 내성 녹농균을 특이적으로 사멸시키므로, 녹농균에 의해 유발되는 다양한 질환에 개선 효과를 나타낸다.
녹농균은 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 심내막염 및 내인성 기회감염 등을 일으키는 원인균으로서, 본 발명의 약학적 조성물은 녹농균에 의해 유발되는 다양한 질환(녹농균 유발성 질환), 예컨대 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 심내막염 및 내인성 기회감염 등에 대한 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 '개선'이라는 용어는 녹농균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.
본 발명에서 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에서 제공하는 신규한 박테리오파지는 강력한 항균제인 카바페넴 내성 슈도모나스 균속에 대하여 특이적 사멸능을 가지므로, 상기한 카바페넴 내성 슈도모나스 균속에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 목적으로 활용할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균 29주를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에서 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 용균성 박테리오파지를 접종한 후 플라크가 형성된 모습을 사진으로 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3에서 카베페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4에서 카베페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 각 온도 별로 안정성을 평가하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 4에서 카베페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 각 pH 별로 안정성을 평가하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 5에서 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 흡착능을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 5에서 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 1단 증식 곡선을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 6에서 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 전체 유전체 서열분석(whole genome sequence analysis)을 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 6에서 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 전체 유전체 서열분석 중 ORF(Open reading frame) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 6에서 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 기능이 알려진 9개의 ORF 중 슈도모나스 박테리오파지 PA1/KOR/2010와 전혀 상이한 서열을 갖는 8개의 ORF를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 7에서 생체 외(in vitro)에서 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균에 대한 용균능을 분석하여 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 8에서 마우스의 비강을 통해 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균을 감염시킨 뒤 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 처리에 따른 마우스의 생존율 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 실시예 8에서 마우스의 비강을 통해 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균을 감염시킨 뒤 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 처리에 따른 마우스의 체중 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 9에서 마우스의 폐에 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균을 감염시킨 뒤 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 처리에 따른 폐 조직의 모습을 나타낸 이미지이다.
도 15는 실시예 9에서 마우스의 폐에 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균을 감염시킨 뒤 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 처리에 따른 병증 심각도(histological score)의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 실시예 9에서 마우스의 폐에 카바페넴에 대해 내성을 갖는 녹농균을 감염시킨 뒤 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 처리에 따른 녹농균의 수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 카바페넴 내성 임상 검체 분리 균주 수집 및 균주 은행 구축
(1) 임상 검체 분리 균주 수집: 인덱스 균주 은행 구축
세브란스 병원의 환자들로부터 호흡기 감염증, 패혈증 및 농양 검체를 수집하였으며 각 검체에 대한 임상적 위중도 평가 기준은 다음과 같다. 호흡기 검체는 그룹 4,5,6으로 제한하였고, 패혈증 검체는 3쌍 배양 중 2쌍 이상에서 증식하였으며, 농양 검체는 심부농양 주사기 아스피레이트에 제한하였다. 상기 검체로부터 슈도모나스 균속에 속하는 병원균을 배양 분리하였고, 균주의 동정을 위해 전통적 방법을 통한 생화학적 동정 혹은 16s rRNA/ITS/rpoB 염기서열 분석을 통한 분자역학적 방법을 실시하였다. 감수성 결과는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009)를 기준으로 판독하였다. 감수성 시험은 뮬러-힌튼(Mueller-Hinton) 아가를 사용하여 외기 37℃에서 하룻밤 동안 배양하는 CLSI 디스크 확산 시험방법을 사용하였다. 슈도모나스 균속에 대한 시험 항균제는 아미카신(Amikacin), 아즈트레오남(Aztreonam), 세즈타지딤(Ceftazidime), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 콜리스틴(Colistin), 세페핌(Cefepime), 젠타마이신(Gentamicin), 이미페넴(Imipenem), 레보플록사신(Levofloxacin), 메로페넴(Meropenem), 피페라실린(Piperacillin), 피페라실린/타조박탐(Piperacillin/Tazobactam), 티카실린(Ticarcillin), 토브라마이신(Tobramycin)을 사용하였다. 카바페넴 내성 균주을 선별하기 위해 이미페넴 호지 테스트(Imipenem Hodge test)를 통해 카바페넴아제를 발현하는 균주를 선별하였다. 이 때, 메탈로-β-락타마제(metallo-β-lactamase)와 세린-β-락타마제(serin-β-lactamase)를 포함한 카바페넴아제(carbapenemases)의 PCR 스크리닝 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.
타겟(target) 프라이머(primer) 프라이머 서열(5'-3') 결과물 크기
blaVIM VIM2FR-F ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG 801bp
VIM2FR-R CTACTCAACGACTGAGCG
blaIMP IMP1-F CATGGTTTGGTGGTTCTTGT 450bp
IMP1-R ATAATTTGGCGGACTTTGGC
blaSIM-1 SIM-1 MP F TACAAGGGATTCGGCATCG 571bp
SIM-1 MR R TAATGGCCTGTTCCCATGTG
blaSPM-1 SPM-1-A CTGCTTGGATTCATGGGCGC 784bp
SPM-1-B CCTTTTCCGCGACCTTGATC
blaGIM-1 GIM1-F ATTACTTGTAGCGTTGCCAGCT 726bp
GIM1-R TAATCAGCCGACGCTTCAG
blaAIM-1 Yong MBLF GGCATTGATGCGCATCAAGG 726bp
Yong MBLRF GAAGACGTCGTCCGAGATCG
blaNDM-1 KP05506 M13 R3 CAATATTATGCACCCGGTCG 726bp
KP05506 M13 R2 ATCATGCTGGCCTTGGGGAA
blaHKM-1 KHM-1 F GGTATGCGCTGACGATTCAT 526bp
KHM-1 R TACCGCATGGCTAAGATTGC
blaSME SME1-3 F AGCGGTTCCCTTTATGCAGT 661bp
SME1-3 R CGTGATGCTTCCGCAATAGT
blaIMI, blaNMC IMI NMC F CGATTGGGTAGTTGGCGATA 173bp
IMI NMC R CGATTCTTGAAGCTTCTGCG
blaGES GES 2456 F CGAAAAAGCAGCTCAGATCG 761bp
GES 2456 R TGTCCGTGCTCAGGATGAGT
blaKPC KPC 1-4 F TGGACACACCCATCCGTTAC 515bp
KPC 1-4 R GACGGCCAACACAATAGGTG
(단, 세포불멸화(immortalization)은 -70℃ 초저온 냉동고에서 10% 글리세롤 스톡(glycerol stock)으로 수행하였다.)
수집된 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ) 중 29주가 카바페넴에 대한 내성을 나타내었다(도 1).
단, 도 1에서 S, I 및 R은 항균제에 대한 감수성을 평가한 결과로, 'S'는 민감(Susceptible), 'I'는 중간(Intermediate), 'R'은 내성(Resistant)를 의미한다.
실시예 2. 파지 은행 구축을 위한 검체 수집 및 파지 분리 정제
(1) 파지 은행 구축을 위한 검체 수집
세브란스 병원의 오수 처리시설에서 최초 침전지를 거친 후 부유물질 및 침사물이 제거된 처리수 2L를 채취하였다. 이는 화학 처리 시설 전 단계의 오수로 제한하였다. 수집한 시료에 1L당 염화나트륨 58g을 첨가한 후 10,000g에서 10분간 원심 분리하여 200nm 밀리포어 필터로 여과하였다. 얻어진 여과액에 폴리에틸렌글리콜(PEG, 분자량 8000)을 10% V/V으로 첨가하고 4℃에서 12시간 동안 냉장 보관하였다. 12시간 냉장 보관된 여과액을 12,000g에서 20분간 원심 분리하여 침전물을 파지 희석 완충액 (SM 완충액)에 재부유하여 냉동 보관하였다. 이를 3회 반복하여 300mL의 박테리오파지 부유액을 채취하였다.
(2) 용균성 파지 선별 및 정제
① 스팟 테스트(Spot test) 및 플라그 분석(Plaque assay)을 이용한 파지 정제
용균성 파지의 분리 정제는 스팟 테스트(Spot Test)법 (Mazzocco A et al. In Bacteriophages, Clokie and Kropinski AM, eds. Humana Press. 2009)으로 실행하였다. 확보된 균주를 맥콘키 한천배지에서 접종 후 외기 35℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후, 투명한 플라크 형성을 보고 파지에 감수성인 균주를 선별하였다(도 2). 감수성인 균주를 맥콘키 한천배지에 접종하여 35℃에서 12시간 동안 배양하였다. 살린 1ml 튜브에 McFarland 0.5 탁도로 각 균주의 현탁액 제조하고 H 탑 아가 (3 ml), 감수성 박테리아 100ul 및 파지 용액 (각각 1ul, 10ul 및 50ul)을 섞어 LB 아가에 도포한 후, 35℃에서 12시간 동안 배양하였다. 플라크 관찰한 후에 파스퇴르 파이펫으로 플라크를 채취하여 SM 완충용액에 희석하고, 다시 감수성인 균주 현탁액을 이용하여 3회 반복 정제하였다. 이렇게 얻어진 순수한 박테리오파지는 SM 완충용액에 희석하고 다시 감수성인 균주 현탁액을 이용하여 3회 반복 정제하였다. 이렇게 얻어진 순수한 박테리오파지는 SM 완충용액에 희석하여 보관하였다.
② 용균성 파지의 용균역가 측정
실시예 1에서 확인한 카바페넴 내성 녹농균 29주 각각을 맥콘키 한천배지에서 접종하여 배양한 후, 정제된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 도말된 각각의 균주에 5ul로 접종하여 플라그 형성을 확인하고, 역가 범위를 확인하였다. 그 결과, 카바페넴 내성 녹농균 29주 중 14주(48%)를 용균시킨 것을 확인할 수 있었다(표 2).
카바페넴 내성 녹농균주 박테리오파지 YMC11/02/R656 PAE BP의 용균성
YMC11/11/R1836 ++
YMC12/01/R1679 +
YMC12/01/R1561 -
YMC12/01/R2799-2 -
YMC12/01/R2928-2 -
YMC12/02/R3223-2 -
YMC12/02/R3040 -
YMC12/03/R439-2 -
YMC11/01/R263 -
YMC11/02/R656 +
YMC11/03/P287 ++
YMC11/03/U2281 -
YMC12/01/R21 -
YMC11/06/C171 ++
YMC12/01/R24 -
YMC12/01/R437 +
YMC12/01/R1323 ++
YMC11/05/P144 +
YMC11/07/P54 +
YMC11/07/R521-2 -
YMC12/01/R960 -
YMC12/01/R2316 +
YMC12/01/R2767 -
YMC12/03/R469 -
YMC12/03/R745 -
YMC11/01/R31 +
YMC11/02/R234 +
YMC11/06/U973-2 +
YMC11/08/R25 ++
단, 상기 표 2에서 ++, + 및 -는 수집된 균주에 대한 플라크 활성을 평가한 것으로, '++'는 투명한 플라크(clear plaque), '+'는 혼탁 플라크(turbid plaque)를 의미한다.
실시예 3. 카바페넴 내성 녹농균에 대한 용균성 박테리오파지의 전자 현미경 분석
정제된 박테리오파지를 감수성 균주 배양 배지(20ml LB 배지)에 접종 및 배양한 뒤 220nm 밀리포어 필터로 여과하고, 상청액에 폴리에틸렌글리콜(MW 8,000)을 10%(w/v)의 양으로 첨가한 후 밤새 냉장 보관하였다. 이후 12,000g의 조건으로 20분 동안 원심 분리한 뒤, 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 이용하여 박테리오파지의 형태를 분석했다.
형태적으로 짧은 꼬리와 육각형 머리를 가지는 단축 100 nm, 장축 200 nm 정도의 파지며, 분류상 포도비리대(Podoviridae)에 속하는 것으로 분류했다(도 3).
실시예 4. 정제된 박테리오파지 YMC11 /11/R1836 PAE BP의 온도 및 pH 안정성 분석
SM 버퍼 40ul에 정제된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP 1ul를 넣고, 4℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃에서 10분 간격으로 1시간 동안 배양한 후 숙주 세포와 함께 플라그 분석을 수행하였다.
또한, pH가 4, 5, 7, 7.5, 8, 9, 10인 SM 버퍼 각각에 정제된 박테리오파지 YMC11/02/R656 PAE BP 1ul를 넣고 4℃에서 5일 동안 배양한 후 숙주 세포와 함께 플라그 분석을 수행하였다.
그 결과, 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP는 4℃에서 안정성이 높고, 40℃에서도 1시간까지는 대략 87%의 높은 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
또한, 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP는 24시간까지 넓은 pH 범위에서 안정성을 나타냈고, 5일까지 pH 7에서는 비교적 높은 안정성을 유지하는 것을 볼 수 있었다(도 5).
실시예 5. 녹농균에 대한 박테리오파지 YMC11 /11/R1836 PAE BP의 흡착능 및 1단 증식 곡선(one-step growth curve) 분석
카바페넴 내성 녹농균을 OD 값이 0.5가 되도록 배양한 뒤, 녹농균에 정제된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 MOI 0.001로 넣고 상온에서 배양하였다. 100ul 시료를 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20분에 1ml씩 채취하여 LB 배지에 희석한 뒤 플라그 분석을 통해 상기 박테리오파지의 흡착능을 평가하였다.
또한, 카바페넴 내성 녹농균을 OD 값이 0.3이 되도록 배양한 뒤, 4℃에서 5분 동안 7,000g로 원심 분리하여 세포를 침강시킨 후, 0.5ml의 LB 배지에 희석시키고, 정제된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 MOI 0.001(titer 108pfu/cells)를 넣고 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 배양된 혼합 시료를 13,000g에서 1분 동안 원심 분리하여 얻어진 펠렛을 10ml의 LB 배지에 희석시키고 37℃에서 배양하였다. 배양 도중 5분 마다 시료를 채취하여 플라그 분석을 통해 상기 박테리오파지의 1단 증식 곡선을 평가하였다.
그 결과, 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 접종 후 10분 이내에 박테리오파지의 99% 이상이 녹농균에 대하여 흡착하는 것을 확인할 수 있었고(도 6), 499 PFU/감염 세포의 높은 버스트 사이즈(burst size)를 나타내었다(도 7).
실시예 6. 분리된 박테리오파지 YMC11 /11/R1836 PAE BP의 전체 게놈 서열 분석
전 유전체 서열분석을 통해 YMC11/11/R1836 PAE BP의 전 유전체 (37,714bp. 59 ORF, G+C 함량 37.7%)를 분석하였다(도 8). 59개의 ORF 중 9개의 OFR(ORF1, 2, 6, 20, 23, 30, 31, 40, 49)만이 기능 단백질이었다(도 9). 이들 9개 ORF의 핵산 서열은 서열번호 2 내지 10으로 표시된다.
또한, 기능이 알려진 9개의 ORF 중 8개의 ORF(ORF1, 2, 6, 20, 23, 30, 40, 49)가 종래의 슈도모나스 박테리오파지 PA1/KOR/2010(linear, 34,553 bp, NCBI accession No. HM624080)과는 전혀 상이한 것을 확인할 수 있었다(도 10).
실시예 7. 생체 외 카바페넴 내성 녹농균에 대한 박테리오파지의 용균능 검증
카바페넴 내성 녹농균 1 X 109 CFU/ml에 준비된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 1 X 108 CFU/ml(MOI: 0.1), 1 X 109 PFU/ml(MOI: 1), 1 X 1010 PFU/ml(MOI: 10)의 양으로 각각 처리하고 시간 별로 OD 값(파장 600nm)을 측정하였다. 단, 대조군으로는 PBS+SM 버퍼를 처리하였다.
대조군과 비교할 때, 녹농균에 대하여 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 처리한 경우 OD값이 감소하는 것을 볼 수 있었고, 특히 MOI 값이 증가할수록 OD값이 더욱 감소하는 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따른 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP는 카바페넴 내성 녹농균에 대하여 용균성을 갖는 것을 알 수 있다(도 11).
실시예 8. 마우스의 비강 내 녹농균 감염에 대한 박테리오파지의 용균능 검증
생후 7주된 암컷 B6 마우스 30마리를 1세트로 준비하고, 각 마우스에 시클로포스파미드(cyclophosphamide)를 4mg씩 2회 처리한 뒤, 졸레틸(30mg/kg)과 롬푼(10mg/kg)으로 마취시켰다. 이후, 각 마우스의 비강 내로 카바페넴 내성 녹농균 1 X 109 CFU/ml (620nm=0.6)를 접종하고 30분 후 하기 표 3과 같이 준비된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 접종한 뒤 12일간 사육하면서 체중 변화와 생존 여부를 관찰하였다.
그룹 박테리오파지의 처리량 마우스 수
대조군 비강 내 PBS+SM 버퍼 1회 투여/30㎕ n=5
녹농균 접종군 비강 내 녹농균+SM 버퍼 주입:
1 X 109 CFU/ml 1회 투여/30㎕		 n=5
PBS+박테리오파지 접종군 비강 내 박테리오파지 1 X 1010 PFU/ml 1회 투여/30㎕ n=5
녹농균+박테리오파지 접종군-1 MOI:10 비강 내 녹농균: 1 X 108 CFU/ml
박테리오파지: 1 X 1010 PFU/ml 1회 투여/30㎕		 n=5
녹농균+박테리오파지 접종군-2 MOI:1 비강 내 녹농균: 1 X 108 CFU/ml
박테리오파지: 1 X 109 PFU/ml 1회 투여/30㎕		 n=5
녹농균+박테리오파지 접종군-3 MOI:0.1 비강 내 녹농균: 1 X 108 CFU/ml
박테리오파지: 1 X 108 PFU/ml 1회 투여/30㎕		 n=5
녹농균만 접종한 경우와 비교할 때 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 함께 접종한 경우 마우스 생존율이 증가하고, 체중 변화량이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 특히 MOI 값이 증가할수록 마우스 생존율은 더욱 증가하고 체중 변화량은 더욱 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 12, 도 13).
이를 통하여 본 발명에 따른 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP는 카바페넴 내성 녹농균에 대하여 용균성을 갖는 것을 알 수 있다.
더욱이, 마우스에 PBS 버퍼와 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP만을 주입한 경우 마우스가 사망하지 않았고, 체중은 오히려 증가한 것을 볼 수 있었다(도 12).
이를 통하여 본 발명에 따른 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP의 주입은 생존에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
실시예 9. 마우스의 폐 내 녹농균 감염에 대한 박테리오파지의 용균능 검증
생후 7주된 암컷 B6 마우스 60마리를 3세트로 준비하고, 각 마우스에 졸레틸(30mg/kg)과 롬푼(10mg/kg)으로 마취시킨 뒤, 각 마우스의 코를 통해 카바페넴 내성 녹농균 1 X 109 CFU/ml (620nm=0.6)을 접종하여 폐 감염을 유도하고, 30분 후 하기 표 4와 같이 준비된 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 접종하였다. 1일 및 5일 후 부검하여 폐 조직을 HE 염색하여 현미경으로 관찰하고, 병증 심각도(histological score)를 점수 매기고, 폐 조직 내 녹농균의 수를 카운팅하였다.
그룹 박테리오파지의 처리량 마우스 수
대조군 코 속으로 PBS+SM 버퍼 1회 투여/30㎕ n=5
녹농균 접종군 코 속으로 녹농균+SM 버퍼 주입:
1 X 109 CFU/ml 1회 투여/30㎕		 n=5
PBS+박테리오파지 접종군 코 속으로 박테리오파지 1 X 1010 PFU/ml 1회 투여/30㎕ n=5
녹농균+박테리오파지 접종군-1 MOI:10 비강 내 녹농균: 1 X 108 CFU/ml
박테리오파지: 1 X 1010 PFU/ml 1회 투여/30㎕		 n=5
녹농균만 접종한 경우와 비교할 때 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP를 함께 접종한 경우 폐 조직의 치료 효과를 확인할 수 있었다. 녹농균 감염 그룹은 폐포 벽의 두꺼워짐과 호중구 침윤(neutrophil infiltration)이 매우 심각하게 관찰되었으나, 박테리오파지를 처리한 그룹은 매우 호전된 것을 볼 수 있었다(도 14, 도 15). 또한, 마우스의 폐에 감염된 녹농균은 박테리오파지 접종 5일 후 대부분 제거되는 것을 확인할 수 있었다(도 16).
이를 통하여 본 발명에 따른 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP는 카바페넴 내성 녹농균에 대하여 용균성을 갖는 것을 알 수 있다.
더욱이, 마우스에 PBS 버퍼와 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP만을 주입한 경우 대조군의 폐 조직과 비교하여 크게 다르지 않은 것을 볼 수 있는 바(도 14), 본 발명에 따른 박테리오파지 YMC11/11/R1836 PAE BP는 마우스에 어떠한 부작용도 일으키지 않는 것을 알 수 있었다.
이상, 본 발명을 상기 실시 예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시 예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC18364P 20150323
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Lytic bacteriophage specific for Pseudomonas genus resistant to antibiotics <130> DPB154223 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37714 <212> DNA <213> P. aeruginosa phage <400> 1 caggcgttat ccgccgatac tccggcgaac cggcggataa ccgcagcggt tattcgcccc 60 agcggtcgat ccgacctggg gcggcctcag gcctggcgca acaggcgcag gccatcttcc 120 tgtgcgaggc tggctgtggg gaggtgactg ttttgacaca cgccaaaaga gggatggata 180 ggctagaacc cctataacac tagggctcca gccggagagg caccgtgcgg gtgtttggaa 240 aatatcgatc aggattgagc aaggactgca aaatattgat cgttaattgg cacagaatga 300 gcgctaaacc atccagcggc tagcccatac aacccttccg atgatttcca ggtccgacag 360 ctttgccttt gggacgatca tttcggtata ggccttgttt tcactgatga tcgacaccga 420 cccgtcgaag cgtctttgca ggcgctttgc atagagatgg tcatccaggc gaacgacgta 480 gactgccgcg tcttggaccg ttgacttggt gtgatccaca agcactgtat ctccatcgca 540 cagcagaggc tccatagagt caccgccaat gcggatcgct gagatactgg aggggtccaa 600 accctttttt cgcaggctgt accgagtgaa tgcaagattc acaagcacgg tggcgccgtc 660 ggtccaggaa ccatgccctg cgctcacctg gccgtcatag aggggtatgt atacatactc 720 gccctcaatg ctcttcgcgc cttcggcagg cgtagcagcc acctcttccc cattgataag 780 ccaatccaga ctcacacgac cagccttggc tatggccgaa aggagttcag gagcggcggc 840 gttgatcccc ttgatatatc tgtaaagctg ggtctcgtgg atgccgacct gcttcgccaa 900 tgctcgccgg ctaccaagca gcctagccac ctccgcgatg cgcgttccga cctcctgcgt 960 gaaagtcgga actgccgcct tatctgattg atcttgttcc gtctttccgt aagtgtctga 1020 tttcacgata aaaaagccga ttccacttga ttgatatgta aatcaagagg cggaacttta 1080 ctgttccgtc ttgatcagcc aatcagatgt gttatgttta tccccaacag gcagttagat 1140 aacagccttc cacccgccaa gatggaatga ttgagatgaa catagccacc atcccgaaag 1200 acccggtgat gcgctgggag tggatcaagt accagctgcg catccgtggt tcttccaccg 1260 ctgcaatagc ccgccaactg ggtgttagct ccagggcagt tcgcgtcgcg aaagagattc 1320 cctatccccg cgtagagcgt gcgctcgccg ccgcgttgga cctgagccca gtgaagctct 1380 ggcccgaacg ctggattgac gaggacaatc cgaagcggca gcgtccgaat cgctcggaga 1440 cgctgctggc ttatgaaagt tatgcaaaaa ataccagata cgctcctata 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catcgttgac 4020 ccgaacaccg gccgtcgccg gcacatgacc cccaacgaag cgtgggcgct ccacgaagcc 4080 gatggcttcc gcccgatgcg ggtcaccgac gacgaggccc ggccgctgtt ccggccccag 4140 gtgctgcgca ccgtccgccg ctgcgaactg gagttcatcg gcaaccgcta cttcgcccgc 4200 gagctggagg aattccacgg cgaccaggtg gccgtgggct acgacatcca cgacgccagc 4260 aaggtgtggg tctacgacgg cgagggccgc ttcctttgca ccgcagagct gaacggcaac 4320 agccgcgact acatgccggc ttcgtatgtc gagcgtgccc gcgagaaacg cgcagaggcc 4380 cgcgagaagc gcgccctggc tcacctcgac gagattcgcg ccgagcgtga cggcgggtat 4440 gccctggaaa tggatgcgcc gctgtccatc cccggcctcg gcacgatcac ccctgagcaa 4500 ctccggtcgc gcagcgccgc gaccctcgaa atgcaggccg agcggatcga cgaaccgcgc 4560 ccggccgcag ccaccgccca agccaccacc gcccaggtct tcaccctgcc gaccgctccc 4620 gcccagcgct accggcagtg gtgcgagctg gccgagcggc agcgctccgg ccaacccatc 4680 gagccggacg ccgcccagtg gttcgaggtt taccccaaat ccaaagaatt cgccgcccag 4740 cagcggcaag catgaaagga gctgtattca tgaccacccc gaaaaccacc caactggcca 4800 gcggcatggc cgacatcgcc aacatcgccc tttgcgatat cgccctggag 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cgggtttggc 2880 ctgggcggtg gcaccgatgg cggcgcccag gggctgacgg tcggcgcctc ggctgtatcc 2940 gcctcggccg gcgccctggc gactgctggc ggcacgctcc tgagcggcgc cgccgctatc 3000 caggccgctg ccgcctcgct ggccgccgcc aatggtgtca gtggggtgac cggcgctgcg 3060 ggagctgccg gggccgctgg agtggctggt ggcgggagtg gctggttgtc ttcgatcacc 3120 agcattttcg gcttcgcggg tggcggccag gtccagggac caggcacacc gaccagcgac 3180 agcataccgg cctggctatc caacaatgag gtcgtaatcc ggtcggcatc cgccatgcag 3240 ccagggctta ctccgctgct gctggacgtc aaccaacgcg gatgggcggc gctacatgac 3300 tgggcggggg ccgtccgcca cgccaccggg ggcgtcgccg gcattcccgc gccatcccta 3360 ccacgcccaa gcatgggcgc cgctcagata caggaaccgt ccaagaactt cagcgcatca 3420 gtctccaacg cggtccacct ccatgctgtt caagaccccg accagatggc ggccgacatg 3480 tgggccggca agggcggcga ccattacatc gtctggctga acaagaaccg ccaggccgtc 3540 aagcaaatac tcggaaacta g 3561

Claims (14)

  1. 카바페넴(carbapenem)에 대해 내성을 갖는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 특이적 세포 사멸능을 가지며, 서열번호 2 내지 10 중 적어도 하나로 표시되는 유전체를 포함하는 박테리오파지 [KCTC18364P].
  2. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지 [KCTC18364P]는 서열번호 1로 표시되는 유전체로 이루어진 것인, 박테리오파지 [KCTC18364P].
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 카바페넴(carbapenem)에 대해 내성을 갖는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 특이적 세포 사멸능을 가지며, 서열번호 2 내지 10 중 적어도 하나로 표시되는 유전체를 포함하는 박테리오파지 [KCTC18364P]를 유효 성분으로 포함하는, 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 심내막염 및 내인성 기회감염으로 이루어진 군에서 선택되는 항생제 내성 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 박테리오파지 [KCTC18364P]는 서열번호 1로 표시되는 유전체로 이루어진 것인, 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항 또는 제2항의 박테리오파지 [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 항생제.
  13. 제1항 또는 제2항의 박테리오파지 [KCTC18364P]를 유효성분으로 포함하는 소독제.
  14. 카바페넴(carbapenem)에 대해 내성을 갖는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 특이적 세포 사멸능을 가지며, 서열번호 2 내지 10 중 적어도 하나로 표시되는 유전체를 포함하는 박테리오파지 [KCTC18364P]를 유효 성분으로 포함하는, 폐렴, 뇌수막염, 균혈증, 심내막염 및 내인성 기회감염으로 이루어진 군에서 선택되는 항생제 내성 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주 유발성 질환 개선용 식품 조성물.
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