KR102577258B1 - 광범위성 항균 활성을 가지는 항균펩티드를 이용하여 용해가 어려운 박테리아로부터 고품질의 핵산을 추출하는 방법 - Google Patents

광범위성 항균 활성을 가지는 항균펩티드를 이용하여 용해가 어려운 박테리아로부터 고품질의 핵산을 추출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광범위성 항균 활성을 가지는 항균펩티드인 PG-1, 멜리틴 (melittin), PMAP-36을 이용하여 용해가 어려운 박테리아로부터 고품질의 핵산을 추출하는 방법 및 PG-1, 멜리틴, PMAP-36을 세포용해제로 포함하는 항균 약학적 조성물, DNA/RNA 추출용 키트 및 진단/검출 키트에 관한 것이다.
PG-1, 멜리틴, PMAP-36의 경우 동일한 순도와 양을 기준으로 기존의 리소스타핀과 비교 시 화학합성을 하더라도 더 경제적이며, PG-1, 멜리틴, PMAP-36 보다 짧은 길이의 항균 펩티드의 경우 훨씬 더 경제적이다.

Description

광범위성 항균 활성을 가지는 항균펩티드를 이용하여 용해가 어려운 박테리아로부터 고품질의 핵산을 추출하는 방법 {Method of isolating high-quality nucleic acid from hard-to-lyze bacterial strains using broad-spectrum antimicrobial peptide}
본 발명은 광범위성 항균 활성을 가지는 항균펩티드인 PG-1, 멜리틴 (melittin), PMAP-36을 이용하여 용해가 어려운 박테리아로부터 고품질의 핵산을 추출하는 방법 등에 관한 것이다.
High-throughput omics 기술의 급속한 발전으로 인해 게놈 및 전사체 분석, 마이크로바이옴 분석, DNA 기반 감염 질환의 신속한 진단이 미생물 연구의 필수적인 도구가 되었다. 그러나 이러한 분석의 성공적인 결과는 종종 세포벽 구조에서 상당한 차이를 보이는 다양한 미생물에서 고품질 핵산을 안정적으로 추출하는 것에 달려 있다.
박테리아 세포는 극한 환경에서도 번성할 수 있는 세포 표면 구조로 둘러싸여 있다. 가장 중요한 세포벽 구성 요소 중 일부는 펩티도글리칸 (PGN), 지질다당류 및 세포 외 다당류를 포함한 다당류 구조이다. 연구에 따르면 박테리아 세포벽 구조의 상당한 다양성과 결과적으로 세포 용해제 및 항생제에 대한 내성이 보고되었다. 용해하기 어려운 박테리아에서 게놈 DNA 또는 총 RNA를 준비하는 것은 용해하기 쉬운 박테리아에 비해 매우 덜 효율적일 수 있다. 따라서 화학적, 효소적 및 기계적 방법 또는 이들의 조합을 포함하여 박테리아에 대한 다양한 용해 프로토콜이 개발되고 있다.
리소자임, 뮤타노라이신 및 리소스타핀과 같은 세균 용해 효소는 세포를 파괴하는 데 사용되었다. 이러한 효소의 주요 응용 분야는 민감한 박테리아에서 핵산을 추출하고 세포 변형을 위한 스페로플라스팅과 관련이 있다. 예를 들어, 그람 양성 박테리아 종은 종종 리소자임에 대해 불응성이며 리소스타핀은 주로 포도상구균 균주의 세포벽에서 교차 결합 펜타글리신 브리지를 절단한다. 박테리아 세포벽 구조에 대한 자세한 이해는 몇 가지 종으로 제한되었다. 따라서 바실러스포자 및 결핵군에 대해 충분한 활성을 나타내는 용해 효소는 없다.
결합된 효소 및 화학적 용해 접근법이 결과를 개선할 수 있지만, 세포벽 또는 막의 화학적 또는 효소적 분해는 종종 예상보다 용해하기 어려운 세포에서 덜 효율적이다. 비드 비팅과 같은 기계적 용해 방법은 강한 미생물에 효과적일 수 있지만 비드 비팅에는 특수 장비의 필요성, 다양한 추출 효율성, 샘플 가열, 세포 생성물의 분해, 전염성 에어로졸 생성으로 발생하는 생물학적 위험 등 특정 제한이 있다.
항균 펩티드 (AMP)는 선천적인 면역체계의 일부로서 척추 동물을 포함한 다양한 유기체에 의해 생성되는 분자이다. 이들은 기존의 항생제 내성 균주를 포함한 광범위한 미생물에 대해 강력한 항균 활성을 나타내며 박테리아 내성을 유발할 가능성이 매우 희박하다. 박테리오신은 미생물이 자연 서식지에서 생존하는데 도움이 되는 자기 보호 메커니즘으로써 박테리아에 의해 생성되는 살균 펩티드이다. 이 펩티드의 기능을 뒷받침하는 주요 메커니즘은 박테리아 세포막의 파괴이다. 따라서, 분해하기 어려운 박테리아를 파괴하고 개방하고 박테리아 핵산 분리를 위한 새로운 막 용해제의 개발이 그 어느 때보다도 시급하다.
돼지 골수성 항균 펩티드 36 (PMAP-36)과 꿀벌 독 멜리틴 (melittin)은 막 결합 및 파괴를 통해 기능하는 양전하 알파 나선 구조를 가진 강력한 광범위 스펙트럼 AMP이다. 또한, 다른 돼지 카텔리시딘(cathelicidin) 중 하나인 protegrin-1 (PG-1)은 이중 역평행 베타 시트 구조 (two-stranded antiparallel beta sheet structure)로 두 개의 이황화결합에 의해 구조적인 안정성을 가지며, 이 특이적인 구조에 대한 작용 기전 및 생물학적 기능에 대해 이해하고자 많이 연구가 되고 있다. 이들 AMP는 구조와 항균 활성 정도가 다르지만 광범위한 막 용해성을 가지고 있다. Lactococcus lactis로부터 만들어지는 나이신 (nisin)은 가장 대표적인 박테리오신 (bacteriocin) 중 하나로 산업적 이용적인 측면에서 광범위하게 연구되고 있다. 이러한 펩티드들의 막 용해성 특징을 이용하여 다양한 박테리아로부터 전체 RNA 및 게놈 DNA를 추출하였고, 결과를 기존의 사용되는 세포막 분해 효소들과의 효율성을 비교했다. 본 발명에서 발명자는 항균펩티드 PG-1, 멜리틴, PMAP-36이 미생물학 연구, 특히 분해하기 어려운 박테리아에 대한 세포 용해 유도제로 사용될 수 있음을 보였고, 다른 박테리아 세포벽 용해 효소보다 다양한 박테리아 종에 대해 더 넓은 범위의 용해 활성을 입증하고자 하였다.
Ginsberg, C., Brown, S. & Walker, S. in Glycoscience: Chemistry and Chemical Biology (eds Bertram O. Fraser-Reid, Kuniaki Tatsuta, & Joachim Thiem) 1535-1600 (Springer, 2008). Bera, A. et al. Influence of Wall Teichoic Acid on lysozyme Resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology 189, 280-283, doi:10.1128/JB.01221-06 (2007). Sanderson, K. E., MacAlister, T., Costerton, J. W. & Cheng, K. J. Permeability of lipopolysaccharide-deficient (rough) mutants of Salmonella typhimurium to antibiotics, lysozyme, and other agents. Can. J. Microbiol. 20, 1135-1145, doi:10.1139/m74-176 (1974).
항균 펩티드는 척추동물을 포함한 다양한 유기체의 선천 면역의 일부로, 항생제 내성 균주를 포함한 광범위한 미생물에 대해 강력한 항균 활성을 나타내며, 박테리아 내성을 유발할 가능성이 거의 없다. 박테리오신은 미생물의 자기 보호 메커니즘으로 박테리아에 의해 생성되는 펩티드이다. 이들의 작용기전은 박테리아 세포막에 달라붙어 구멍을 형성함으로써 살균 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이를 이용하여 분해하기 어려운 박테리아를 파괴하고 핵산을 분리하기 위한 새로운 용해제로서의 적용성을 알아보고자 한다.
상기 본 발명의 목적 달성을 위해 본 발명은 항균 펩타이드를 포함하는 박테리아의 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 박테리아의 핵산 추출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 박테리아에 처리하는 단계를 포함하는 박테리아의 핵산 추출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 박테리아 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 상기 조성물을 박테리아에 처리하여 핵산을 추출하는 단계 및
b) 상기 박테리아의 16S rRNA를 증폭하는 단계를 포함하는 박테리아 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 항균 펩타이드는 PMAP-36(porcine myeloid antimicrobial peptide 36), 멜리틴(Melittin) 및 PG-1(protegrin-1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드일 수 있다.
상기 PMAP-36는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
상기 멜리틴은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
상기 PG-1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 박테리아는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 박테리아는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus), 바실루스 세레우스(B. cereus), 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae), 스트렙토코커스 디스갈락티애(S. dysgalactiae), 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(S. zooepidemicus), 에스케리키아 콜리(E. coli), 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa) 또는 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 박테리아의 세포벽을 용해시키는 것일 수 있다.
리소자임(리소자임)은 가장 보편적으로 사용하는 박테리아 용해성 효소이다. 해당 효소는 그람 양성균의 세포벽의 주요 구성성분이 펩티도글리칸 (peptidoglycan)을 분해하는 효소로 이들을 용해하기 위해 적용이 가능할 것으로 생각되었으나, 다양한 박테리아들이 리소자임에 저항성을 가진다. 따라서 그람 양성균으로부터 핵산을 추출하기 위해 효소를 이용한 방법은 그 효율성이 떨어져 대부분 용해가 어려운 박테리아로 그람 양성균을 꼽는 이유가 여기에 있다. PMAP-36은 대표적인 항균 펩티드로 광범위하면서 강한 활성을 가질 뿐만 아니라 박테리아의 저항성을 유발하기 어렵다는 특징을 가지고 있다. 이를 이용한 핵산 추출법은 지금까지 연구된 적이 없는 최초의 기술로 리소자임 보다 범용성이 훨씬 뛰어나다.
그람 음성균의 경우 양성균과는 달리 1개 층의 peptidoglycan을 가지고 있어 대체로 리소자임을 이용한 방법이 높은 효율성을 나타내나, outer membrane을 가지고 있어 P. aeruginosa와 같이 LPS content가 높은 경우 반드시 EDTA를 함께 처리하지 않으면 그 효율성이 현저히 떨어진다. 가장 중요한 점은 LPS content가 낮은 S. typhimurium과 같은 박테리아의 경우 리소자임-EDTA 동반 처리에도 불구하고 저항성을 가져 추출양이 현저히 떨어진다. 심지어 그람 음성균의 경우 리소자임을 대체할 효소가 존재하지 않아 PMAP-36을 이용한 핵산 추출법은 획기적인 방법이라 할 수 있다. 또한, PMAP-36의 경우 outer membrane에도 달라붙어 pore를 형성하기 때문에 EDTA에 대한 의존도가 낮고, 동반 처리하는 경우에도 펩티드 활성에는 영향이 없다.
S. aureus의 경우 가장 대표적인 용해가 어려운 박테리아에 속하며 리소자임을 이용한 방법은 비효율적임이 밝혀진 지 오래되었으며, 최근까지 사용하는 효소인 리소스타핀은 니이신을 제외하고 유일하게 상업적으로 이용이 가능한 박테리오신으로 staphylococci 에 특이적으로 사용되고 있다. 그러나 staphylococci 중에서도 리소스타핀에 대해 저항성을 가지는 경우가 보고되고 있으며, 실제 다수의 연구자들이 리소스타핀을 사용하더라도 핵산 추출이 어렵다는 의견을 제시하고 있다. 또한 리소스타핀의 높은 판매가격 때문에 비용적인 측면에서도 리소자임에 비해 효율성이 떨어지나 다른 대안이 없어 사용되고 있다. PMAP-36의 경우 동일한 순도와 양을 기준으로 lysostaphin과 비교 시 화학합성을 하더라도 더 경제적이며, PMAP-36 보다 짧은 길이의 항균 펩티드의 경우 훨씬 더 경제적이다.
박테리아의 경우 동일한 종이라 할지라도 각 종 (strain) 간의 개별적 차이가 굉장히 크다. 효과적인 효소로 알려져 있다 하더라도 실제 사용시 예상치 못한 저항성을 보여 그 효율성이 떨어지는 경우가 많다. 따라서 광범위성 항균 펩티드를 효소 대신 사용하는 방법은 그 대안이 될 수 있다.
도 1은 PMAP-36 생산을 나타낸다. (A) 폴리아크릴아마이드 (12% SDS-PAGE) 겔 이미지 화살표에서 지시된 것은 DL4GFP-PMAP-36 불용성 추출물 (33 kDa)이다. (B) Ni 친화성 크로마토그래피로 이미지 화살표에서 지시된 것은 타킷 피크이다. (C) 16% Tris-Tricine PAGE에서 분리되고 코마시블루로 염색된, 정제된 PG-1 (2.2 kDa)과 PMAP36 (4.1 kDa)의 이미지이다.
도 2는 S. aureus 및 S. typhimuriu의 PMAP-36 및 라이소자임을 사용하여 RNA 수율에 대한 펩티드 농도 및 반응 시간의 효과를 나타내며 (A) 다양한 반응 시간 동안 S. aureus와 함께 배양된 PMAP-36 100, 200 및 400 μg. (B) S. typhimurium에 대한 다양한 반응 시간에 대해 200 μg PMAP-36 및 1 mg 라이소자임을 사용한 결과. S. aureus, Staphylococcus aureus; S. typhimurium, Salmonella typhimurium을 나타낸다.
도 3은 다른 세포 분해 방법을 사용한 RNA 품질을 측정한 TapeStation 시스템 (Agilent)으로부터의 Electropherogram 이미지를 나타낸다. RNA은 S. aureus ATCC 6538 (1×109 cells)에서 추출되고 결과는 200 μg PMAP-36에서 4 h (A), 200 μg Lysostaphin 30분 (B), 비드 beating만 (C), 200 μg Lysostaphin + 200 μg PMAP-36 30분 (D), 200 μg PMAP-36 펩티드를 30분 동안 연속된 bead beating와 조합하고 (E) 방법이 비교되었다. S. typhimurium ATCC 14028으로부터의 200 μg PMAP-36 및 8 h 반응을 사용한 바 RNA 품질은 (F)에 나타냈다. A에서 F까지 RIN 값은 각각 9.3, 9.3, 8.3, 9.0, 9.3, 및 9.3이었다, S. aureus, Staphylococcus aureus; S. typhimurium, Salmonella typhimurium.
도 4는 총 RNA 수율 및 박테리아 게놈 사이즈 사이의 관계를 보여준다. (A) 박테리아 게놈 크기 및 얻어진 RNA 수율이 플롯되었다 (Pearson r2=0.76). (B) 박테리아의 세포 및 게놈 사이즈를 나타낸 것이다. Rod 및 spherical 박테리아는 각각 “길이 × 폭” 및 “반지름”으로 나타낸다. E. coli, Escherichia coli; P. aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa; S. typhimurium, Salmonella typhimurium; E. faecalis, Enterococcus faecalis; B. cereus, Bacillus cereus; S. aureus, Staphylococcus aureus; S. dysgalactiae, Streptococcus dysgalactiae.
도 5는 겔 이미지로 추출된 핵산에 대한 전기영동 분석 결과를 보여준다. (A) 역전사 PCR 16S rRNA amplicons 분석 결과. E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, E. faecalis, 및 음성 대조군에서(각각 레인 1에서 5) PMAP36을 이용해 RNA를 분리함. Amplicons은 좌측 화살표로 표시됨 (B) S. aureus로 부터의 리소스타핀(레인 1 ~ 3) 및 PMAP-36 (레인 4 ~ 6)을 이용한 처리로부터 얻은 추출된 게놈 DNA 이미지. 총 200 ng DNA가 로딩됨. E. coli, Escherichia coli; P. aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa; S. aureus, Staphylococcus aureus; E. faecalis, Enterococcus faecalis.
도 6은 박테리아 세포벽의 특성과 막 용해 단백질에 대한 민감성 사이의 관계를 나타낸다. 다른 박테리아 종에 적용할 수 있는 용해성 단백질은 하단에 표시되어 있다. PGN, 펩티도 글리칸; LPS, 지질 다당류; O-아세틸화, 아세틸화된 산소에 의한 N-아세틸 무라 민산 (NAM) 및 N-아세틸-D-글루코사민 (NAG) 연결; PGN에서의 결합, 교차 결합된 세포벽 테이코산 (WTA); 대장균 (E. coli); 녹농균 (P. aeruginosa); 쥐장티푸스균 (S. typhimurium); 엔테로코커스 페칼리스 (E. faecalis); 세레우스균 (B. cereus); 황색포도상구균 (S. aureus).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항균 펩타이드를 포함하는 박테리아의 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 항균 펩타이드는 PMAP-36(porcine myeloid antimicrobial peptide 36), 멜리틴(Melittin) 및 PG-1(protegrin-1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 펩타이드일 수 있다.
상기 PMAP-36은 돼지 골수성 항균 펩타이드로 하기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
서열번호 1: GRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGSIPLGCG
상기 멜리틴은 꿀벌독에 들어있는 구성성분으로 양전하를 띤 alpha-helical 구조를 가지며, 광범위하면서도 아주 강한 활성을 지니고, 하기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
서열번호2: GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
상기 PG-1은 PMAP-36과 같이 돼지 유래의 카텔리시딘 (cathelicidin)으로 대부분의 카텔리시딘이 alpha-helical 구조를 가지는 것과 달리 two-stranded antiparallel beta sheet가 2개의 이황화 결합에 의해 안정화된 특이적인 구조를 가지고 있으며, 하기 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
서열번호 3: RGGRLCYCRRRFCVCVGR
상기 3종의 펩타이드는 본 발명의 항균 펩타이드의 예시이며, 상기 항균 펩타이드와 같이 막 용해성을 가지는 항균 펩타이드라면 제한없이 이용 가능하다.
본 발명에서 상기 박테리아는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다.
본 발명에서 상기 박테리아는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus), 바실루스 세레우스(B. cereus), 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae), 스트렙토코커스 디스갈락티애(S. dysgalactiae), 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(S. zooepidemicus), 에스케리키아 콜리(E. coli), 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa) 또는 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 조성물은 박테리아의 세포벽을 용해시키는 것일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 박테리아의 핵산 추출용 키트를 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 박테리아 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 핵산을 추출하거나 박테리아를 검출하기 위한 공지의 구성이 추가될 수 있으며, 이러한 구성이 추가될 수 있다는 점은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 자명하다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 박테리아에 처리하는 단계를 포함하는 박테리아의 핵산 추출방법을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 a) 상기 조성물을 박테리아에 처리하여 핵산을 추출하는 단계 및
b) 상기 박테리아의 16S rRNA를 증폭하는 단계를 포함하는 박테리아 검출방법을 제공한다.
상기 방법은 핵산 추출이나 박테리아 검출을 위한 통상의 실험 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이러한 단계가 추가될 수 있다는 점은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 자명하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
[실시예]
재조합 PMAP-36과 PG-1의 생산
재조합 PMAP-36과 PG-1은 이전 연구에서 사용된 녹색 형광 단백질 (GFP) 스캐폴드 시스템을 사용하여 생산되었다. 간단히 말해서, DL4GFP-AMP 형질 변환 BL21 (DE3) 세포를 Luria-Bertani (LB; BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, 미국) 1 L의 매질에서 37°C에서 성장시키고 0.1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드로 GFP-AMP 융합 단백질의 발현이 0.8에서 1.0 내의 OD600에서 유도되었다. 세포는 유도 5시간 후에 4°C에서 10분 동안 9,900 × g에서 원심 분리하여 채취되었다. 세포를 용해 완충액 (150 mM 염화나트륨, 0.1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 1mM 디티오트레이톨을 함유하는 pH 7.4의 20mM 인산나트륨 완충액)에서 초음파 처리 (Sonopuls HD 2070; Bandelin, 독일)에 의해 파괴하였다.
불용성 부분은 4°C에서 20분 동안 20,000 × g 에서 원심 분리하여 분리되었다. 세포 파편, 핵산 및 세포질 단백질을 제거하기 위해 DNase (0.01 mg/mL), 리소자임 (0.1 mg/mL) 및 0.5 % Triton-X 100을 불용성 부분에 첨가하고 실온 (24°C)에서 20분간 배양했다. DNase 및 리소자임을 첨가하지 않고 펠렛 세척을 3회 반복하였다. 불용성 부분을 요소 완충액 (pH 7.4에서 8 M 요소, 500 mM 염화나트륨 및 30 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM 인산나트륨 완충액)에 용해시키고 His Trap HP 컬럼 (GE Healthcare, Chicago, IL, 미국)을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 통해 타겟 단백질을 정화하였다. 투석 및 동결 건조 후, 브롬화시안 (CNBr)을 70% 포름산의 불용성 침전물에 첨가하고 배양하여 PMAP-36에 인접한 N- 및 C-말단 GFP를 절단했다.
동결 건조로 CNBr을 제거한 후, PMAP-36은 가역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 컬럼 (DeltaPak C18 Prep column 19, 300mm; Waters, Tokyo, Japan)을 사용하여 아세토니트릴 (5%~90%) / 0.1% 트리플루오로 아세트산의 선형 구배에서 12 mL/분의 유속으로 60분 동안 정제하였다. 타깃 펩티드는 214 nm 및 280 nm의 광학 밀도에서 수집되었다. CNBr 절단 전 및 RP-HPLC 후 수집된 샘플은 각각 12% 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE) 및 16% Tris-Tricine PAGE를 사용하여 평가한 후 Bradford 분석을 사용하여 정량화했다. 생성된 PMAP-36을 분취하여 -20°C에서 보관했다. 출처 정보가 없는 화학 물질은 Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, 미국)에서 구입했다.
효소, 박테리아 균주 및 배양 배지
계란 흰자 라이소자임, 리소스타핀, 니신, 멜리틴 및 뮤타노라이신은 Sigma Aldrich에서 구입했다. 다음 박테리아는 항균 활성 분석 및 RNA 분리에 사용되었다: 황색포도상균 ATCC 6538 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, 미국), 세레우스균 ATCC 10876, 엔테로코커스 페칼리스 ATCC 29212, B군 연쇄상구균 ATCC 27956, Streptococcus dysgalactiae ATCC 27957, Streptococcus equi subsp. 유산구균 ATCC 43079, 연쇄상구균 KCTC 3657 (Korean Collection for Type Cultures, 대전, 한국), 대장균 ATCC 25922, 녹농균 ATCC 27853 및 쥐장티푸스균 ATCC 14028. E. faecalis 및 streptococci는 LB 배지에서 성장이 느리기 때문에 뇌 심장 주입 브로스 (BD Biosience)에서 배양되었다. 다른 모든 박테리아는 LB 배지에서 배양되었다.
항균 활성 평가
최소 억제 농도 (MIC)는 제조업체의 프로토콜과 임상 및 실험실 표준 연구소 지침 (2018)에 따라 Microbial Viability Assay Kit-WST (일본 구마모토 도진도)에서 지정한 비색법을 사용하여 결정되었다. 간단히 말해서, 각 박테리아의 4개 군집을 37°C에서 4-6시간 동안 5 mL LB 배지에 접종하여 박테리아가 로그 단계에 도달할 수 있도록 했다. 세포를 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)로 두 번 세척하고 105 CFU/well의 세포 밀도로 96-well 플레이트의 단일 웰에 시딩했다.
이어서, 180 μL/well의 신선한 Mueller Hinton Broth (MHB; BD Bioscience)를 플레이트에 첨가하였다. 각 펩티드 (단백질) 및 기준 항생제의 다른 농도를 10 μL의 MHB에 연속 희석하고 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 37°C에서 6시간 동안 배양하였다. 이후 10 μL의 유색 시약을 첨가하여 37°C에서 2시간 동안 세포를 배양하였으며, 암피실린과 황산 겐타마이신 (Sigma Aldrich)은 항세균 활성을 위한 대조군으로 사용되었다. UV 흡광도는 마이크로 플레이트 분광 광도계 (xMark 분광 광도계; Bio-Rad, Hercules, CA, 미국)를 사용하여 450 nm에서 각 웰에서 측정되었다. MIC 값은 처리물과 빈칸 사이의 흡광도 값 차이 (배지 및 유색 시약만 해당)가 <0.05로 감소했을 때 측정되었다. 이 실험은 세 번 수행되었다. 아세트산 (Sigma Aldrich)으로 조정된 다양한 pH 조건 (pH 5, 6 및 7)에서 PMAP-36의 MIC 값을 대장균 (ATCC 25922)에 대해 평가되었다.
세균 배양 및 준비
각 균주의 단일 군집은 각각 RNA 또는 게놈 DNA (gDNA) 추출을 위한 중간 또는 초기 고정기에 도달할 때까지 37°C의 적절한 배지에서 배양했다. 세포를 3,100 × g 및 4°C에서 7분 동안 원심 분리하여 추출한 후 멸균된 ice-cold TE 버퍼 (pH 7.4에서 10 mM Tris-HCl 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 [EDTA])로 세척했다. P. aeruginosa의 경우, EDTA에 대한 높은 민감도로 인한 펠렛 파괴를 방지하기 위해 펠렛을 세척하는 데 차가운 무균 식염수 (0.9 % 염화나트륨)를 사용했다. RNA 및 게놈 DNA 분리를 위해 약 1×109 세포가 사용되었다.
다양한 세포 용해 방법을 사용한 RNA 분리
용해 단백질을 사용한 세포 용해
세포 준비 후, 세포벽 용해 단백질 (1 및 5 mg 리소자임, 200 μg 리소스타핀, 100 μg 니신, 1 mg 뮤타노라이신 또는 100~400 μg PMAP-36, 200 μg PG-1과 멜리틴)을 함유한 RNase가 없는 물 또는 Tris-EDTA 버퍼 (pH 7.4에서 10 mM Tris-HCl 및 1 mM EDTA) 150 μL에 세포가 현탁되었다. 반응은 37°C에서 0.5~16시간 동안 배양되었다.
이어서, 1 mL의 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 세포 현탁액에 첨가하고 실온 (24°C)에서 5분 동안 배양하였다. 반응물을 최대 속도로 5분간 소용돌이를 일으켜 얼음에서 5분간 배양했다. 이어서, 200 μL 클로로포름을 용해물에 첨가하고 반전에 의해 부드럽게 혼합하였다. 용해물은 실온 (24°C)에서 5분간 배양한 후 15분 동안 20,000 x g에서 원심 분리되었다. 상층액 (600 μL)을 채취하여 새 튜브로 옮겼다. 그런 다음 동일한 부피의 75% 에탄올을 각 튜브에 첨가하고 여러 번 뒤집었다. 혼합물을 스핀 컬럼 (RNeasy Mini Kit [Qiagen, Venlo, The Netherlands])으로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출했다.
비드 비팅을 사용한 세포 용해
세포를 준비한 후, Tissuelyser II (Qiagen)에서 3분 동안 25 Hz 에서 3 mm Tungsten Carbide Bead (Qiagen)를 사용하여 비드 비팅을 수행했다. 이어서, 1 mL의 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 용해물에 첨가하고 60°C에서 5분 동안 배양하였다. 상기와 동일한 방법으로 RNA를 추출하였다.
DNA 분리 및 정제
세포 준비가 완료된 후, 세포를 200 μg PMAP36을 함유하는 DNase가 없는 물 또는 Tris-EDTA 완충액 (pH 7.4에서 10 mM Tris-HCl 및 1 mM EDTA) 150 μL에 현탁시켰다. 반응은 37°C에서 4시간 동안 배양했다. 이어서 GeneAll® ExgeneTM Cell SV mini kit (GeneAll Biotechnology, 서울, 대한민국)의 200 μL 용해 완충액 (BL 버퍼)를 세포 현탁액에 첨가하고 최대 속도로 5분 동안 소용돌이로 섞었다. 제조업체에서 제공한 약 20 μL의 프로테이나아제 K (20 mg/mL)를 용해 완충액의 용해물에 첨가하고, 56°C에서 30분 동안 배양한 다음 추가로 70°C에서 30분 동안 배양했다. 에탄올 (200 μL)을 샘플에 첨가하고 완전히 혼합한 다음 컬럼으로 옮겼다. Genomic DNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 GeneAll® ExgeneTM Cell SV 미니 키트 (GeneAll Biotechnology)를 사용하여 추출되었다.
핵산 품질 및 양 추정
핵산의 농도와 순도는 NanoDrop® ND-1000 분광 광도계 (Thermo Scientific, Waltham, MA, 미국)를 사용하여 측정되었다. 또한 RNA 무결성 번호 (RIN) 값은 4200 TapeStation System (Agilent, Santa Clara, CA, 미국)을 사용하여 추정되었다. DNA 무결성은 0.5x TAE 완충액에서 1.5% 아가로스 겔에서 분리된 DNA를 전기 영동하여 추정되었다. 전기 영동 후, 겔을 브로민화 에티듐 (Sigma Aldrich)으로 염색하고 UV 광선 아래에서 관찰했다.
16S rRNA 유전자의 증폭
정제된 RNA의 역전사는 제조업체의 지침에 따라 총 RNA 2μg을 사용하는 QuantiTect® 역전사 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행되었다. 이 연구에서 모든 박테리아 종의 16S rRNA 유전자 (GenBank 수탁 번호 L37597.1)를 증폭하기 위한 한 쌍의 범용 프라이머 (5'-TGCCAGCAGCCGCGGTAA-3' 및 5'-CCCGGGAACGTATTCACCGTAGC-3')는 PerlPrimer (v1)를 사용하여 설계되었다. v1.1.21). 각 프라이머 10 pmol, 1 μL cDNA, 1 μL dNTP (각 2.5 mM), 2 μL 10× 반응 완충액 (25 mM MgCl2, 혼합) 및 0.5U Taq 중합효소 (Solgent, 대전, 대한민국)를 포함하는 20 μL 용액은 Thermocycler 3000 (Biometra, Jena, 독일)에서 PCR을 수행하는 데 사용되었다.
PCR의 사이클링 조건은 다음과 같다: 95°C에서 3분 동안 초기 변성 단계, 이어서 30초 동안 95°C에서 29주기의 변성, 45초 동안 67°C에서 프라이머 어닐링, 72°C에서 45초 동안 연장, 72°C에서 7분 동안 최종 연장. cDNA가없는 PCR 혼합물을 음성 대조군으로 사용했다. 0.5 × Tris-acetate-EDTA (TAE) 완충액을 포함하는 1.5% 아가로스 겔 (Sigma Aldrich)에 5 μL의 PCR 산물을 넣고 100 V에서 30분 동안 전기 영동하여 결과를 확인했다. 겔을 브로민화 에티듐 (Sigma Aldrich)로 염색하고 자외선 밑에서 관찰했다.
재조합 PMAP-36 및 PG-1의 성공적인 생산
넓은 스펙트럼의 살균 활성을 보여주는 AMP인 PMAP-36과 PG-1은 광범위한 박테리아 용해 펩티드로써의 잠재력을 평가하기 위해 선택되었다. PMAP-36과 PG-1은 이전에 보고된 PMAP-36과 PG-1 발현 시스템을 사용하여 생산되었다. 단백질 추출 결과는 12% SDS-PAGE (도 1a)를 사용하여 33kDa 크기의 GFP-PMAP-36 융합 단백질의 명확한 발현을 보여주었다. 플라스크 배양 1리터의 융합 단백질 총량은 약 1.32 g이었다. 니켈 친화성 크로마토그래피 (도 1b)를 사용한 후속 정제, PMAP-36의 CNBr 절단 및 RP-HPLC를 사용한 최종 정제 결과 플라스크 배양 1 리터에서 95% 이상의 순도로 약 11 mg의 재조합 PMAP-36과 PG-1이 각각 생산되었다 (하기 표 1 및 도 1c 참조).
세포벽 용해 유도 단백질의 항균 활성
리소자임, 리소스타핀 및 AMP와 같은 세포벽 용해 단백질의 항균력과 유효 스펙트럼은 박테리아 용해 능력과 밀접한 관련이 없을 수 있다. 그러나 이 정보는 막 용해제로써의 작용 메커니즘과 효과를 이해하는 데 도움이 될 수 있다. 우리는 일반적으로 사용되는 용해 유도 시약의 살균 활성을 AMP와 함께 3개의 그람 음성 균주, 대장균, 녹농균, 쥐장티푸스균을 포함한 9개의 박테리아 종과 6개의 그람 양성 균주인 황색포도상구균, 세레우스균, 엔테로코커스 페칼리스, B군 연쇄상구균, Streptococcus dysgalactiae 및 출혈성 연쇄상구균으로 구성된 박테리아 패널에 대해 평가했다.
분석에 따르면 PMAP-36은 9가지 박테리아 종 모두에서 3 ~ 30 μg/mL 또는 0.7 ~ 7.2 μM 범위의 MIC 값을 갖는 광범위한 스펙트럼의 항균 활성을 나타낸다 (표 2). 락토코쿠스 락티스 박테리아에 의해 생성된 박테리오신인 니신은 2 ~ 16 μg/mL 또는 600 nM ~ 3.6 μM 범위의 농도에서 패널의 모든 그람 양성균에 대해 살균 활성을 나타냈다. 그람 음성 세포는 세포질 막에 대한 니신의 작용에 대한 장벽 역할을 하는 외층의 리포 다당류 성분으로 인해 니신에 내성이 있는 것으로 보고되었다. 리소스타핀 및 Staphylococcus simulans metalloendopeptidase는 S. aureus에 대해 1 μg/mL 또는 0.2 μM의 MIC 값으로 강력한 활성을 보여 효소의 적용 한계와 일치한다. 흥미롭게도, 리소자임은 640 μg/mL 농도에서도 테스트된 모든 박테리아에 대해 거의 항균 활성을 나타내지 않았다.
a 칼럼의 각 섹션 내의 모든 박테리아에 적용된 값.
b 비교를 위한 항생제.
RNA 분리에서 PMAP-36의 세포벽 용해 유도 활성
리소스타핀이 용해하기 어려운 박테리아 균주인 S. aureus에서 핵산을 분리하는데 효과적인 세포 용해 시약이라는 점을 고려할 때, PMAP-36은 리소스타핀과 유사한 응용 분야에 사용될 수 있으며, 리소스타핀보다 현저히 더 넓은 스펙트럼의 박테리아 균주 적용 가능성의 이점이 있다. 핵산 분리를 위한 세포벽 용해를 효과적으로 유도하기 위한 PMAP-36의 적용 가능성을 테스트하기 위해, 우리는 일반적으로 연구된 용해하기 어려운 박테리아인 S. aureus와 다양한 농도의 PMAP-36 및 배양 시간에서 분리된 총 RNA를 선택했다. 사용된 PMAP-36의 양은 1×109 세포의 용해를 위한 150 μL 반응에서 100, 200, 400 μg이었고, 배양 시간은 0.5에서 16시간으로 총 RNA의 수율은 0.6 ± 0.2 에서 15.5 ± 0.6 μg였다 (도 2a). 바람직한 결과는 최대 8시간의 배양으로 달성되었다. 세포 용해를 위해 PMAP-36을 사용한 고품질 RNA 분리를 위한 최적 조건은 4시간의 배양과 함께 200 μg 펩티드였다.
세포 용해제로서 PMAP-36의 효율성을 S. aureus에 대한 비드 비팅 및 리소스타핀 처리와 같이 다른 일반적으로 사용되는 용해 방법의 효율성과 비교하기 위해 다양한 방법을 사용하여 RNA 추출을 수행하고 결과를 비교했다 (표 3 및 도 3).
최대 수율 (1×109 세포에서 ~ 17 μg)은 PMAP-36을 30분 배양한 후 비드 비팅 또는 비드 비팅 없이 200 μg PMAP-36과 함께 4시간 배양한 후 얻어졌으며, 이는 PMAP-36이 S. aureus로부터 핵산 분리 (표 4 및 도 1)를 위한 세포 용해제로 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 수율은 리소스타핀 방법과 유사했다. 용해 효소나 PMAP-36을 처리하지 않고 비드 비팅 방법을 단독으로 사용했을 때, 수율은 용해 단백질을 사용하여 얻은 것보다 낮았다. 또한 리소스타핀과 PMAP-36의 조합으로 처리한 결과, 수율이 소폭 향상되었다.
a 프리 워터 RNase가 PMAP-36의 반응 버퍼로 사용됨.
b 이후 방법과 상관없이 Tris-EDTA 버퍼가 P. aeruginosa의 반응 버퍼로 사용됨.
또한 박테리아 유래 AMP 또는 박테리오신인 니신의 적용 가능성을 테스트했다. 니신은 대부분의 그람 양성 균주에 대해 PMAP-36과 동등한 MIC 값을 보였지만 다른 세포를 포함한 포도상구균 세포를 효과적으로 용해하지 못했다. 리소자임 처리는 이전에 설명한 바와 같이 S. aureus에도 효과적이지 않았다 (도 2). 리소스타핀 및 PMAP-36 처리를 모두 사용하여 분리된 RNA는 RIN 값 > 9.0, 적절한 23S/16S rRNA 비율 및 2.0 이상의 OD260/280 비율을 보였으며 이러한 매개 변수는 대부분의 분자 생물학적 응용에 적합하다 (표 2).
그람 양성균에 대한 PMAP36의 세포벽 용해 활성의 변화
그람 양성 박테리아에 단단한 세포벽이 존재하면 종종 세포가 화학적 및 효소적 용해에 대해 불응성을 갖게 되어 원하는 핵산 수율과 품질을 얻지 못한다. 우리는 황색포도상구균, 세레우스균, 엔테로커스 페칼리스 및 Streptococcus dysgalactiae 를 포함한 다양한 그람 양성 세균종의 PMAP-36 및 니신 외에도 리소자임, 뮤타놀리신 및 리소스타핀과 같은 일반적으로 사용되는 여러 세포 용해 유도제를 사용하여 RNA 분리의 효율성을 비교했다.
세포 용해 단백질을 처리하지 않은 RNA 수율은 모든 그람 양성 균주에서 매우 열악했다. 대조적으로, PMAP-36과 리소스타핀은 각각 60.1±4.5 및 54.7±4.8의 평균 수율로 세레우스균을 효과적으로 용해시켰다. 그러나 PMAP-36과 리소스타핀은 엔테로코커스 페칼리스와 S. dysgalactiae에 대해 효과가 없었지만 PMAP-36은 리소스타핀보다 약간 더 나은 용해 활성을 나타냈다. 뮤타놀리신과 니신의 처리는 그람 양성균의 세포벽 구조의 복잡성을 나타내는 두 가지 균주의 결과를 개선하지 못했다. 흥미롭게도 리소자임은 다른 그람 양성 종에 대한 효과가 없음에도 불구하고 세레우스균과 엔테로코커스 페칼리스를 모두 용해할 수 있었다. 그러나 S. dysgalactiae는 테스트된 효소나 AMP에 대한 용해성 감수성을 나타내지 않았다. 연쇄상구균은 그람 양성균이 있는 큰 속이기 때문에 PMAP-36을 이용하여 이 속 (B군 연쇄상구균, 연쇄상구균, 출혈성 연쇄상구균)에 속하는 다른 세균으로부터 RNA 추출을 수행했다. 그러나 결과는 S. dysgalactiae의 결과와 유사했다. 흥미롭게도 세레우스균의 RNA 수율은 나머지 박테리아의 수율보다 4~5배 높았는데, 이는 다른 종보다 더 큰 게놈과 세포 크기 때문일 수 있다 (도 4).
그람 음성 박테리아에 대한 PMAP-36의 광범위한 스펙트럼 세포벽 용해 활성
그람 음성 박테리아로부터 핵산 분리는 세포벽을 파괴하기 위해 EDTA와 리소자임으로 세포를 처리함으로써 성공적으로 달성되었다. 우리는 일반적으로 사용되는 그람 음성 박테리아 (예: 대장균, 녹농균 및 쥐장티푸스균; 표 4)에서 RNA를 분리할 때 PMAP36으로 유도된 세포벽 용해의 효율성을 리소자임의 효율성과 비교했다. Tris/EDTA 완충액의 소용돌이 세포 또는 리소자임 처리가 대장균 (109개 세포에서 14.3±0.6 μg 또는 13.8±0.7 μg) 및 녹농균 (21.1±0.6 또는 21.0±0.1)로부터 효율적인 RNA 분리에 적합하다는 것이 관찰되었다. 그러나 쥐장티푸스균 (0.3±0.0 또는 5.9±0.1)은 아니었다 (표 2). 이는 쥐장티푸스균의 세포벽이 다른 두 박테리아와 다르다는 것을 시사한다. 최적화된 반응 조건 (인큐베이션 4시간) 하에서 PMAP-36 처리는 대장균 및 녹농균에도 효과적이지만 쥐장티푸스균에는 효과적이지 않았다 (표 4). 그러나 PMAP-36 배양 시간을 8시간으로 연장하면 RNA의 품질이 저하되지 않고 쥐장티푸스균으로부터 RNA 수율이 현저하게 향상되었다 (RIN = 9.3). 대조적으로, 8시간 배양으로 리소자임 처리는 결과를 개선하지 못했다 (도 2b).
PMAP-36 처리 후 얻은 RNA 샘플에서 16S rRNA 유전자의 성공적인 증폭
PMAP-36 처리를 사용하여 분리된 RNA의 품질을 평가하기 위해 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 및 엔테로코커스 페칼리스에서 16S rRNA 유전자의 역전사 PCR을 수행했다 (도 5a). 모든 테스트 샘플에서 표적 서열의 효율적인 증폭이 이루어졌으며, 이는 PMAP-36 방법을 사용하여 얻은 RNA가 전사 체학을 포함한 대부분의 분자 생물학적 응용에 적합함을 나타낸다.
PMAP-36 처리를 사용하여 S. aureus에서 게놈 DNA의 효율적인 분리
RNA 분리 외에도 PMAP-36 및 리소스타핀 방법을 사용하여 황색포도상구균에서 게놈 DNA 분리를 수행했다. 초기 용해 단계를 제외하고 나머지 절차는 두 방법 간에 동일했다. 최종 DNA 수율과 품질은 두 방법 사이에서 유사했지만 겔상의 고분자량 DNA의 품질은 리소스타핀 처리보다 PMAP36 처리 후에 약간 더 나아 보였다.
멜리틴 (melittin) 및 PG-1의 MIC 측정 및 핵산 추출 효율 평가
신규 세포 용해제로서의 AMP의 기능을 측정하기 위해, 다른 항균 펩티드인 PG-1 및 멜리틴을 사용하여 보유 박테리아 종에 대해 항균 활성 분석 및 RNA 분리를 수행하였다. 멜리틴은 모든 5종의 세균 종에 대해 2 ~ 45 μg/mL 또는 0.7 ~ 15.8 μM의 MIC 값을 가져 광범위한 항균 활성을 보였으며 이는 PMAP-36와 동등한 정도였다. 그러나 PG-1에서는 더 큰 값을 보였다 (표 5). RNA 수율을 측정하였을 때, 멜리틴 처리의 결과는 S. typhimurium을 제외하고는 PG-1에서 보다 더 높았다 (표 6). 그러나 멜리틴 및 PG-1는 S. aureus.에 대항하는 RNA 분리에 요구되는 막 파괴에 PMAP-36보다 효율적이지 않았다.
세포벽 용해 단백질에 대한 민감도에 따른 세균 종 분류
박테리아 외막과 세포벽의 구조와 구성의 차이는 세포벽 용해 단백질에 대한 박테리아 민감성의 변화를 일으킬 수 있다. 막 용해 효소 및 AMP에 대한 민감도에 대해 10가지 다양한 박테리아 종 간의 유사점과 차이점을 분석했다 (표 2). 이 연구에 사용된 박테리아 종은 세포벽의 구조적 특성에 따라 프로테오글리칸 층 (단층 vs. 다층), 지질 다당류 (LPS) 함량 (높음 vs. 낮음), O- 아세틸화 (존재 vs. 부재) 및 글리신 풍부 (풍부 vs. 부족) 등 5개 그룹으로 분류됐다. 다음으로 세포벽 용해 단백질에 대한 실험적 민감도를 각 그룹에 일치시켰다 (도 6). 흥미롭게도 PMAP-36은 엔테로코커스 페칼리스 및 연쇄구균을 제외하고 시험된 박테리아 종에 대해 광범위한 스펙트럼 감도를 나타냈다.
AMP는 약물 내성 및 면역 조절 기능의 가능성이 적은 광범위한 항균 활동으로 인해 항생제 대체 물질에 대한 유망한 후보로 간주되었다. 일부 AMP는 세포 침투 펩티드로도 채택되었다. AMP의 살균 활성은 박테리아 세포 표면에 기공을 형성하고 박테리아 막을 파괴하는 능력에 의해 매개된다. 미생물에서 고품질 핵산을 준비하는 것은 게놈 분석 및 미생물 군유 전체 분석을 포함한 다양한 미생물 연구에 필수적이다. 그러나 용해하기 어려운 미생물에서 게놈 DNA 또는 총 RNA를 분리하는 것은 때때로 용해하기 쉬운 세포보다 훨씬 덜 효율적일 수 있다.
본 발명에서 발명자는 핵산 분리를 위한 박테리아 용해제로 AMP의 가능한 사용을 테스트했으며 PMAP-36이 용해하기 어려운 세포를 위한 새로운 박테리아 용해 펩티드로 독립적으로 또는 다른 물리적 용해 방법과 함께 사용될 수 있음을 입증했다. 우리는 일반적으로 사용되는 여러 박테리아 용해 방법을 사용하여 핵산 준비의 효율성을 다양한 박테리아 종에 대한 강력한 광범위한 스펙트럼 AMP인 PMAP-36의 효율성과 비교했다. 본 결과는 PMAP-36 또는 PMAP-36과 유사한 특성을 가진 다른 AMP가 박테리아 용해를 위한 새로운 도구로 효과적으로 사용될 수 있음을 보여주었다. 재조합 펩티드를 생산하는 효율적인 방법의 가용성을 고려할 때, 이 방법은 용해하기 어려운 박테리아에 대해 현재 사용 가능한 다른 용해 효소를 사용하는 것보다 비용 효율적일 수 있다. PMAP-36과 같은 광범위한 박테리아 종에 적합한 세포 용해제의 가용성은 균유전체학에서 샘플 준비 절차의 편향을 줄이고 방법론적 단순성과 편의성을 개선하는 데 기여해야 한다.
막 용해 시약에 대한 박테리아 세포의 반응은 주어진 종의 박테리아 세포벽과 외막의 구조적 특성의 간접적인 지표가 될 수 있다. 뮤라미다제 또는 N-acetylmuramide glycanhydrolase로도 알려진 리소자임은 PGN에서 N-아세틸뮤라민산 (NAM)과 N-아세틸-D-글루코사민 (NAG) 잔기 사이의 1,4-β-결합 가수 분해를 촉매하는 글리코 시드 가수 분해 효소이다. 리소자임과 EDTA 처리는 외막 LPS 구조를 불안정하게 만들기 위해 스페로플라스트를 준비하는 데 널리 사용되었다. 그람 음성 박테리아는 리소자임-EDTA 내성의 결정 인자인 LPS 함량에 따라 "거친" 및 "부드러움"의 두 그룹으로 분류되었다. 대장균 및 녹농균과 같은 매끄러운 박테리아는 LPS 함량이 높은 반면 쥐장티푸스균은 LPS 함량이 낮고 상대적으로 거칠다. 쥐장티푸스균의 외막 LPS 성분의 탄수화물 부분은 항생제, 리소자임 및 기타 제제와 같은 큰 분자의 침투를 방지하는 장벽 층의 필수 성분이라고 보고되었다. 그람 양성종 중 세레우스균과 엔테로코커스 페칼리스는 EDTA 없이도 리소자임에 취약 하였다 (표 4). 그러나 황색포도상구균과 S. dysgalactiae는 리소자임에 대한 내성을 보였는데, 이는 아마도 리소자임의 표적 부위인 β-D-N-아세틸 글루코사민에서 O-아세틸화 및/또는 세포벽 테이코산과의 결합으로 인한 것일 수 있다.
황색포도상구균의 PGN은 D-알라닌, D-글루타민, L-리신 및 D-알라닌으로 구성된 테트라펩티드 사슬에 의해 교차 연결된 β-1,4 연결된 NAM 및 NAG 잔기로 구성된 백본으로 구성된다. 이러한 테트라펩티드 사슬은 포도상구균 PGN의 고유한 특징인 펜타글리신 다리에 의해 교차 연결되어 황색포도상구균의 세포벽에 극도의 기계적 강도를 부여한다. 그러나, 가교 펜타-글리신 다리는 리소스타핀에 의해 절단될 수 있는데, 이는 황색포도상구균, S. 시뮬란스, S. 하이쿠스 및 S. 자일로서스를 비롯한 특정 포도상 구균의 PGN에서 발견되는 글리실글리신 엔도펩티다아제이다. 따라서 황색포도상구균을 리소스타핀으로 처리하면 핵산을 효율적으로 분리할 수 있다. 그러나 PMAP36이 균주에 대해 최상의 결과를 보였지만 처리 중 어느 것도 S. dysgalactiae에 대해 효율적인 세포 용해를 초래하지 않았다. S. dysgalactiae 세포벽의 화학적 조성은 글리신이 부족하거나 변형이있을 수 있으며 결과적으로 리소자임에 대한 내성 외에도 리소스타핀의 표적 부위가 부족할 수 있다.
비드 비팅을 수행하기 전에 PMAP-36으로 전처리하면 황색포도상구균에서 RNA 수율이 크게 증가했다. 따라서 동일한 프로토콜을 사용하면 결과를 확인하지는 않았지만 세포벽 용해 효소 및 AMP 유도 용해에 모두 불응성인 S. dysgalactiae로부터 핵산 분리 수율이 향상될 것으로 기대한다. 우리의 결과는 PMAP-36이 가장 광범위한 박테리아 종에 대해 용해 활성을 보였지만 PMAP-36을 포함한 용해 유도 단백질 중 어느 것도 이 연구에서 테스트된 모든 박테리아 종에 보편적으로 적용되지 않았음을 보여주었다.
특히, PMAP-36의 항균 활성의 효능은 막 용해 효율과 직접적인 관련이 없다. 예를 들어, PMAP-36의 MIC 값은 이 연구에서 세균 균주 중 S. dysgalactiae에 대해 가장 낮았지만 RNA 수율에서 추론된 막 용해 효율은 좋지 않았다. 또한, 리소자임은 극도로 높은 농도에서도 박테리아 종에 대해 항균 활성을 나타냈다. 보고된 바에 따르면 고초균의 리소자임 유도 원형질체는 성장 배지에서 배양하면 세균성 상태로 돌아갈 수 있다.
박테리아 세포벽 용해 활성의 효율성은 PMAP-36과 외막 및 LPS 구조의 상호 작용 메커니즘과 세포벽 구조의 강성에 따라 달라질 수 있다. PMAP-36은 외막 및/또는 PGN 세포벽을 통과하고 원형질막과 상호 작용하여 표면에 기공을 형성할 수 있다. 박테리아 세포 표면의 소포 형성은 전자 현미경을 사용하여 PMAP-36 처리 후 감지되었다. 이 현상은 magainin 2, temporin L, ModoCaths 및 SMAP-29와 같은 막 섭동 활동이 있는 다른 AMP에서도 발견되었다. 또한, 수포의 출현은 LPS를 연결하고 중화시키는 2가 양이온으로 인해 그람 음성 박테리아의 외막을 불안정화 하는 temporin L의 능력을 나타내는 것으로 보고되었다. 세포 표면의 이러한 수포 형성은 그람 음성 박테리아뿐만 아니라 그람 양성 박테리아에서도 발견되었다.
박테리아 용해에 필요한 PMAP-36의 양을 최소화하기 위해 PMAP-36의 양을 늘리는 대신 최적의 배양 시간을 4시간으로 결정했다. RNA의 품질은 최대 8시간의 긴 배양 기간 동안에도 분해없이 그대로 유지되었다. PMAP-36 활성은 또한 생물학적 시약에 선호되는 특성인 pH 변화에 강했다.
결론
본 발명에서 발명자는 광범위한 스펙트럼의 항균 펩티드를 사용하여 용해하기 어려운 박테리아 균주에서 대량의 고품질 핵산을 준비하는 새로운 방법을 제시하였다. 이것은 분해하기 어려운 박테리아의 세포벽 용해를 위해 AM를 이용하려는 최초의 발명이다. 본 발명의 방법은 미생물 군집 또는 도전적인 박테리아 균주에서 고품질의 편견 없는 핵산 분리를 위한 신규한 옵션을 제시한다.
추가적으로 발명자가 보유한 AMP (PG-1, 멜리틴, PMAP-36 포함) 대량 생산 기술과 접목하면 리소스타핀 보다 범용성이 뛰어나면서도 경제적인 신규 용해제로 상업적 이용이 가능할 것으로 기대되며, 실제 연구실 및 산업적 규모 모두를 포함한 세포 용해 관련 시장은 2016년 23억 달러로 2021년에는 38억 달러에 이를 것으로 전망됨에 따라 본 기술은 발전 가능성이 굉장히 클 것으로 생각된다.
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Claims (9)

  1. PMAP-36(porcine myeloid antimicrobial peptide 36) 항균 펩타이드를 포함하는 박테리아의 핵산 추출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리아는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus), 바실루스 세레우스(B. cereus), 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis), 스트렙토코커스 아갈락티애(S. agalactiae), 스트렙토코커스 디스갈락티애(S. dysgalactiae), 스트렙토코커스 쥬에피데미쿠스(S. zooepidemicus), 에스케리키아 콜리(E. coli), 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa) 또는 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium)인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 박테리아의 세포벽을 용해시키는 것인, 조성물.
  6. 제1항의 조성물을 포함하는 박테리아의 핵산 추출용 키트.
  7. 제1항의 조성물을 박테리아에 처리하는 단계를 포함하는 박테리아의 핵산 추출방법.
  8. 제1항의 조성물을 포함하는 박테리아 검출용 키트.
  9. a) 제1항의 조성물을 박테리아에 처리하여 핵산을 추출하는 단계 및
    b) 상기 박테리아의 16S rRNA를 증폭하는 단계를 포함하는 박테리아 검출방법.
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