CN115669843A - 一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，具体的步骤包括：(1)采用固相肽合成法合成随机混合肽LK；(2)将芽孢的初始OD600调整为0.5，加入80～120mg/L的混合肽LK，获得芽孢悬浮液；(3)将1L的芽孢悬浮液装入无菌的容器中；(4)将准备好的芽孢悬浮液注入高压微射流机器中，工作压力设定为400～500MPa，工作温度为60～80℃，流速为20～200L/h；(5)取出，进行平板计数，计算芽孢杀灭率。本发明提出的高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，杀菌率达到100％，对不同液体食品体系中的芽孢都有明显的杀灭效果，并且可用于液态食品的杀菌处理。
Description
技术领域
本发明属于食品杀菌技术领域，具体涉及到一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法。
背景技术
食品杀菌作为食品工业的重要环节之一，是保障我国十几亿人民“舌尖上的安全”、关系到最广大人民群众身体健康和生命安全的重要组成部分。因此，深入研究并开发新型食品杀菌技术，可以保障我国食品质量安全，提高食品工业生产效率，增强我国食品科技的核心竞争力。
细菌芽孢是食品中常见的微生物污染物，食物链中较为常见的污染物可能源自土壤、粪便、动物饲料和食品组分以及食品加工产业的各个环节，而芽孢可能存在于这些多样化的环境之中。细菌芽孢是目前人类已知的抗性最强的细胞，它能够长时间抵御各种极端的物理和化学损伤等条件。芽孢顽强的抗逆属性使得它们可以在食品加工和贮藏环节长期而持久地存在。细菌中休眠的芽孢在萌发后形成的营养细胞的生长繁殖可以在一个广泛的温度范围内发生(能够形成芽孢的细菌种类可能是嗜冷菌、中温菌或嗜热菌)。当周围环境条件不再有利于自身进一步生长时，厚壁菌门中的许多细菌便会形成芽孢。它们在新陈代谢上处于休眠状态，可以顽强地抵御各种强烈的处理方式，例如高温、干燥、辐射和包括抗生素在内的许多化学试剂，并且极有可能在环境中存活多年。许多细菌芽孢的生长或静止细胞可以分泌酶或一些毒素，这些酶或毒素会导致食物腐败变质，以及一些严重的人类疾病和中毒，包括肉毒杆菌中毒、气性坏疽、破伤风、严重且往往致命的腹泻或炭疽病等，严重威胁着人类的身体健康与生命安全。
目前，热加工可以有效杀灭芽孢，但是其杀灭温度可以达到121℃，需要20min，对食品的品质和风味造成很大的影响，口感和风味物质受到破坏。为了更好地保持食品的感官品质，超高压等非热杀菌技术被用于芽孢杀灭。已有的研究显示压力与其他处理相结合对芽孢的灭活具有协同作用，如在不同的食品体系中，600MPa/90℃处理6～8分钟可杀灭4-log嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢，600MPa结合110℃处理2～3分钟可以杀灭5-log解淀粉芽孢杆菌芽孢。此外，压力结合适当的温度和一些抗菌化合物如乳链菌肽和溶菌酶的添加，可以增加对芽孢杆菌和梭菌属芽孢的杀灭效果，如使用400MPa和121UI·mL-1的乳链菌肽在53℃下联合处理5分钟，实现对耐热芽孢杆菌芽孢6-log的杀灭效果；在400MPa的压力下联合70℃的pH 4.0缓冲液处理30分钟后，在营养琼脂中添加0.8UI·mL-1的乳链菌肽，会有6-log的芽孢被杀灭。
芽孢因其极强的抗性而很难被杀灭，从而成为食品工业面临的关键难题。超高压结合温度被广泛用于食品加工中的杀菌环节，但是其很难实现芽孢的全杀灭。因此，寻找有效杀灭芽孢的非热加工方法备受关注。本研究采用由疏水残基和阳离子氨基酸以规定的比例随机混合而成的抗菌肽混合物结合高压微射流可以实现8log芽孢的全杀灭，可用于食品工业生产，具有很好的应用前景。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提出一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，杀菌率达到100％，对不同液体食品体系中的芽孢都有明显的杀灭效果，并且可用于液态食品的杀菌处理。
为了达到上述目的，本方案采取以下技术方案：
一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，包括以下步骤：
(1)采用固相肽合成法合成随机混合肽LK；
(2)将芽孢的初始OD600调整为0.5，加入80～120mg/L的混合肽LK，获得芽孢悬浮液；
(3)将1L的芽孢悬浮液装入无菌的容器中；
(4)将准备好的芽孢悬浮液注入高压微射流机器内处理；
(5)取出，进行平板计数，计算芽孢杀灭率。
进一步的，所述混合肽LK的纯度≥95％。
进一步的，所述固相肽合成法具体步骤为：
S1：用受保护氨基酸的二元混合物进行偶联反应；
S2：合成结束后获得混合肽LK，混合肽LK在DMF中从树脂中裂解出来，用C18柱和RP-HPLC色谱法进行纯化；
S3：用冷冻干燥法对混合肽LK进行干燥；
S4：用无菌水将混合肽LK溶解成浓度为80～120mg/L的液体，并储存在棕色无菌离心管中，4℃保存备用。
进一步的，所述S1中受保护氨基酸的二元混合物为L-亮氨酸和L-赖氨酸，二者的摩尔比为1:1。
进一步的，所述S2中合成需经20个循环，获得20个肽链长度。
进一步的，所述S2中C18柱为10×250mm。
进一步的，所述步骤(4)中高压微射流条件为：工作压力设定为400～500MPa，工作温度为60～80℃，流速为20～200L/h。
有益效果
与现有技术相比，本发明具备的有益效果是：
1.本发明中混合肽LK可以诱导芽孢萌发或使其外层膜结构松散，在高压微射流的压力和对撞作用，又会产生空穴、气旋等效应，使失去抗性胡芽孢更易被杀灭，可有效杀灭～8log的细菌芽孢。
2.本发明可以降低杀灭所需的工作压力，缩短所需工作时间。
3.本发明能更好地保持果蔬等热敏食品的感官品质。
有益效果
图1为实施例1不同浓度混合肽LK结合高压微射流对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果图。
图2为实施例2不同温度下高压微射流结合混合肽LK对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果图。
图3为实施例3不同处理压力对高压微射流结合混合肽LK(DHPM-LK)的枯草芽孢杆菌芽孢杀灭效果图。
图4为对比例1高压微射流结合乳链菌肽和溶菌酶处理后对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果与高压微射流结合混合肽LK处理后对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果的对比图。
图5为对比例2不同食品肽(枸杞肽、大豆肽、燕麦肽、鳕鱼肽和猪皮肽)处理后枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述项的，而不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1不同浓度混合肽LK下结合高压微射流对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果
将不同浓度的混合肽LK分别与高压微射流结合，分析不同浓度混合肽LK处理条件下芽孢的杀灭效率。如图1所示，与对照组(混合肽LK添加量为0)相比，高压微射流(本申请中选择500MPa/70℃)结合0.1μg/mL混合肽LK对芽孢的杀灭效果没有明显变化，1μg/mL和10μg/mL浓度的LK可以杀灭5-log的芽孢，而100μg/mL的混合肽LK可以杀灭7.83-log的芽孢。这个结果说明芽孢的杀灭效果随着混合肽LK处理浓度的增加而增加，并且高压微射流结合100μg/mL LK可以杀灭7.83-log的芽孢。
实施例2不同温度下高压微射流结合混合肽LK对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果
上面的结果显示500MPa与70℃结合不同浓度混合肽LK可以有效杀灭枯草芽孢杆菌芽孢，本实施例进一步研究40、50、60、70和80℃条件下，枯草芽孢杆菌芽孢的致死率，结果如图2所示，500MPa/40℃结合100μg/mL混合肽LK可以杀灭2.98-log的芽孢，500MPa/50℃下可以杀灭～5-log的芽孢，而在500MPa/60℃，500MPa/70℃和500MPa/80℃条件下可以杀灭6.02-log、7.83-log和7.95-log的芽孢。这个结果表明高压微射流结合混合肽LK处理时处理温度与芽孢杀灭效果存在正相关的关系，且高压微射流(500MPa/60～80℃)结合0.1μg/mL LK可以杀灭(6～8)-log的芽孢。
实施例3不同处理压力对高压微射流结合混合肽LK(DHPM-LK)的枯草芽孢杆菌芽孢杀灭效果的影响
选择温度为70℃，混合肽LK浓度为100μg/mL，处理压力分别设置为200MPa、300MPa、400MPa和500MPa。通过平板计数实验(结果如图3所示)，发现200MPa、300MPa和400MPa的高压微射流结合LK处理后，芽孢的致死数目分别为1.21-log、2.24-log和3.78-log。而处理压力为500MPa时，可以使7.83-log芽孢被全部杀灭。以上结果说明，处理压力对芽孢杀灭具有一定的影响，并且500MPa/60℃结合100μg/mL LK处理可以杀灭～8log芽孢。
实施例4不同水分活度(Aw)和pH条件下DHPM-LK对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果
研究高压微射流结合混合肽LK对芽孢杀灭的处理条件是否适用于不同的食品体系，分析了不同水分活度(Aw)和pH条件下DHPM-LK对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果。结果如表1所示，在相同的Aw下，随着pH值的升高，芽孢致死数目差别不大，如，当Aw为0.99时，pH值分别为3.8，4.6，5.2和7.3时，芽孢的致死数目分别为0.64、0.31、0.18和0.05log CFU/mL。另外，在pH值固定时，随着Aw的降低，芽孢的致死数目也没有太大变化。这说明在25℃室温条件下静置2h，不同Aw和pH条件的溶液中芽孢数目没有发生显著变化。而500MPa/70℃结合100μg/mL LK处理可以使7.63-log的枯草芽孢杆菌的芽孢全部被杀灭，这表明DHPM-LK对芽孢的杀灭效果不受pH和Aw的影响。
表1不同Aw和pH值溶液中枯草芽孢杆菌芽孢数量(log CFU/mL)的变化情况
实施例5不同食品体系中DHPM-LK对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果
以上结果都说明500MPa/70℃结合100μg/mL混合肽LK处理可以使枯草芽孢杆菌的芽孢全部被杀灭。为了进一步验证DHPM-LK在不同食品体系中的杀菌效果，我们分别将苹果汁、橙汁、全脂牛奶、低脂牛奶和脱脂牛奶作为验证的食品体系，加入106CFU/mL芽孢(表2)。经过以上实验确定的DHPM-LK条件处理后，5种食品体系中的芽孢都全部被杀灭。这5种食品体系的Aw为0.958～0.977，pH值为4.43～7.15，对于芽孢的杀灭没有任何的影响。这些结果说明，500MPa/70℃结合100μg/mL混合肽LK的处理方式对不同液体食品体系中的芽孢都有明显的杀灭效果，并且可用于液态食品的杀菌处理。
表2不同食品体系中DHPM-LK对芽孢的杀灭效果
实施例6DHPM-LK对苹果汁品质影响
选取30名志愿者对500MPa/60℃结合100μg/mL LK处理的苹果汁产品进行感官评价，感官评价内容主要包括苹果汁产品的香味、滋味、外观和颜色，它们的分值分别为30分，30分，30分和10分，总分100分。其中，未处理为DHPM-LK处理前的苹果汁，90℃的处理时间为1min。感官评价结果如表3所示，与未处理组相比较，500MPa/60℃处理得到的苹果汁的香气、口感和外观均有所变化，但是明显优于90℃处理的苹果汁。
表3不同处理条件下苹果汁感官评价结果
| 香味 | 滋味 | 外观 | 颜色 | 总分 | |
| 未处理 | 27.1 | 25.9 | 21.2 | 7.9 | 82.1 |
| 90℃处理 | 19.2 | 20.5 | 22.3 | 6.8 | 68.8 |
| 500MPa/60℃ | 24.7 | 23.5 | 23.1 | 8.0 | 79.3 |
对比例1高压微射流结合乳链菌肽和溶菌酶对芽孢的杀灭效果
分别将100μg/mL乳链菌肽(Nisin)和溶菌酶(lysozyme)与枯草芽孢杆菌芽孢的悬浮液混合，进行高压微射流处理。结果如图4所示，500MPa/70℃结合100μg/mL乳链菌肽和溶菌酶分别可以杀灭3.98log和3.36log的芽孢，而500MPa/70℃结合100μg/mL LK可以杀灭7.83-log的芽孢。这说明DHPM-LK杀灭芽孢的效果要远远好于高压微射流结合乳链菌肽和溶菌酶的杀灭效果。
对比例2
利用多种购买的食品级肽，包括枸杞肽、大豆肽、燕麦肽、鳕鱼肽和猪皮肽，结合高压微射流处理(500MPa/60℃)，对枯草芽孢杆菌芽孢的杀灭效果如图5所示，结果显示，用购买的上述食品级肽处理后，不同食品级肽对芽孢的杀灭效果差别没有显著性，大约可以杀灭3～4log芽孢。与本申请的可以达到7.83-log芽孢被全部杀灭的效果相距甚远。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，但本发明并不局限于上述具体步骤，任何包含实施例中所述步骤或者对本发明的原料进行替换，添加辅助成分，改变具体处理量，改变具体操作模式等做法，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (7)
1.一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用固相肽合成法合成随机混合肽LK；
(2)将芽孢的初始OD600调整为0.5，加入80～120mg/L的混合肽LK，获得芽孢悬浮液；
(3)将1L的芽孢悬浮液装入无菌的容器中；
(4)将准备好的芽孢悬浮液注入高压微射流机器内处理；
(5)取出，进行平板计数，计算芽孢杀灭率。
2.根据权利要求1所述的一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，其特征在于：所述混合肽LK的纯度≥95％。
3.根据权利要求1所述的一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，其特征在于：所述固相肽合成法具体步骤为：
S1：用受保护氨基酸的二元混合物进行偶联反应；
S2：合成结束后获得混合肽LK，混合肽LK在DMF中从树脂中裂解出来，用C18柱和RP-HPLC色谱法进行纯化；
S3：用冷冻干燥法对混合肽LK进行干燥；
S4：用无菌水将混合肽LK溶解成浓度为80～120mg/L的液体，并储存在棕色无菌离心管中，4℃保存备用。
4.根据权利要求3所述的一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，其特征在于：所述S1中受保护氨基酸的二元混合物为L-亮氨酸和L-赖氨酸，二者的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求3所述的一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，其特征在于：所述S2中合成需经20个循环，获得20个肽链长度。
6.根据权利要求3所述的一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，其特征在于：所述S2中C18柱为10×250mm。
7.根据权利要求1所述的一种采用高压微射流结合混合肽有效杀灭芽孢的方法，其特征在于：步骤(4)中高压微射流条件为：工作压力设定为400～500MPa，工作温度为60～80℃，流速为20～200L/h。
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