CN101356990A - 食品超高压低温杀菌方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品超高压低温杀菌方法，将乳酸链球菌素加入到流体食品中，在温度为30℃～70℃、压力为300MPa～700MPa的条件下处理7.5min～17.5min，其中流体食品中乳酸链球菌素的浓度为0IU/ml～333IU/ml。本发明所确定的工艺条件可以在对流体食品主要成份基本无影响的条件下对细菌的杀灭达到6个数量级，而在所优化的条件之上更可达到6个数量级以上，完全适应并保证了流体食品的杀菌性能。

Description

食品超高压低温杀菌方法

技术领域

本发明属于食品杀菌领域，具体涉及一种优化食品超高压低温杀菌工艺。

背景技术

食品超高压杀菌技术是一种有效的低温灭菌物理手段，将食品密封于高压容器，在高压下(大于100MPa一般称为超高压)处理一定时间，可达到食品保藏的目的。传统的食品处理方法如热杀菌(121℃，15～20min)、冷冻保藏、干制、盐渍、添加防腐剂等，会造成食品中某些营养成分尤其是天然生理活性成分的巨大损失，会造成食品质量与安全性问题。鉴于此，一项能最大限度地保持食品原有品质的高效安全处理新技术——超高压技术顺势而生，并快速发展起来。

1986年，日本京都大学林力丸教授率先开展了超高压食品的研究，引起日本食品界浓厚的兴趣和关注。1991年4月，超高压食品——系列果酱问世，引起世界轰动，被誉为21世纪食品。随之，欧美等国相继开展这方面的研究。国外研究结果表明，超高压处理技术作用均一迅速，无大小和形状的限制，能保证食品在微生物方面的安全；对食品的营养及生理活性成分等天然结构几乎无影响，能保存食品原有的营养；可避免热杀菌带来的异臭及异常物质的生成，很好地保持了食品原有的天然风味物质；可减缓食品组分间的美拉德反应速度，改善食品的口感及感官特性；同时，能最大限度地保持食品原有的色泽与弹性等。目前，日本在超高压食品加工方面仍居国际领先水平，欧美等国相继对超高压食品的原理、方法、技术细节及应用前景进行了广泛的研究，其深度和广度不断扩大。

20世纪80年代中期，我国开始超高压食品的研究，部分学者的研究工作引起了食品界和相关学科人士的关注。

食品高压加工技术是食品加工业的一次重大技术进步，至今为止，高压食品杀菌没有统一标准的食品超高压杀菌工艺条件。因此，优化食品超高压低温杀菌技术工艺条件具有重要的意义，为食品超高压加工工业提供理论依据的技术支持。

发明内容

本发明的目的是针对现有的高压食品杀菌技术较混乱的情况，采用响应曲面法来考察几个主要参数对超高压低温杀菌的影响并建立起数学模型，再通过实验验证从而得到了优化食品超高压低温杀菌工艺。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种食品超高压低温杀菌方法，将乳酸链球菌素加入到流体食品中，在温度为30℃～70℃、压力为300MPa～700MPa的条件下处理7.5min～17.5min，其中流体食品中乳酸链球菌素的浓度为0IU/ml～333IU/ml。

其中处理温度优选为53℃～70℃，处理压力优选为551MPa～700MPa，处理时间优选为12.4～17.5min，流体食品中的乳酸链球菌素的浓度优选为132IU/ml～333IU/ml。本发明的各优选参数可以完全杀灭六个数量级以上的细菌。

本发明的目的具体可以通过以下方法达到：

乳酸链球菌素(Nisin)，又称乳球菌肽或乳链菌肽，是从乳酸链球菌发酵物中提取的一种多肽抗菌类物质，为一种世界公认的安全天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。然而，目前还没有任何一种食品防腐剂能够有效地抑制和杀灭所有微生物而能安全地使用于所有食品中。肉毒梭状芽孢杆菌是一种严重的毒素性食物中毒的病原菌，其芽孢较耐热，一般煮沸需1～6h才能杀死，或121℃高压蒸汽下需经15～20min才能杀死，本菌是引起食物中毒的病原菌中抵抗力最强的菌种之一，罐头杀菌效果如何，一般以该菌作为指示细菌。芽孢是整个生物界抗逆境最强的生命体，在抗热、抗化学药物、抗高压、抗辐射等方面首屈一指，湿热杀菌(121℃，15～20min)才能有效杀灭芽孢，不过食品的营养破坏比较严重。

因此，本发明以常规杀菌效果的指标菌(引起人类致病的肉毒梭状芽孢杆菌)的芽孢为试材，考察压力(300～700MPa)、底温(30～70℃)、乳酸链球菌素(0～333IU/mL)和保压时间(7.5～17.5min)对杀灭肉毒梭状芽孢杆菌213B芽孢的影响，建立了超高压、低温结合乳酸链球菌素杀灭肉毒梭状芽孢杆菌芽孢的二次多项数学模型，优化食品超高压低温杀菌技术工艺参数，建立食品超高压、低温杀菌工艺标准。

实现本发明方法的步骤如下：

A.肉毒梭状芽孢杆菌213B芽孢的准备：

肉毒梭状芽孢杆菌213B购自于中国药品生物制品检定所，将其接种于梭状芽孢杆菌加强肉汤(Reinforced clostridial medium broth，RCMB)，于30℃厌氧培养24h，将0.1mL的RCMB培养液用无菌玻璃涂布棒涂布于无菌WSH琼脂平板上，30℃厌氧培养，肉毒梭状芽孢杆菌在WSH琼脂平板上形成芽孢，10天后，通过相差显微镜检肉毒梭状芽孢杆菌213B芽孢达数90-99％，用无菌的0.03mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)洗下，转入放有无菌玻璃珠的瓶内，振荡5min。将滤液放入80℃的水浴中处理10min后，离心(5 000r/min，15min)，将菌体沉淀加无菌0.03mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)配成10⁹CFU/mL肉毒梭状芽孢杆菌213B芽孢悬液，置于4℃冰箱备用。(WSH琼脂配方：20g牛肉膏，3g酵母膏，0.5g半胱氨酸盐酸盐，5g碳酸钙，40g鸡蛋白，琼脂15g，1L蒸馏水，pH 7.0)。

B.乳酸链球菌素溶液的准备及其高压处理

乳酸链球菌素购自于Aplin & Barrett公司，称取一定量的乳酸链球菌素样品溶于0.02M盐酸溶液中，配成10⁶IU/g乳酸链球菌素的母液，用0.22μm滤膜过滤法除菌。将一定量的乳酸链球菌素母液加到上述213B芽孢悬液，按照发明设计制备成一系列乳酸链球菌素浓度为0～333IU/mL的213B芽孢悬液，将其分装于5ml的医用无菌塑料瓶，热封口(不留顶隙)，冷藏备用。按照试验设计控制高压介质温度，待样品温度与高压介质温度达到平衡后，进行超高压处理，升压速度及卸压速度分别为150MPa/min、300MPa/min，每个样品重复3次，以未经超高压处理的芽孢悬液作为对照。

C.肉毒梭状芽孢杆菌213B芽孢存活测定

213B芽孢经高压处理后立即对其进行存活数的测定，以无菌的0.03mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)适当稀释对照及超高压处理后的213B芽孢悬液，于WSH琼脂平板30℃厌氧培养72h后，进行菌落记数，检测限为1CFU/mL。

D.本发明设计：

采用中心组合旋转设计(Central composite rotatable design，CCRD)模型，以压力、乳酸链球菌素、温度和保压时间为主要的考察自变量，分别以X₁、X₂、X₃、X₄表示，并以+2、+1、0、-1、-2分别代表自变量的高、中、低水平，按方程x_i＝(X_i-X₀)/ΔX对自变量进行编码。其中，x_i为自变量的编码值，X_i为自变量的真实值，X₀为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长，因子编码及水平见表1。

              表1  因素水平及编码的设计

^ax₁＝(X₁-500)/100；x₂＝(X₂-167)/83；x₃＝(X₃-50)/10；x₄＝(X₄-12.5)/2.5.

213B芽孢的死亡数量级Y为评价指标(响应值)，由方程Y＝-log₁₀N_t/N₀求得，式中N_t为超高压处理后1ml芽孢悬液中的存活芽孢数，N₀为对照1ml芽孢悬液中的芽孢数。设超高压作用下213B芽孢的死亡数量级的预测模型由最小二乘法拟合的二次多项方程为：

$Y=B_0+\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{B}_i{x}_i+\underset{i<j}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{B}_{\mathrm{ij}}{x}_i{x}_j+\underset{j=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{B}_{\mathrm{ij}}{x}_j^2,---\left(1\right)$

(1)式中，n＝4，则方程(1)可转换为：

Y＝B₀+B₁x₁+B₂x₂+B₃x₃+B₄x₄+B₁₂x₁x₂+B₁₃x₁x₃+B₁₄x₁x₄+B₂₃x₂x₃+B₂₄x₂x₄+B₃₄x₃x₄+B₁₁x₁ ²+B₂₂x₂ ²+B₃₃x₃ ²+B₄₄x₄ ²           (2)

其中(2)式中，Y为预测响应值，B₀为常数项，B₁、B₂、B₃、B₄分别为线性系数，B₁₂、B₁₃、B₁₄、B₂₃、B₂₄、B₃₄分别为交互项系数，B₁₁、B₂₂、B₃₃、B₄₄分别为二次项系数。为了求得方程(2)的各项系数，需30组试验求解(表2)。数据处理采用统计软件Design expert(6.0.5版)来完成，设计及结果见表2。

                表2  发明的设计及其结果

处理方式：

A.213B芽孢经高压处理后失活模型的建立及其显著性检验：

利用Design expert软件对表2数据进行多元回归拟合，得超高压杀灭213B芽孢的数量级对自变量压力(x₁)、乳酸链球菌素(x₂)、温度(x₃)和保压时间(x₄)的二次多项回归模型方程为：

Y＝6.450+1.033x₁+0.401x₂+0.359x₃+0.344x₄-0.247x₁ ²-0.347x₂ ²-0.147x₁x₄，(3)

对该模型进行方差分析，结果见表3。模型系数显著性检验见表4。

                       表3  模型方差分析

R＝0.9807  R²＝0.9618

                       表4  模型系数显著性检验

由表3方差分析可以看出：F＝26.97＞F_0.01(14，5)＝9.77，P＜0.0001，表明模型方程(3)极显著；F＝0.86＜F_{0.05(14，10)}＝4.60，P＝0.6084＞0.05，表明失拟项不显著；模型的校正决定系数 $R_A^2\mathrm{dj}=0.9261,$ 说明该模型能解释92.61％响应值的变化，说明该模型拟合程度良好，误差小，该模型是合适的，可以用此模型分析和预测超高压杀灭213B芽孢的数量级。从表4可知模型各项系数的显著性。

B.超高压低温杀菌技术工艺参数的优化

模型(3)的响应面及其等高线图解见图1～2。因食品原料污染的微生物总数量小于10⁶CFU/mL或10⁶CFU/g，以杀灭6个数量级的213B芽孢为标准来优化超高压杀菌条件。

图1和图2显示了温度和保压时间最佳值分别为53℃，12.4min时，压力和乳酸链球菌素对灭活213B芽孢的影响。从图1和图2可以看出，随压力和乳酸链球菌素浓度的增大，213B芽孢的死亡显著增加。压力和乳酸链球菌素浓度分别在510～600MPa和90～250IU/ml时，213B芽孢死亡数量级大于6，欲灭活其6个数量级，对模型(3)解逆矩阵得杀菌条件为：压力551MPa，乳酸链球菌素浓度132IU/ml。

图3和图4显示了压力和乳酸链球菌素浓度最佳值分别为551MPa，132IU/ml时，温度和保压时间对灭活213B芽孢的影响。从图3和图4可以看出，随温度升高和时间的延长，213B芽孢的死亡急剧增加，温度和时间分别在45～60℃和11.2～15min时，213B芽孢死亡数量级大于6，欲灭活其6个数量级，对模型(3)解逆矩阵得杀菌条件为：温度53℃，时间12.4min。

C.模型的验证

对超高压杀菌模型方程(3)的合适性和有效性进行了检验，其结果见表5。

                      表5  模型的验证结果

利用SPSS(10.0版)对表5数据进行相关性和显著性分析，213B芽孢死亡数量级Y实测值和预测值的相关系数为0.9991，显著水平P＜0.0001，表明模型(3)是合适有效的。

D.优化条件的验证

为了检验超高压杀菌对食品营养组份的影响以及对模型(3)所优化的最低杀菌条件压力551.0MPa、乳酸链球菌素浓度132IU/ml、温度53.0℃、时间12.4min的合理性。以牛奶为原料分别接种枯草芽孢杆菌As1.1849芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌As1.1923芽孢、213B芽孢及金黄色葡萄球菌As1.1861，调整细菌细胞的浓度使其在牛奶中的数量在(8.2±3.1)×10⁶cfu·ml^-1的范围内，将其分装于100ml的无菌塑料瓶，热封口(不留顶隙)，控制高压介质温度，待样品温度与高压介质温度达到平衡后，按照上述优化条件进行处理，然后立即对牛奶中微生物数量及营养成分进行测定。经上述超高压杀菌条件处理前后牛奶主要营养组份的变化结果见表6。

                   表6  超高压对牛奶主要营养组分的影响(n＝10)

^a表示平均值±标准差

从表6可以看出牛奶经超高压杀菌前后主要营养成份蛋白质、脂肪、碳水化合物、pH变化差异不显著(P＞0.05)，说明超高压杀菌对食品主要成份基本上没有影响。

超高压处理前对照组牛奶中的细菌总数为(8.2±3.1)×10⁶cfu·ml^-1，而经超高压杀菌后处理组的细菌总数为0cfu·ml^-1，保存12个月后经检验细菌总数仍为0cfu·ml^-1。最终证明模型(3)所优化的杀菌条件压力551.0MPa、乳酸链球菌素浓度132IU/ml、温度53.0℃、时间12.4min是合适有效的，具有一定的实践指导意义。

本发明所确定的工艺条件可以在对流体食品主要成份基本无影响的条件下对细菌的杀灭达到6个数量级，而在所优化的条件之上更可达到6个数量级以上，完全适应并保证了流体食品的杀菌性能。

附图说明

图1是压力和乳酸链球菌素及其交互作用对杀灭213B芽孢影响的响应面；

图2是压力和乳酸链球菌素及其交互作用对杀灭213B芽孢影响的等高线；

图3是温度和保压时间及其交互作用对超高压低温杀灭213B芽孢影响的响应面；

图4是温度和保压时间及其交互作用对超高压低温杀灭213B芽孢影响的等高线。

具体实施方式

实施例1

以牛奶为原料分别接种枯草芽孢杆菌As1.1378芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌As1.1865芽孢、213B芽孢、蜡状芽孢杆菌As1.1626金黄色葡萄球菌As1.1529、鼠伤寒沙门氏菌1.1194及大肠杆菌As1.1671，调整细菌细胞的浓度使其在牛奶中的数量在(9.1±2.1)×10⁶cfu·ml^-1的范围内，并加入乳酸链球菌素140IU/ml，将其分装于100ml的无菌塑料瓶，热封口(不留顶隙)，控制高压介质温度，待样品温度与高压介质温度达到54℃平衡后，加压569MPa进行超高压处理15min，然后立即对牛奶中微生物数量及营养成分进行测定。

牛奶中的主要营养成份损失率低于0.02％，细菌总数为0cfu·ml^-1，常温保存3个月后经检验细菌总数仍为0cfu·ml^-1。

实施例2

以牛奶为原料分别接种枯草芽孢杆菌As1.1378芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌As1.1865芽孢、213B芽孢、蜡状芽孢杆菌As1.1626金黄色葡萄球菌As1.1529、鼠伤寒沙门氏菌1.1194及大肠杆菌As1.1671，调整细菌细胞的浓度使其在牛奶中的数量在(9.1±2.1)×10⁶cfu·ml^-1的范围内，并加入乳酸链球菌素300IU/ml，将其分装于100ml的无菌塑料瓶，热封口(不留顶隙)，控制高压介质温度，待样品温度与高压介质温度达到66℃平衡后，加压669MPa进行超高压处理12.4min，然后立即对牛奶中微生物数量及营养成分进行测定。

牛奶中的主要营养成份损失率低于0.04％，细菌总数为0cfu·ml^-1，常温保存3个月后经检验细菌总数仍为0cfu·ml^-1。

实施例3

以豆奶为原料分别接种枯草芽孢杆菌As1.1378芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌As1.1865芽孢、213B芽孢、蜡状芽孢杆菌As1.1626金黄色葡萄球菌As1.1529、鼠伤寒沙门氏菌1.1194及大肠杆菌As1.1671，调整细菌细胞的浓度使其在豆奶中的数量在(9.1±2.1)×10⁶cfu·ml^-1的范围内，并加入乳酸链球菌素210IU/ml，将其分装于100ml的无菌塑料瓶，热封口(不留顶隙)，控制高压介质温度，待样品温度与高压介质温度达到60℃平衡后，加压612MPa进行超高压处理16min，然后立即对豆奶中微生物数量及营养成分进行测定。

豆奶中的主要营养成份损失率低于0.03％，细菌总数为0cfu·ml^-1，常温保存3个月后经检验细菌总数仍为0cfu·ml^-1。

实施例4

以牛奶为原料分别接种枯草芽孢杆菌As1.1378芽孢、嗜热脂肪芽孢杆菌As1.1865芽孢、213B芽孢、蜡状芽孢杆菌As1.1626金黄色葡萄球菌As1.1529、鼠伤寒沙门氏菌1.1194及大肠杆菌As1.1671，调整细菌细胞的浓度使其在牛奶中的数量在(9.1±2.1)×10⁶cfu·ml^-1的范围内，并加入乳酸链球菌素129IU/ml，将其分装于100ml的无菌塑料瓶，热封口(不留顶隙)，控制高压介质温度，待样品温度与高压介质温度达到51℃平衡后，加压545MPa进行超高压处理14min，然后立即对牛奶中微生物数量及营养成分进行测定。

牛奶中的主要营养成份损失率低于0.02％，细菌总数低于11cfu·ml^-1。

Claims (5)

1、一种食品超高压低温杀菌方法，其特征在于将乳酸链球菌素加入到流体食品中，在温度为30℃～70℃、压力为300MPa～700MPa的条件下处理7.5min～17.5min，其中流体食品中乳酸链球菌素的浓度为0IU/ml～333IU/ml。

2、根据权利要求1所述的食品超高压低温杀菌工艺，其特征在于所述的处理温度为53℃～70℃。

3、根据权利要求1所述的食品超高压低温杀菌工艺，其特征在于所述的处理压力为551MPa～700MPa。

4、根据权利要求1所述的食品超高压低温杀菌工艺，其特征在于所述的处理时间为12.4min～17.5min。

5、根据权利要求1所述的食品超高压低温杀菌工艺，其特征在于所述的流体食品中的乳酸链球菌素的浓度为132IU/ml～333IU/ml。

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