KR20060091557A

KR20060091557A - 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법

Info

Publication number: KR20060091557A
Application number: KR1020050012504A
Authority: KR
Inventors: 강상모; 박동훈
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2005-02-15
Filing date: 2005-02-15
Publication date: 2006-08-21

Abstract

본 발명은 식품이나 각종 원료 등에 쉽게 혼입될 수 있는 유해 미생물 중 곡류, 채소류, 메주 등에 존재하며 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물을 살균 또는 저감화 시키는 방법에 관한 것으로, 유기 영양질소원 또는 열충격을 실시하여 상기 유해 미생물의 포자 발아를 유도하여 살균 또는 저감화 시키는 방법이다.

본 발명에 따른 방법을 생식이나 장류의 제조 과정에 적용할 경우, 원료와 제품의 제조 과정에서 혼입된 유해균을 효과적으로 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 제품의 품질을 향상시켜주는 효과를 얻을 수 있다.

바실러스 세레우스, 클로스트리디움 퍼프린젠스, 식중독균, 포자, 발아, 살균

Description

포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법 {Method for sterilization or reducing the spore-forming bacteria and other microorganisms}

본 발명은 식품이나 각종 원료 등에 쉽게 혼입될 수 있는 유해 미생물의 살균 또는 저감화 시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 곡류, 채소류, 메주 등에 존재하며 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물을 살균 또는 저감화 시키는 방법에 관한 것이다.

식중독은 병원성 미생물이 음식물에 존재하였다가 적당한 환경 혹은 체내에서 증식하여 독소 등을 내뿜어 발생하게 되는데, 대표적인 식중독 관련 세균으로는 살모넬라(Salmonella), 포도상구균(Staphylococcus), 대장균(E. coli), 캠필로박터(Campylobacter jejuni), 리스테리아(Listeria monocytogenes), 보툴리누스(Clostridium botulinum), 웰치균(Clostridium welchii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움(Clostridium), 비브리오(Vibrio), 여시니아(Yersinia) 등이 있다.

이 밖에도 우리나라에서는 식품공전의 규정에 의해 각종 식품류의 미생물에 관한 안전 기준이 제시되어있으며, 종류에 따라 다소 차이는 있지만 이들 식중독에 관련되는 미생물을 철저히 감독하고 있으며, 일반 미생물의 수도 규정된 허용치 이내로 제한하고 있다.

바실러스 세레우스는 주로 곡류나 두류에 많이 분포하는 토양 유래의 미생물로 체내에 들어와 직접 위장염을 일으키기도 하고, 다른 식중독에 비해 증세가 비교적 경미하나, 심내막염, 패혈증, 화농성질환 등을 야기할 수 있다. 조리 후 냉각 과정동안 수시간 상온에 방치된 고기, 야채, 쌀, 스프 등이나 저온살균 후의 낙농제품에서도 포자가 발아하여 세균이 증식된다. 식품 내에서 균이 증식하면 구토를 유발하거나 설사를 유발시키는 2가지 독소를 분비한다.

따라서, 생식 혹은 이유식과 같이 곡류와 두류가 주원료이면서 제품 특성상 고온·고압 멸균을 행하기 어려운 제품의 경우, 제거하기가 매우 어렵다. 그 외에도 주로 곡류에 존재하면서 포자를 형성하여 살균이 어려운 세균들은 바실러스 속이 주를 이루는데, 이들 또한 쉽게 제거되지 아니하여 식품의 오염균으로 존재하는 경우가 매우 많다.

클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringenes) 또한 오래 전부터 식중독 및 상처감염증의 원인균으로 알려져 왔으며, 불완전하게 열처리된 식품 중에 잔존하였다가 빠르게 증식하여 질병을 유발시킨다.

상기 균주는 혐기성이나, 산소에 어느 정도 내성을 가지고 있어 최소한의 산화환원전위만 있으면 생육이 가능하다.

클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 혐기성균으로 매우 강력한 식중독을 일으키나, 일반적으로 균주를 분양받을 수 없다.

그러나, 생육 조건이 클로스트리디움 퍼프린젠스와 거의 유사하므로 클로스트리디움 퍼프린젠스의 실험 결과를 대신할 수 있으며(식품살균론, 100~109 페이지, 정동효 저, 대광출판사, 1991), 이는 본 발명에도 적용됨을 밝혀둔다.

고기, 생선, 야채, 꿀 등을 통해 이상 증식된 보툴리누스균이 생산하는 신경독소에 의해 사람이나 동물에 감염이 되며, 구토, 구역질, 시각장애, 입이나 목의 경련, 피로, 호흡장애, 복통, 설사, 변비 등의 증상을 일으키며, 심할 경우에는 신경독소가 신경전달을 차단하여 마비시키기도 한다.

생식의 경우, 여러 가지 곡류나 채소류, 버섯류, 해조류, 과일 등 대부분의 원료를 익히지 않고 저온(60 ℃ 이내)에서 건조하여 제조함으로서 인위적인 살균이나 가열 과정을 거치지 아니하므로 원료의 처리나 제조과정에 있어 미생물이 혼입될 우려가 많다. 특히, 시판되는 생식류 제품의 경우 다른 유해 미생물보다 상대적으로 바실러스속 세균들의 검출이 두드러지고 있으며, 그 중에서 바실러스 세레우스 검출이 최근 들어 문제시 되고 있다.

따라서, 제품의 원료나 제조 공정 중에 혼입될 수 있는 유해한 미생물을 효과적으로 제어하는 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

반면, 장류의 경우, 메주를 소금물에 담그고, 장시간 효소분해와 숙성과정을 거쳐 만들게 된다. 이때, 이미 메주를 띄울 때 균들이 자라서 포자를 다량 형성하거나, 장류를 담글 시 포자가 형성되어 출하 제품에 혼입될 가능성도 있다.

대부분의 병원성 미생물들은 열에 약하기 때문에 65 ℃ 이상의 온도에서 쉽게 사멸하지만 포자를 형성하는 세균 포자의 경우 내열성이 강하기 때문에 저온 열처리만으로 포자를 제어하기란 매우 어려운 일이다.

특히, 상술한 바와 같이 식중독균 중 하나인 바실러스 세레우스의 경우, 포자로부터 발아한 영양세포는 내열성이 약해 제거하기 쉽지만, 이들의 포자는 내열성이 매우 강하여 100 ℃에서도 쉽게 사멸되지 않고 오랜 시간을 견딜 수 있다.

식품위생규격 중 하나인 위해요소 중점관리제도(Hazard Analysis Critical Control Point, HACCP) 자료에서도 바실러스 세레우스 포자를 일반적인 조리방법으로 살균할 수 없다고 밝히고 있다.

상기와 같은 세균의 내성 포자의 발아를 유도시키는 방법으로는 아미노산, 당 등의 영양물질을 첨가하거나, 칼슘 디피콜린산과 같은 비영양성 물질의 첨가, 또는 온도, pH, 압력, 정수압(hydrostatic pressure), 연마 등의 물리적 방법이 있다.

그러나, 영양물질에 의한 발아 유도는 포자 표면에 존재하는 포자 발아 수용체의 종류 및 그 유무에 따라 매우 달라지기 때문에 같은 속의 세균이라 하더라도 동일한 발아 유도 효과를 얻지는 못한다.

특히, 바실러스 세레우스의 경우, 특정 발아유도 물질(germinant)과 결합하여 발아 여부를 결정짓는 포자 발아 수용체(spore-germination receptor)를 지정하는 여러 오페론(operon)들이 발견되어 이들의 기능 및 작용 조건 등에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

종래, 바실러스 세레우스의 포자 표면에는 이노신과 알라닌을 인식하는 수용체가 있어 이들을 첨가함으로서 포자의 발아를 유도하여 바실러스 세레우스 표자 연구에 관한 보고가 있다.(Clements & Moir, 1998, J. Bacteriol., 180, 6729-6735; Thackray et al., 2001, J. Bacteriol., 183, 476-482; Southworth et al., 2001, J. Bacteriol., 183, 5896-5903; Behravan et al., 2000, J. Bacteriol., 182, 1987-1994)

그러나, 상기 연구들은 발아 유도 경향이 미약할 뿐만 아니라, 산업적인 측면에서 짧은 시간 내에 대부분의 발아 유도를 기대하기에는 이노신과 알라닌의 첨가만으로는 미흡한 결과를 보였다.

특히, 이노신의 경우 고가이기 때문에 비용적인 면에서도 많은 부담이 되었다.

이에 본 발명자들은 식품이나 각종 원료 등에 쉽게 혼입될 수 있는 식중독균 및 일반 미생물의 포자가 잘 발아될 수 있도록 열충격과 영양물질을 이용하여 최적화 조건에서 속성으로 발아시켜 영양세포로 만듦으로서 저온 살균을 통해서도 쉽게 식중독균 및 일반 미생물을 제거할 수 있음을 확인하였다.

또한, 자외선 및 차아염소산나트륨 등을 이용하여 발아된 식중독균 및 일반 미생물을 쉽게 제거할 수 있는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 식품이나 각종 원료 등에 쉽게 함유될 수 있는 포자를 형성하는 식중독균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 생식의 원료 및 제조 과정에서 혼입되는 식중독균 및 일반 미생물을 살균 또는 저감화 시키는 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 장류의 원료 및 제조 과정에서 혼입되는 식중독균 및 일반 미생물을 살균 또는 저감화 시키는 방법을 제공하는데 있다.

이에 상기의 목적을 이루기 위해 본 발명은 식품이나 각종 원료 등에 쉽게 함유될 수 있는 포자를 형성하는 식중독 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 이루기 위해 생식의 원료 및 제조 과정에서 혼입되는 식중독균 및 일반 미생물을 살균 또는 저감화 시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적을 이루기 위해 장류의 원료 및 제조 과정에서 혼입되는 식중독균 및 일반 미생물을 살균 또는 저감화 시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 좀 더 상세하게 설명한 것으로, 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 열처리를 통한 바실러스 세레우스 영양세포의 사멸 확인

바실러스 세레우스(ATCC 21768)의 배양을 위해 균주를 영양배지(nutrient broth) 20 ㎖에 접종한 다음 37 ℃에서 12 시간 동안 150 rpm으로 진탕배양하였 다.

상기에서 사용한 영양배지는 디프코(Difco)사의 제품으로, 121 ℃에서 15 분간 가압, 멸균하여 사용하였다.

바실러스 세레우스 영양세포의 사멸조건을 확인하기 위하여, 상기의 진탕배양액을 원심분리한 후 생리식염수로 2 회 세척하고, 생리식염수에 현탁하여 각 온도의 항온 수조에서 일정 시간동안 열처리한 다음, 영양한천배지(nutrient agar)에 0.1 ㎖ 적하, 도말하고 37 ℃에서 24 시간 배양하여 형성된 군락을 계수하였다.

[표 1] 바실러스 세레우스 영양세포의 열처리 후 생존한 집락수

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 바실러스 세레우스 영양세포는 60 ℃ 이상에서 10 분 내에 사멸되었으며, 45 내지 55 ℃까지의 온도에서는 처리 시간의 연장을 통해서 사멸되었다.

실시예 2. 열처리를 통한 클로스트리디움 퍼프린젠스 영양세포의 사멸 확인

클로스트리디움 퍼프린젠스(ATCC 13124)의 배양을 위해서 디프코사의 비에이치아이 배지(BHI broth)를 121 ℃에서 15 분간 가압, 멸균하여 사용하였다.

멸균한 시스테인(L-cysteine·HCl)을 0.05 %가 되도록 첨가한 비에이치아이 배지 15 ㎖를 뚜껑이 있는 시험관에 넣고, 상기 시험관에 균주를 접종하여 37 ℃에서 18 시간동안 배양하여 영양세포를 준비하였다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 영양세포의 사멸조건을 확인하기 위하여, 멸균한 시스테인을 비에이치아이 한천배지에 전체 농도가 0.05 %가 되도록 혼합하여 50 ℃의 항온수조에 담가 준비하였다.

멸균 페트리디쉬에 각 온도에서 열처리를 행한 시료 0.1 ㎖를 적하한 뒤 고체배지 20 ㎖를 부어 잘 섞어 굳힌 후 질소가스로 충진된 37 ℃ 배양기에서 48 시간동안 배양하였다.

열처리 결과는 하기의 표 2에 나타내었다.

표 2에서 보는 바와 같이, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 영양세포는 50 ℃에서 45분 내에 모두 사멸되는 것을 알 수 있었다.

따라서, 이하의 실시예 및 실험예에서는 바실러스 세레우스 및 클로스트리디움 퍼프린젠스의 영양세포를 제거하는 조건으로 60 ℃에서 10 분간 열처리를 실시하였다.

[표 2]

실시예 3. 영양세포의 포자화 전환 시간 조사

바실러스 세레우스 영양세포가 포자로 전환되는데 걸린 시간을 조사함으로써 발아를 유도시키는 시간을 조사하였다.

영양배지에 바실러스 세레우스 전배양액(12 시간 진탕배양)을 1 % 접종하여, 37 ℃의 배양기에서 정치배양하면서 일정 시간마다 배양액 시료를 1 ㎖ 채취하여 60 ℃에서 10 분간 열처리하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 열처리를 통해 영양세포가 사멸되어 72 시간까지는 포자가 발생하지 않았다.

그 결과, 포자 발아를 유도하여 영양세포를 사멸시킬 수 있는 시간을 72 시간 이내임을 확인할 수 있었다.

[표 3]

실시예 4. 영양물질 첨가에 따른 바실러스 세레우스 포자의 발아 유도 확인

바실러스 세레우스 포자의 발아를 유도하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조된 포자 현탁액을 각종 영양물질이 첨가된 용액에 접종하였다.

바실러스 세레우스의 최적 배양 온도는 30 내지 37 ℃로 알려져 있으나, 본 실시예에서는 25 ℃에서 일정 시간동안 발아를 유도한 후 60 ℃에서 10 분간 열처리하여 발아된 포자를 사멸시키고, 영양 한천배지에 도말하였다. 37 ℃의 배양기에서 24 시간 배양하고, 생육한 군락을 발아가 유도되지 않은 포자의 수로 간주하였다.

본 실시예에서 사용한 영양물질은 효모 추출물(디프코사), 이노신(이하, Junsei사), 알라닌, 포도당이며, 그 농도는 각각 1.0 % 효모 추출물, 20 mM 이노신, 100 μM 알라닌 및 0.5 % 포도당이었다.

포자가 영양물질에 의해 영양세포로 발아하였다가 열처리를 통해 사멸되는 비율은 다음 하기의 식에 따라 계산하고, 그 결과는 표 4에 나타내었다.

표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 멸균 수돗물을 첨가한 대조군의 사멸률이 4 시간 발유 유도 후, 20.9 %였으나, 이노신과 알라닌을 첨가한 군은 44.2 %로 포자 발아에 의한 사멸률을 보였다. 그러나, 1.0 %의 효모 추출물을 첨가한 경우 1 시간 만에 91.9 %의 사멸률을 나타내어 대조군에 비해 4.6 배의 포자 발아율을 보임을 확인할 수 있었다. 한편, 효모 추출물에 포도당, 이노신, 알라닌을 더 첨가한 효과는 거의 없었다.

[표 4]

실시예 5. 효모 추출물 농도에 따른 포자 발아 유도 확인

상기 실시예 4의 결과를 바탕으로 포자 발아에 효과적인 효모 추출물의 농도 를 확인하기 위하여, 효모 추출물의 농도를 달리하되, 실험방법은 동일하게 하여 바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스의 포자의 발아가 유도되어 사멸되는 정도를 조사하고, 그 결과를 표 5와 표 6에 각각 나타내었다.

[표 5]

표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 바실러스 세레우스는 멸균 수돗물을 첨가한 대조군에서 21.6 %의 사멸률을 보였다. 반면, 효모 추출물을 0.1 % 이상 첨가한 군에서는 이노신과 알라닌을 더 첨가한 군보다 높은 사멸률을 보였으며, 1 % 이상을 첨가한 경우에는 90 %대의 높은 사멸률을 보였다. 가장 높은 사멸률을 보인 효모 추출물의 농도는 2 %였으나, 고농도에서는 오히려 사멸률이 감소하였다.

클로스트리디움 퍼프린젠스의 경우, 표 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 효모 추출물의 농도가 0.05 %인 경우, 멸균 수돗물을 첨가한 대조군과 비교하여 다소 높은 40.5 %의 사멸률을 나타냈으며, 효모 추출물의 농도가 1.5 %인 경우 83.6 %의 최대 사멸률을 나타내었다.

또한, 효모 추출물이 고농도일 때, 바실러스 세레우스와 동일하게 사멸률이 감소하였다.

[표 6]

실시예 6. 유기 영양질소원에 의한 포자 발아 유도 확인

효모 추출물 이외에 다른 유기 영양질소원이 포자의 발아에 미치는 영향을 조사하였다. 각 시료의 농도는 상기 실시예 5의 결과를 참고하여 유기 영양질소원 의 농도를 바실러스 세레우스의 경우 2.0 %로 하고, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 1.5 %로 설정하였으며, 실험 방법은 실시예 4와 동일하게 실시하였다.

바실러스 세레우스의 결과를 나타낸 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 트립톤, 소이톤, 맥아 추출물, 펩톤, 폴리펩톤 모두 97 내지 98 %의 포자 사멸률을 나타냈으며, 특히 소이톤의 경우, 1 시간만에 96.6 %의 사멸율을 보여 짧은 시간에 가장 높은 효과를 나타내었다.

또한, 밀기울, 탈염간장, 콘스팁리쿼의 용액에서도 70 % 이상의 포자 발아에 의한 사멸률을 나타내었다.

클로스트리디움 퍼프린젠스는 표 8에서 볼 수 있듯이, 멸균 수돗물을 첨가한 대조군이 32.4 %의 사멸률을 나타낸 반면, 육즙 추출물의 경우 92.1 %의 사멸률을 보였다. 또한, 펩톤 91.6 %, 폴리펩톤 90.9 %의 높은 사멸률을 보인 반면, 무아미노산 효모 질소원과 카사미노산의 경우에는 72.1, 73.5 %의 다소 낮은 사멸률을 나타내었다. 기타 전반적으로 82 내지 92 %의 사멸률을 나타내었으며, 밀기울, 콘스팁리쿼의 용액에서도 70 % 이상의 포자 발아에 의한 사멸률을 보였다.

[표 7]

[표 8]

실시예 7. 유기 영양질소원의 조합에 따른 포자 발아 유도 확인

상기 실시예 5 내지 6에서 사용한 유기 영양질소원들 중 빠른 시간에 높은 포자 발아에 의한 사멸률을 보인 성분들을 선택하여, 이들의 혼합에 따른 바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자의 발아율 상승효과를 관찰하였다.

바실러스 세레우스의 경우에는 가장 짧은 시간에 포자 발아를 유도한 소이톤에 트립톤과 효모 추출물을 더 첨가하였으며, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 육즙 추출물에 펩톤, 폴리펩톤을 더 첨가하였다.

본 실험은 실시예 4와 동일한 방법으로 실시하였으며, 그 결과는 표 9와 표 10에 나타내었다.

표 9 및 표 10에서 볼 수 있듯이, 바실러스 세레우스의 경우 가장 높은 사멸률을 보인 유기 영양질소원의 조합은 1 % 소이톤과 0.5% 효모 추출물의 조합이었으며, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 육즙 추출물 1%과 펩톤 0.5 % 및 폴리펩톤 0.5 %의 조합이었다.

[표 9]

[표 10]

실시예 8. 유기 영양질소원 함유 배지의 포자 발아 유도 확인

미생물 배양용 각종 배지에도 유기 영양질소원 뿐만 아니라 여러 가지 영양원들이 함유되어 있으므로 이들 배지를 통해서 바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자의 발아가 유도되는지를 조사하였다. 실험에 사용한 배지들은 디프코사의 제품으로 실험방법은 실시예 4에 준하여 실시하고, 그 결과는 표 11 및 표 12에 나타내었다.

표 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 바실러스 세레우스의 경우 트립틱 콩 배지가 90.5 %의 가장 높은 사멸률을 나타내었으며, 영양배지의 경우에도 77.4 %의 사 멸률을 보였다.

[표 11]

한편, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 경우에는 표 12에 나타난 바와 같이, 엠알에스 배지에서 84.9 %, 영양배지에서는 68.3 %의 사멸률을 보였는데, 이는 바실러스 세레우스의 경우보다는 전반적으로 낮은 사멸률을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

[표 12]

실시예 9. 포자 발아를 위한 최적 온도 확인

바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자 발아를 위한 최적 온도를 알아보기 위해 각각의 포자 발아에 효과적인 유기 영양질소원을 가지고 온도별 발아에 미치는 영향을 조사하였다.

실험 방법은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 실시하였으며, 바실러스 세레우스 포자는 1 % 소이톤과 0.5 % 효모 추출물을 혼합 용액에, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 육즙 추출물 1 %와 펩톤 0.5 %, 폴리펩톤 0.5 % 용액을 혼합한 용액에 접종하여 일정 시간동안 15 내지 70 ℃ 사이에서 포자 발아를 유도하고, 그 결과는 표 13 및 표 14에 나타내었다.

[표 13]

표 13에서 볼 수 있듯이, 바실러스 세레우스 포자를 발아시킨 결과, 15 ℃를 제외하고 모든 온도 조건에서 높은 발아율을 나타냈는데, 25 ℃, 1 시간 이상의 조건에서 발아시켰을 때 가장 안정적이면서 높은 발아율을 보였다.

한편, 표 14에서 보는 바와 같이, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 비교적 고온 에서 높은 발아 효과를 나타내었다. 즉, 15 %에서 3 시간 후 약 57 %의 발아로 인한 사멸률을 보인 반면, 30 ℃에서 최대 93.3 %의 발아율을 나타내어, 50 % 이상의 사멸률을 보이는 발아 온도는 15 ℃ 이상, 바람직하게는 20 내지 70 ℃임을 확인할 수 있었다.

[표 14]

실시예 10. 열충격에 의한 포자의 발아 유도 확인

바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자의 효과적인 발아 유도 조건을 확인하기 위하여 각 온도범위에서 열충격(heat shock) 방식으로 열처리를 실시하였다. 발아를 유도하는 유기 영양질소원으로는 소이톤 1 %와 효모 추출액 0.5 %의 혼합용액 및 육즙 추출물 1 %와 펩톤 0.5 %, 폴리펩톤 0.5 %의 혼합용액을 사용하였으며(실험예 7과 동일), 상기 유기 영양질소원에 접종한 포자는 45 내지 80 ℃의 범위에서 열처리를 실시한 후 실시예 4와 동일한 방법에 준하여 집락의 수를 계수하였다.

대조실험을 위해 바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스 각각에 대하여 유기 영양질소원과 멸균 수돗물에서 동일하게 실시하였으며, 그 결과는 표 15 내지 표 18에 나타내었다.

표 15 및 표 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 10 분간 열충격 처리 후, 1 시간 30 분간 발아유도 시 열충격의 온도가 80 ℃인 경우에 100 % 사멸률을 나타내었고, 30 분간 열충격 처리 후 같은 시간 조건에서 발아시킨 경우에는 65 ℃에서 100 % 사멸되었다. 한편, 유기 영양질소원을 대신하여 멸균 수돗물을 사용한 대조군에서도 비교적 높은 사멸률을 나타내었다.

[표 15]

[표 16]

반면, 표 17 및 표 18에서 나타난 바와 같이, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 경우, 포자에 열충격을 처리한 후 사멸률은 증가하였으나, 바실러스 세레우스에 비하여 비교적 낮은 사멸률을 보이며, 완전 사멸은 이루어지지 아니하였다.

[표 17]

[표 18]

실시예 11. 발아유도 반복 및 저온 열충격 처리에 의한 포자 발아유도 확인

상기의 실시예 10에서, 열충격에 의한 열처리 후 포자 발아를 유도함으로서 발아율을 높일 수 있는 것을 확인하였다.

그러나, 생식 등의 원료에의 상기와 같은 방법은 바람직하지 아니하므로 상기 실시예 10과 비교하여, 상대적으로 저온에서 온도 범위만 달리하되 동일한 조건으로 실험을 실시하였다.

즉, 바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자의 발아를 효과적으로 유도하기 위하여 유기 영양질소원을 25 및 30 ℃를 유지하면서 일정 시간 1 차 발아를 유도한 후, 37 내지 50 ℃의 범위에서 온도별로 30 분간 열충격을 실시한 다음 다시 25 및 30 ℃에서 포자의 발아를 유도하였다.

집락계수는 실시예 4에 준하여 실시하였으며, 그 결과는 표 19와 표 20에 나타내었다.

표 19에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 온도 범위에서 효과적으로 포자가 1212배에서 7059배까지 감소하였으며, 표 20에서와 같이, 멸균 수돗물을 사용한 대조군 실험에서도 최대 93.5 %의 포자 발아율을 나타내었다.

상기와 같은 결과는 전반적으로 발아유도 시간이 길수록, 열충격 온도가 높을수록 좋은 결과를 얻을 수 있었다.

한편, 동일한 조건에서의 클로스트리디움 퍼프린젠스의 경우, 바실러스 세레우스와 견주어 볼 때 다소 낮으나 실험예 6, 7 및 10의 결과와 비교하여 높은 발아 율을 확인할 수 있었다. 초기 포자 접종량(7.6×10⁴ 집락수/㎖)를 기준으로 최소 발아율이 98.16 %(1.4×10³ 집락수/㎖)였으나, 최대 발아율은 99.96 %(3.1×10⁴ 집락수/㎖)로 나타나 포자가 54배에서 2452배까지 감소하였으며, 멸균 수돗물을 이용한 대조군에서도 최대 발아율은 84.2 %(1.2×10⁴ 집락수/㎖)로 확인되었다.

[표 19]

[표 20]

실시예 12. 고온 열충격 처리에 의한 포자의 발아 유도 확인

곡류의 경우, 100 ℃의 고온에서 짧은 시간동안 열충격 방식의 열처리를 실시하여도 그 성분이나 표면의 질감이 쉽게 변하지 아니하므로 고온에서 짧은 시간동안 열충격을 실시한 후 포자의 발아 유도율을 조사하였다.

본 실험은 열충격 실시 온도와 시간을 제외하고는 실시예 10과 동일한 조건으로 실시하였으며, 그 결과는 표 21에 나타내었다.

표 21에서와 같이, 바실러스 세레우스의 경우, 100 ℃에서 30 초간 열충격 을 실시한 후 30 분간 발아를 유도한 경우를 제외하고는 모든 포자가 사멸되었다.

한편, 동일한 조건에서의 클로스트리디움 퍼프린젠스의 경우, 바실러스 세레우스와 비교하여 약간 발아율이 떨어졌으나(사멸률 95 %), 그 외에서는 전부 사멸되는 것을 확인할 수 있었다.

표 21의 결과를 바탕으로 고온에서의 바실러스 세레우스 포자의 효과적인 열충격 시간을 조사하고 그 결과를 표 22에 나타내었다.

표 22에서 볼 수 있는 바와 같이 5 초 이상의 열충격 실시 후 87.1 %의 발이 유도에 따른 사멸을 확인할 수 있었다.

또한, 열충격 실시 시간이 길어짐에 따라 포자의 발아는 더욱 효과적으로 나타났으며, 앞선 결과와 같이 30 초 이상 열충격을 가한 경우 포자가 전부 사멸되는 것을 확인할 수 있었다.

[표 21]

[표 22]

실시예 13. 자외선 조사에 의한 사멸 확인

자외선 조사에 따른 영양세포와 포자의 사멸을 확인하기 위하여 바실러스 세레우스 및 클로스트리디움 퍼프린젠스의 영양세포와 포자를 각각 현탁하고, 영양한천배지에 도말하였다.

페트리디쉬의 뚜껑을 연 채로 클린벤치(clean bench)의 자외선 램프(산쿄 전기(Sankyo Denki)사 제품, 모델명 G40T10, UV-C램프)를 사용하여 70 ㎝ 아래에서 일정 시간 자외선을 조사한 후, 37 ℃에서 24 시간 배양하고 집락을 계수하였다.

그 결과를 정리한 표 23에서 나타난 바와 같이, 바실러스 세레우스 영양세포의 경우에는 15 분, 포자는 30 분 자외선 조사로 완전 사멸이 가능하였다.

상기와 같은 결과는 클로스트리디움 퍼프린젠스에서도 동일하게 확인되었다.

[표 23]

실시예 14. 염소 처리에 따른 영양세포 및 포자의 저감화 확인

염소이온으로 차아염소산나트륨을 사용하여 농도에 따른 바실러스 세레우스 및 클로스트리디움 퍼프린젠스의 영양세포 및 포자의 사멸조건을 확인하기 위하여 실시하였다.

0.0001 내지 0.1% 농도의 차아염소산나트륨 용액 9.9 ㎖에 37 ℃에서 전배양한 영양세포 및 포자 용액을 0.1 ㎖를 각각 접종하여, 처리 시간별 집락수 변화를 상기 실시예 4의 방법에 준하여 확인하고, 그 결과를 표 24과 표 25에 나타내었다.

[표 24]

상기 표 24에서 볼 수 있는 바와 같이, 바실러스 세레우스 영양세포의 경우, 차아염소산나트륨 용액의 농도가 0.001% 이상의 농도에서는 생존하지 못하였으며, 0.0001% 농도에서도 30 분 이상 처리한 경우 완전히 사멸되는 것을 확인할 수 있었다.

[표 25]

또한, 표 25에서와 같이, 바실러스 세레우스 포자의 경우에도 0.005 % 농도로 30분 처리 시 완전히 사멸됨을 확인하였다.

한편, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 영양세포에 차아염소산나트륨 용액을 처리한 결과는 표 26에서 나타난 바와 같이, 바실러스 세레우스의 경우와 유사함을 확인할 수 있었다.

0.0001% 농도로 30 분 이상 처리하거나 또는 0.01% 이상의 농도로 처리할 경우, 영양세포가 완전히 사멸되었으며, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 포자 역시 표 27에서 볼 수 있는 바와 같이, 0.01% 이상에서 15 분 처리로 완전히 사멸되는 것을 확인하였다.

[표 26]

[표 27]

실험예 1. 생식원료에의 적용

상기 실시예들에서 확인한 결과를 종합하여, 바실러스 세레우스의 포자 발아유도 물질로서 1% 소이톤과 0.5% 효모 추출물 혼합한 용액에 25 ℃에서 발아 온도조건으로 하고, 클로스트리디움 퍼프린젠스의 경우, 포자 발아유도 물질로서 육즙 추출물 1 %에 펩톤 0.5 %, 폴리펩톤 0.5 %를 혼합한 용액을 사용하였으며, 30 ℃에서 발아시키는 조건으로 생식에 쓰이는 채소류와 곡류(각각 20 g)에 적용하여 사멸 정도를 조사하였다.

단, 시료에 존재하는 피검균주가 자연 존재하는 양이 적은 관례로 인위적으로 포자를 접종하여 실시하였다.

채소류는 흐르는 수돗물에 3 분간 씻어 체에 밭쳐 10 분 동안 상온에서 물이 빠지도록 하였으며, 곡류는 체에 밭친 상태로 3 분간 흐르는 수돗물로 씻은 다음 20 분 동안 상온에서 물빼기를 하였다.

준비한 포자를 멸균 수돗물에 현탁하여, 10 ℃로 조절한 후 10 분간 침지하였다가 건져서 30 분간 냉풍으로 물기를 증발시켰으며, 곡류 역시 동일한 방법으로 처리하였다.

집락계수는 실시예 4에 준하여 실시하였으며, 그 결과는 표 28와 표 29에 나타내었다.

표 28에서 보는 바와 같이, 바실러스 세레우스의 포자는 채소류의 경우, 포자 발아에 의한 사멸률이 케일 85.9 %, 치커리 92.7 %, 연근 91.8 %로 나타났으며, 곡류는 현미 87.4 %, 대두 88.2 %, 흑두 89.4 %로 나타났다.

클로스트리디움 퍼프리젠스의 경우, 표 29에서와 같이, 2 시간 발아 유도시 모두 80 % 이상의 포자 발아에 의한 사멸률을 보임을 확인할 수 있었다.

[표 28]

[표 29]

실험예 2. 동결건조 후 열처리에 의한 포자 발아 유도 확인

생식의 제조 과정에서 이용되는 원료의 동결건조에 의한 열처리 과정(통상적으로 43 내지 70 ℃의 범위에서 건조)에서 발아된 포자의 사멸률을 조사하기 위하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스의 영양세포를 준비하고, 12 시간동안 동결건조(-50 ℃, 9×10^-3 torr) 하였다.

상기의 건조된 영양세포는 직경 5 ㎜ 유리관에 담아 마개를 막은 상태로 각 온도로 설정된 항온수조에 넣고 30 분 내지 3 시간 건열처리하고, 그 결과는 표 30와 표 31에 나타내었다.

표 30에서 보는 바와 같이, 동결건조한 바실러스 세레우스 영양세포의 경우, 50 ℃에서 2 시간 이상 건열처리를 실시하였을 때 99 % 이상의 사멸률을 나타내었으며, 건열처리의 온도가 높아질수록 단시간의 건열처리에 의한 완전사멸을 나타내었다.

또한, 표 31에 나타난 바와 같이, 클로스트리디움 퍼프린젠스 영양세포 역시 열처리 온도가 낮은 경우, 바실러스 세레우스 영양세포와 비교하여 높은 생존율을 보이기는 하였으나, 전반적으로 유사한 결과를 확인할 수 있었다.

[표 30]

[표 31]

한편, 상기의 결과를 바탕으로 실시예 10의 방법에 준하여 현미에 바실러스 세레우스 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자를 각각 접종하고, 실시예 7 및 9에 준하여 3 시간동안 발아시켰다.

상기와 같이 처리된 현미에 대하여, 열처리를 생략하고, 바로 12 시간동안 동결건조를 실시한 다음, 60 ℃에서 2 시간 건열처리하여 영양한천배지와 비에이치아이 고체배지에 접종하고 배양한 결과, 바실러스 세레우스의 경우에는 92.4 %, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 94.9 %의 포자 저감화를 확인할 수 있었다.

실험예 3. 생식 원료에 존재하는 일반 미생물의 저감화 확인

생식 원료에 존재하는 포자를 생성하는 세균의 포자 발아를 유도하면서 동시에 기타 일반 미생물의 저감화가 일어나는지를 확인하기 위해 각각의 곡류 및 채소에 대하여 열처리 실험을 실시하였다.

각각의 생식 원료 20 g을 50 ㎖의 바실러스 세레우스 포자 발아용액(1 % 소이톤과 0.5 % 효모 추출물 혼합액)에 혼합하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하되, 60 ℃에서의 열처리 시간을 달리하여 실시하였다.

열처리 한 상기 용액 0.1 ㎖를 영양한천배지에 도말하고, 37 ℃에서 24 시간 배양하여 생존한 일반세균의 집락수를 계수한 결과를 표 32에 나타내었다.

표 32에서 볼 수 있는 바와 같이, 채소류는 15 분 이상 열처리를 거친 경우, 일반 미생물이 생존하지 못하였으며, 곡류는 20 분 이상을 열처리한 경우 미검출 또는는 급감하는 경향을 확인할 수 있었다.

[표 32]

실험예 4. 염분 농도에 따른 바실러스 세레우스 포자의 발아 억제 정도 확인

염분(소금)이 포자의 발아 유도에 미치는 영향을 확인하기 위하여 1 % 소이톤과 0.5 % 효모 추출물 혼합용액과 멸균 수돗물을 사용한 대조군에 대해 각 농도가 되도록 소금을 첨가하여 용액을 제조한 다음 바실러스 세레우스의 포자를 접종하였다.

실시예 11과 동일한 방법으로 영양세포를 사멸시키고, 영양한천배지에 도말하였다.

그 결과를 나타낸 표 33에서 보는 바와 같이, 소금이 첨가되지 아니한 영양배지에서는 100% 발아하는데 반하여, 소금이 첨가된 포자의 경우 포자의 완전 발아가 저해됨을 알 수 있었다.

따라서, 유기 영양질소원에 의한 포자의 발아가 유도되는 것과 비교하여, 소금에 의한 포자 발아 저해능이 더욱 크다는 것을 확인 할 수 있었다.

[표 33]

실험예 5. 장류 및 장류 재료에 존재하는 바실러스 세레우스 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자 발아 유도에 의한 사멸 확인

장류와 그 재료에서의 바실러스 세레우스 포자의 발아정도를 알아보기 위하 여 각 시료에 존재하는 바실러스 속의 수를 확인하였다.

이를 위하여, 각 시료를 생리식염수에 현탁하고, 영양한천배지에 도말한 후 37 ℃에서 24 시간 배양하여 그 결과를 표 34에 나타내었다.

표 34에서 볼 수 있는 바와 같이, 고추가루와 고추장에 비하여 된장에 바실러스 속의 미생물이 많이 존재하였고, 특히 메주가루에는 많은 양의 바실러스 속의 미생물이 확인되었다.

[표 34]

본 실험을 위하여 고추장, 된장, 고춧가루, 메주가루를 1 g씩 살균하여, 유기 영양질소원과 혼합하여 10 ㎖의 혼합용액을 제조하였다. 이때, 유기 영양질소원을 멸균 수돗물을 사용한 대조군 실험도 함께 실시하였다.

상기 혼합용액에 바실러스 세레우스와 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자를 접종하고, 상기 실시예 11의 방법에 준하여 영양세포를 사멸시킨 다음 각각을 상기 실시예 1과 2의 방법과 동일하게 도말하여 집락수를 계수하였다.

그 결과를 나타낸 표 35 및 표 36에서 보는 바와 같이, 고추장이나 된장과 비교하여 고춧가루와 메주가루에서 포자의 발아율이 높은 것이 확인되었다.

이는 장류를 제조하는 과정에서 첨가하는 소금에 의하여 바실러스 세레우스 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자의 발아가 저해된 것으로 사료된다.

따라서, 상기의 결과로부터 장류의 제조시 소금을 첨가하기 전에 바실러스 세레우스 또는 클로스트리디움 퍼프린젠스 포자의 발아를 유도하여 사멸시키는 것이 효과적임을 확인할 수 있었다.

그 결과, 발효, 숙성 과정 중 혹은 과정 후에 희석 등과 같은 방법으로 소금의 농도를 내리고, 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화하는 방법이 가능하다.

[표 35]

[표 36]

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 포자를 형성하는 식중독균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법을 생식의 제조 과정에 적용할 경우, 생식 제품의 원료 및 제조 공정 과정에서 혼입된 식중독을 유발하는 세균의 생육 억제가 가능하다.

또한, 생식 원료의 영양소 파괴 없이 인체에 유해한 식중독을 일으키는 세균 및 일반 미생물을 제거할 수 있을 뿐만 아니라 생식 제품의 품질을 향상시켜주는 효과를 얻을 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 식중독균 및 일반 미생물을 살균 또는는 저감화 시키는 방법을 장류의 제조 과정에 적용할 경우, 원료와 제품의 제조 과정에서 혼입된 유해균을 효과적으로 저해할 수 있는 특징이 있다.

Claims

포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 유기 영양질소원, 열충격 또는 유기 영양질소원 및 열충격을 이용하여 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)임을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 유기 영양질소원으로 효모추출물, 무아미노산 효모 질소원, 맥아추출물, 펩톤, 폴리펩톤, 트립톤, 탈지분유, 카사미노산, 소이톤, 밀기울, 탈염간장, 콘스팁리쿼, 육즙 추출물, 밀기울, 탈염간장, 콘스팁리쿼, 메주가루, 청국장가루, 고춧가루, 영양배지, 비에치아이(BHI)배지, 트립틱콩배지, 엘비(LB)배지, 사브로드 포도당배지, 엠알에스(MRS)배지로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 단독 또는 병행하여 사용하는 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항 또는 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 유기 영양질소원은 0.05 내지 30 %(w/v)의 농도로 첨가되어 지는 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

포자 발아 온도는 15 내지 100 ℃임을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

포자 발아 시간이 15 초 내지 72 시간인 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

포자의 발아를 촉진시키기 위하여 열충격 방식의 열처리를 가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 열충격 방식의 열처리는 37 내지 100 ℃의 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 열충격 방식의 열처리 시간은 3 내지 30 초인 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

UV를 조사하는 단계를 더 포함하여 식중독균 및 일반 미생물을 제거하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 1항에 있어서,

염소이온을 포함하는 용액을 더 첨가하여 식중독균 및 일반 미생물을 제거하는 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 11항에 있어서,

상기 염소이온을 포함하는 용액이 차아염소산나트륨용액인 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.
제 11항에 있어서,

상기 염소이온을 포함하는 용액은 0.0001 내지 0.05 %의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 포자를 형성하여 식중독을 일으키는 원인균 및 일반 미생물의 포자를 발아시켜 살균 또는 저감화 시키는 방법.