CN101775067A - 一种人工合成的新抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人工合成的新抗菌肽KW-13的制备方法及其应用，属于生物医药领域。KW-13是一种直链多肽，含有13个氨基酸残基，分子量为1686Da。KW-13的全序列为赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸。KW-13用固相化学法合成，对多种临床致病菌具有很强的杀灭作用，具有结构简单、人工合成方便和广谱抗菌等有益特点。另外KW-13不含有稀有氨基酸和外源化学成分，是一种极具应用潜力且健康安全的抗菌替代物。
Description
技术领域：
本发明涉及一种人工合成的新抗菌肽、其制备方法和在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物中的应用。
背景技术：
抗菌肽(Antibacterial peptide)又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide)、抗生素肽(Antibiotics peptide)，是由多种生物细胞特定基因编码，经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗菌、抗病毒活性的多肽。抗菌肽在疾病治疗与预防中具有广阔的应用前景，可望成为新型的抗菌和抗病毒药物。抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性，不同抗菌肽与传统抗生素联用，还可提高抗菌肽和传统抗生素的药物疗效，甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱。传统抗生素通过消除微生物生长或生存必不可少的条件，如使酶失活变性，来达到杀菌的目的，细菌只要改变一种基因就足以抵抗此类抗生素的攻击；而抗菌肽则通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互作用，从而穿透细胞膜达到杀菌目的，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。目前已有十余种抗菌肽进行临床前或临床研究。衍生于magainins的MSI 78已进入III期临床试验，主要用于治疗糖尿病患者由多种微生物引起的脚部溃疡，研究结果证实，其效果与口服奥氟沙星的作用相同，但不良反应相对较少。来自人嗜中性粒细胞中的抗菌肽BPI的N端21kDa的片段(Neuprex)作为注射剂也已进入III期临床，它能够大幅降低小儿脑膜炎奈瑟氏球菌感染造成的死亡。
天然抗菌肽的肽链较长、合成成本高、抗菌活性低并且有很强的溶血副作用，因此临床使用价值较低。因此如何减少多肽的氨基酸残基数并提高其抗菌活性，降低溶血副作用成为抗菌肽药物开发的热点。目前的研究主要集中在对已知结构的天然抗菌肽进行功能改造，如残基替换、构建杂合肽、截取部分序列等。但通过这种途径很难开发出结构新颖且比天然抗菌肽具有更广泛抗菌谱的新型抗菌肽。因此本发明对抗菌肽序列进行全新设计并人工合成，提供了一种不同于天然抗菌肽结构的新型抗菌肽KW-13。其由脯氨酸连接的两部分结构域组成，N端的氨基酸用于增加正电荷含量，在此基础上C端另加一段标准的α螺旋结构(碱性氨基酸-疏水性氨基酸-疏水性氨基酸-碱性氨基酸的重复序列)。发明人将本发明的KW-13全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽；将本发明的KW-13全序列氨基酸结构经APD抗菌肽数据库进行模拟预测，显示其具有良好的抗菌活性。
发明内容：
本发明的目的是基于抗菌肽分子设计理论和固相多肽合成技术，提供一种具有强烈抗菌活性的新型抗菌肽KW-13。本发明的另一个目的是将这种抗菌肽应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物中。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
抗菌肽KW-13是一种直链多肽，含有13个氨基酸残基，分子量为1686Da。KW-13的全序列为赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸。
抗菌肽KW-13的制备方法：
根据所设计的KW-13氨基酸序列，利用固相多肽合成技术进行手工合成。将经保护的氨基酸在Wang树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并脱保护。合成的多肽经高浓度的TFA剪切后，得到粗品。经HPLC反相柱进行纯化后通过质谱分析确证。合成的多肽溶于灭菌水，利用96孔板法对其抗菌活性进行检测。
本发明的有益效果在于：
基于抗菌肽分子设计理论和固相多肽合成技术得到的新抗菌肽KW-13具有结构简单、人工合成方便和广谱抗菌等有益特点。另外KW-13不含有稀有氨基酸和外源化学成分，是一种极具应用潜力且安全的抗菌替代物。
具体实施方式：
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。应当理解这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。
实施例1抗菌肽的制备及分离纯化
按下述序列制备KW-13。
KW-13的全序列：
赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸。
本实施例采用固相多肽合成技术进行手工合成。合成的多肽经高浓度的TFA剪切后，得到粗品。经HPLC反相柱进行纯化后，通过质谱分析确证。具体实验步骤如下：
1、KW-13的制备：(以制备0.12mmol量的KW-13为例说明固相合成多肽的方法)
以下制备抗菌肽的树脂、Fmoc保护氨基酸及缩合试剂、切割试剂均购买于上海吉尔生化有限公司。
制备从C端到N端逐个进行。称取0.5012g(0.12mmol)Fmoc-Lys(Boc)-WangResin放入烧杯，加入DMF溶胀1h。将反应后的树脂用DMF洗两次，抽滤干。加入部分20％的哌啶/DMF先反应5min，之后加入剩余部分再反应15min，脱去Fmoc保护基。用茚三酮显色法检测，结果表明脱保护反应已进行完全。滤去反应液，将树脂用DMF洗涤4次，至滤液加水无浑浊，滤干。称取第2个氨基酸Fmoc-Leu-OH 0.1276g(0.36mmol)，缩合剂HBTU 0.1365g(0.36mmol)，HOBT 0.0486g(0.36mmol)用DMF约4ml溶10min。将Fmoc-Leu-OH的DMF溶液加入到含树脂的砂心漏斗中，调节氮气的流速使之处于稳速状态，之后再加入DIEA 145μl(0.84mmol)，室温反应1h。用茚三酮显色法检测，结果表明偶合反应已进行完全。将反应后的树脂用DMF洗三次，抽滤干，加入20％的哌啶/DMF重复脱保护操作。滤去反应液，将树脂用DMF洗涤4次，至滤液加水无浑浊，滤干。后面接着偶合由C端起的第三个至最后一个氨基酸。所有氨基酸的α-氨基都用Fmoc保护，有侧链保护基的氨基酸为：Fmoc-Lys(boc)-OH、Fmoc-Tyr(tbu)-OH和Fmoc-Trp(Boc)-OH。最后一次脱保护后将反应后的树脂用DMF洗4次，无水甲醇1次，DCM2次，无水甲醇2次，滤干。
将树脂转移后，加入切割液TFA∶H2O∶EDT∶Tis(9.4∶2.5∶2.5∶0.1)搅拌1.5h。抽滤，在滤液中加入10倍体积的冰乙醚，充分震荡后静置30min。抽滤，真空干燥，即得KW-13粗肽。
2、KW-13的纯化：
将200mg上述粗肽溶解于40mL纯水中，用制备型反相HPLC纯化。色谱柱为Delta-PakC18 25×200mm；流动相为A液：5％甲醇+水相中0.05％三氟乙酸，B液：95％甲醇+水相中0.05％三氟乙酸。洗脱程序为57％-64％B液150ml，流速为5ml/min，检测波长为280nm和210nm。分管收集主峰峰尖部分后，用分析型反相HPLC对收集成分进行检测，色谱柱为global SP120-5-C18-BIO 4.6×250mm，流动相同上，洗脱程序为49％-54％B液20min，流速为1ml/min，检测波长210nm，收集的成分达到纯度要求。收集液经旋转蒸发浓缩，然后冷冻干燥得到KW-13纯肽。纯肽的质谱表明，其分子量与计算值相符。
实施例2抗菌肽的抑菌活性检测
采用96孔板法对抗菌肽的抑菌活性进行检测。
1、KW-13的抑菌圈测定：
试验菌株分别接种于斜面固体培养基上，37℃培养18小时后，将保存在斜面上的试验菌株用3ml生理盐水洗下来，取1ml菌液加入融化并冷却至40-50℃左右的培养基，迅速混匀。用移液管移取10ml培养基于平皿中，冷却凝固。将牛津杯放置在规定位置，在每个牛津杯中加入100μl样品溶液，放入37℃培养箱中培养24小时，观察抑菌圈形成与否。
2、KW-13最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定：
试验菌株分别接种于斜面固体培养基上，37℃培养18小时后，转接至2ml液体培养基，37℃培养8小时，使菌浓度约为105CFU/ml。称取适量KW-13样品用灭菌水配制成药物原液512μg/ml，振荡均匀后进行倍比稀释。如表1所示：
表1药物的倍比稀释方法
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 倍比稀释(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 灭菌水(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 梯度(μg/ml) | 2560 | 1280 | 640 | 320 | 160 | 80 | 40 | 20 | 10 | 5 |
注：先给每只小试管编号，每管加入2ml灭菌水，再进行倍比稀释，最后一管吸取2ml弃去。
将平板编号为1.1-1.10(1为512μg/ml、10为0.5μg/ml)，还有0(空白点样前)和2(空白点样后)。取1ml稀释的药物迅速加入刚灭菌后试管固体培养基9ml，振荡均匀后将小试管按编号倒入平板，迅速混匀冷却制成一系列药物浓度为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml的药物平板。用枪吸取275μl的菌液加入96孔板，调整好多点接种仪，从同一药物的低浓度到高浓度点样。37℃培养10小时，观察抗菌效果，记录MIC。最小抑菌浓度为看不见细菌或真菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。
表2KW-13的抗菌活性
| 菌株 | MIC(μg/ml) | 菌株 | MIC(μg/ml) |
| 金黄色葡萄球菌-1 | 256 | 产气杆菌-4 | 4 |
| 金黄色葡萄球菌-2 | 16 | 产气杆菌-7 | 4 |
| 金黄色葡萄球菌-5 | 16 | 产气杆菌-10 | 128 |
| 金黄色葡萄球菌-6 | 256 | 肺炎克雷伯菌-1 | 512 |
| 金黄色葡萄球菌-7 | 16 | 肺炎克雷伯菌-2 | 128 |
| 金黄色葡萄球菌-8 | 256 | 大肠杆菌-1 | 128 |
| 表面葡萄球菌-1 | 16 | 大肠杆菌-2 | 128 |
| 表面葡萄球菌-2 | 16 | 大肠杆菌-3 | 128 |
| 表面葡萄球菌-3 | 16 | 大肠杆菌-6 | 64 |
| 表面葡萄球菌-4 | 256 | 大肠杆菌-7 | 128 |
| 表面葡萄球菌-5 | 16 | 绿脓杆菌-19 | 128 |
| 表面葡萄球菌-7 | 4 | 绿脓杆菌-21 | ND |
| 表面葡萄球菌-8 | 256 | 白色念球菌 | ND |
| 表面葡萄球菌-9 | 16 | 黑曲霉 | 256 |
MIC：最小抑菌浓度，ND：未检测到活性。以上实验所用菌株均为临床分离得到的致病菌株。
上表中的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。测试菌株均为临床常见致病菌，包括金黄色葡萄球菌、表面葡萄球菌、产气杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念球菌和黑曲霉。从抑菌实验结果不难看出，本发明的抗菌肽KW-13对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有较好的抑菌活性。比较而言，KW-13对表面葡萄球菌和产气杆菌的抑菌作用最强，最小抑菌浓度均可达到4μg/ml。
Claims (3)
1.KW-13的特征在于其是一种直链多肽，含有13个氨基酸残基，分子量为1686Da。KW-13的全序列为赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸。
2.一种如权利要求1所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为固相化学法合成。
3.一种如权利要求1所述抗菌肽的应用，其特征在于，所述的抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌药物中的应用。
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