CN101297655A - 杀灭芽孢杆菌芽孢的复合制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杀灭芽孢杆菌芽孢的复合制剂。本发明提供的复合制剂，其活性成分是乳酸链球菌素和L－丙氨酸。应用本发明的复合制剂，在常温条件下，在15min内，对芽孢的杀灭率可达99.37％，比常规试剂乳酸链球菌素提高了约5倍。本发明提供的复合制剂可应用于制备洗消剂及致病性芽孢杆菌治疗药物，具有很大的开发潜力和应用价值。

Description

杀灭芽孢杆菌芽孢的复合制剂

技术领域

本发明涉及一种杀灭芽孢杆菌芽孢的复合制剂。

背景技术

芽孢杆菌菌属为可形成芽孢(内生孢子)的杆菌，属于化能异养菌，具发酵或呼吸代谢类型。芽孢杆菌菌属的最大特征是生成芽孢，且绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其它理化因素有较强的抵抗力，可能与芽孢独具的高含量吡啶二羧酸有关。该属细菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，与人类关系密切。如炭疽芽孢杆菌可以引起人、畜的炭疽病；蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌和产气荚膜梭菌引起食物中毒；破伤风梭菌引起破伤风；韦氏梭菌和产气荚膜梭菌引起气性坏疽等。芽胞生存力强，在干燥土壤中存活40年以上仍具有感染力，探索有效杀灭芽孢的方法一直是消毒与预防医学领域研究的一个方向。传统上，一般使用高温灭菌法(121℃，30min)达到彻底消除芽孢的目的，然而这种方法不能用于清除环境或物体表面的芽孢。医学领域大多借助一些高效化学消毒剂的使用杀灭芽孢，包括含氯消毒剂、臭氧、甲基内酰脲类化合物、双链季铵盐、环氧乙烷等，可是这些化学类消毒剂在使用时会对人体构成一定的伤害并对环境造成一定程度的污染。

乳酸链球菌素(Nisin)，一种新型低聚肽，是从乳酸链球菌发酵产物中获得的多肽抗菌素类物质，是世界公认的安全的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。乳酸链球菌素的一级结构由34个氨基酸组成，分子末端分别是氨基和羧基，还有5个硫桥构成内环，其分子式如下：C₁₄₃H₂₂₈N₄₂O₃₇S₇，平均分子量为3510Da。Nisin主要抑制大部分革兰氏阳性菌的生长，包括产芽孢杆菌(如肉毒杆菌)、耐热腐败菌(如嗜热脂肪芽孢杆菌)等。Nisin在食品防腐中的重要价值在于能抑制芽孢细菌(包括嗜热产气芽孢菌)。关于Nisin对微生物的作用机理方面有大量研究，目前普遍认为Nisin首先对革兰氏阳性菌细胞膜进行吸附，然后在细胞膜上形成空洞从而使胞内物质泄露，最后导致细胞解体死亡。

目前国际上关于Nisin针对芽孢杆菌方面的研究刚刚起步，而国内相关方面的研究还处于一片空白，至今为止PubMed上收录文章仅有两篇，最早是由T.Nock等人在2007年9月首次报道，他们通过与magainins，defensins，cecropins等一系列抗菌肽对比证明：Nisin对炭疽芽孢杆菌具有最为显著的抑制作用，实验中选取10株不同的炭疽芽孢杆菌为实验对象，Nisin的最小抑菌浓度为0.70-13.51mg/mL。随后在2008年3月再次由同一个实验室发现Nisin可以显著降低炭疽芽孢对于高压的耐受性。

发明内容

本发明的目的是提供一种杀灭芽孢杆菌芽孢的复合制剂。

本发明提供的杀灭芽孢杆菌芽孢的复合制剂，其活性成分是乳酸链球菌素和L-丙氨酸。

所述复合制剂中，所述乳酸链球菌素(Nisin)和所述L-丙氨酸(L-Ala)的质量比可为(9-1000)∶900。

所述的复合制剂中，所述乳酸链球菌素和所述L-丙氨酸的质量比优选为(2-100)∶100。

所述的复合制剂中，所述乳酸链球菌素和所述L-丙氨酸的质量比最优选为(3-6)∶100。

本发明还提供了一种杀灭芽孢杆菌芽孢的方法，是应用所述复合制剂杀灭芽孢。

所述复合制剂具体可为任何剂型，如干粉、片剂、溶液等。

当所述复合制剂为溶液形式时，所述溶液的溶剂为萌发缓冲液。

每升所述萌发缓冲液具体可含有以下组分：10mmol NaH₂PO₄，100mmol NaCl；pH7.2。

每升所述复合制剂溶液中，所述活性成分的量为100-100000μg/mL。

每升所述复合制剂溶液中，所述活性成分的量优选为1000-10000μg/mL。

所述复合制剂溶液中，所述活性成分的量最优选为9000-10000μg/mL。

试验证明，Nisin作用于RSVF1菌株的LD50为672μg/mL。在OD₆₅₀≈1.0的RSVF1芽孢悬液中加入一定量的萌发剂L-Ala(溶剂为萌发缓冲液)使其在整个体系中终浓度达100mmol/L，37℃，15min后芽孢萌发率为97.80％。

本发明通过试验证明：在常温条件下，在15min内，L-Ala对RSVF1芽孢的杀灭率为2.4847％；Nisin对RSVF1芽孢的杀灭率为20.28％；而复合制剂对芽孢的杀灭率可达99.37％，比Nisin提高了约5倍。

本发明提供的复合制剂在常温下、短时间内可以杀灭95％以上的芽孢，可应用于制备污染环境的洗消剂及致病性芽孢杆菌治疗药物，具有开发潜力和应用价值。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为Nisin对RSVF1菌的LD50。

图2为染色法检测RSVF1菌株芽孢生成率。

图3为复合制剂对芽孢的杀灭率。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所涉及的实验材料如下：

Bacillus cereus菌株RSVF1，即ATCC4342，购自美国ATCC菌种保藏中心。

酶缓冲液(EB)：

5mmol/L KH₂PO₄，1mmol/L DTT，1mmol/L EDTA；pH 6.1。

萌发缓冲液(pH7.2)：

10mmol/L NaH₂PO₄，100mmol/L NaCl。

LB培养基：

10g Trypton，5g Yeast extract，10g NaCl，900mL去离子水；pH7.0；高压灭菌。

产芽孢培养基(CCY)：

MgCl₂·6H₂O(0.5mmol/L)，MnCl₂·4H₂O(0.01mmol/L)，FeCl₃·6H₂O(0.05mmol/L)，ZnCl₂(0.05mmol/L)，CaCl₂·6H₂O(0.2mmol/L)，KH₂PO₄(13mmol/L)，K₂HPO₄(26mmol/L)，谷氨酰胺(20g/L)，酸水解干酪素(1g/L)，酶水解干酪素(1g/L)，酶解酵母浸出物(0.4g/L)和甘油(0.6g/L)配制1L。

乳酸链球菌素：YP-1000 Nisin，购自天津澎耀生物技术有限公司，其效价≥1000IU/mg。

实施例1、Nisin的LD50的测定

为了实验过程方便安全，选取了B.cereus菌属的一株在基因组方面与炭疽芽孢杆菌极其相似的菌株RSVF1作为实验对象。然后借助OD₆₅₀值测定了Nisin作用于RSVF1菌株的LD50，目的是检测Nisin对于RSVF1菌株的杀菌效果并为下一步的功效实验选择适宜的蛋白浓度。

将Nisin依次倍比稀释加入96孔板，再各加入100μL菌密度达到OD₆₅₀＝0.6的RSVF1菌悬液测定Nisin的LD50。以200μL酶缓冲液(EB)作为空白阴性对照，以100μL OD₆₅₀＝0.6的RSVF1菌悬液+100μL酶缓冲液(EB)作为生长对照，将各组溶液混匀后，37℃静置孵育15min。测各组浓度Nisin作用15min后菌悬液的OD₆₅₀，将OD₆₅₀最低的Nisin浓度作为其LD50。

进行3次重复试验。图1显示了OD₆₅₀的测定结果，X轴取浓度对数(Lg浓度(μg/mL))，Y轴取各个浓度下的OD₆₅₀。

如图1所示，RSVF1菌悬液生长对照组的OD₆₅₀为0.3774。最低OD₆₅₀所对应的Nisin浓度的对数值为2.8，故Nisin的LD50为672μg/mL。

实施例2、复合制剂对芽孢的抑制作用

一、芽孢的制备

将RSVF1菌株接种于LB培养基中，30℃，200rpm活化过夜。将活化后的菌液1％接种于CCY培养基，30℃，200rpm培养60h，镜检至体系中孢子率大于99％为止。

检测RSVF1菌株芽孢生成率的具体步骤如下：

(1)取待检菌芽孢体较多的培养物，涂片、干燥及加热固定后，滴满石炭酸复红液于涂片上，并以弱火加热，使染液冒蒸汽约5min。冷后水洗，并用95％乙醇脱色2min。水洗，加碱性美兰液复染半分钟。水洗，干后镜检。

(2)染色结果，芽孢呈红色，菌体为蓝色。

结果见图2，图2中，A为RSVF1菌在进行芽孢培养之前的切片；B为RSVF1菌在进行芽孢培养之后的切片。由图可见，培养前，视野范围内全部呈现蓝色的菌体(图2A)；培养后，视野范围内极大部分呈现红色的芽孢以及极少数蓝色的菌体(图2B)。如图所示，RSVF1菌经培养后芽孢的生成率达99％以上。

收集芽孢液用灭菌棉片过滤后，65℃水浴30min杀灭繁殖体，并激活芽孢，用灭菌水室温洗涤和离心10次；最后用萌发缓冲液悬浮芽孢至OD₆₅₀≈1.0(≈4.0×10⁸个芽孢/mL)。放置于4℃保存，每周用缓冲液洗涤1次。

二、L-Ala对芽孢萌发的促进作用

向芽孢萌发体系中添加萌发剂后，芽孢开始萌发，体系在650nm的光密度随着萌发率的增大而减小(芽孢折光性高，而萌发后吸光性增强)，当萌发率达到100％时，光密度降低到初始值的50％～60％，并且在此范围内光密度的减小量与芽孢萌发率的增加量成反比，即芽孢的萌发率是光密度降低率的2倍。通过测量芽孢体系在650nm光密度的降低率可以计算芽孢的萌发率。

首先将步骤一制备的芽孢离心收集，并用灭菌水将芽孢悬浮至OD₆₅₀≈1.0，用灭菌水离心洗涤芽孢3次，再用萌发缓冲液悬浮芽孢至初始浓度，然后将芽孢悬浮液等量分布于灭菌试管中，分别加入一定量的萌发剂L-Ala(溶剂为萌发缓冲液)使其在整个体系中终浓度达100mmol/L，37℃，作用时间分别为0min，5min，10min，15min，20min，检测不同时间点试管中芽孢悬液在650nm的光密度。同时设置不加萌发剂L-Ala的生长对照。检测前将试管摇动至少30s，使芽孢均匀分布。测定结果如表1所示。

表1通过OD₆₅₀的降低检测RSVF1的芽孢生成率

实验结果表明，在加入萌发剂L-Ala(100mmol/L)15min左右，就可以促使95％以上的RSVF1芽孢萌发。

三、复合制剂对芽孢的抑制作用

1、配制复合制剂

配制复合制剂I：将乳酸链球菌素和L-丙氨酸混合，乳酸链球菌素和L-丙氨酸的质量比为1∶100，得到复合制剂I。

配制复合制剂II：将乳酸链球菌素和L-丙氨酸混合，乳酸链球菌素和L-丙氨酸的质量比为10∶9，得到复合制剂II。

配制复合制剂III：将乳酸链球菌素和L-丙氨酸混合，乳酸链球菌素和L-丙氨酸的质量比为5∶100，得到复合制剂III。

2、复合制剂对芽孢的抑制作用

实验分组如下所示(每组设3组平行，设空白对照组)：

第一组(空白对照组)：接种菌密度为1.0×10⁶cfu/mL的步骤一制备的RSVF1芽孢悬液300μL于2100μL萌发缓冲液中；

第二组(L-Ala组)：接种菌密度为1.0×10⁶cfu/mL的步骤一制备的RSVF1芽孢悬液300μL于2100μL L-Ala溶液中(L-Ala溶液的溶剂为萌发缓冲液)，使L-Ala的终浓度为8900μg/mL；

第三组(Nisin组)：接种菌密度为1.0×10⁶cfu/mL的步骤一制备的RSVF1芽孢悬液300μL于2100μL Nisin溶液中(Nisin溶液的溶剂为萌发缓冲液)，使Nisin的终浓度为420μg/mL；

第四组(复合制剂组I)：接种菌密度为1.0×10⁶cfu/mL的步骤一制备的RSVF1芽孢悬液300μL于2100μL复合制剂I溶液中，使复合制剂I的终浓度为100μg/mL。

第五组(复合制剂组II)：接种菌密度为1.0×10⁶cfu/mL的步骤一制备的RSVF1芽孢悬液300μL于2100μL复合制剂II溶液中(复合制剂II溶液的溶剂为萌发缓冲液)，使复合制剂II的终浓度为100000μg/mL。

第六组(复合制剂组III)：接种菌密度为1.0×10⁶cfu/mL的步骤一制备的RSVF1芽孢悬液300μL于2100μL复合制剂溶液III中(复合制剂III溶液的溶剂为萌发缓冲液)，使复合制剂III的终浓度为9450μg/mL。

以上6组，室温静置培养15min后混匀再分别取1mL在8000rpm下离心3min去除上清，用萌发缓冲液反复吹洗3-4次后同样条件下离心彻底清除残留蛋白，再用萌发缓冲液1mL将其重悬，取100μL涂布肉汤平板，30℃孵育18-24h，计数法检测对萌发芽孢的杀灭率。实验结果见图3和表2。

表2  平板计数法定量测定Nisin与PlyG对芽孢的杀灭率

实验结果证明，在常温条件下，在15min内，L-Ala对RSVF1芽孢的杀灭率为2.4847％；Nisin对RSVF1芽孢的杀灭率为20.28％；而复合制剂III对芽孢的杀灭率为99.37％，比Nisin提高了约5倍。

Claims (10)

1、一种杀灭芽孢杆菌芽孢的复合制剂，其活性成分是乳酸链球菌素和L-丙氨酸。

2、如权利要求1所述的复合制剂，其特征在于：所述乳酸链球菌素和所述L-丙氨酸质量比为(9-1000)∶900。

3、如权利要求2所述的复合制剂，其特征在于：所述乳酸链球菌素和所述L-丙氨酸质量比为(2-100)∶100。

4、如权利要求3所述的复合制剂，其特征在于：所述乳酸链球菌素和所述L-丙氨酸质量比为(3-6)∶100。

5、一种杀灭芽孢杆菌芽孢的方法，是应用权利要求1至4中任一所述的复合制剂杀灭芽孢。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于：将所述复合制剂为溶液；所述溶液的溶剂为萌发缓冲液。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于：每升所述萌发缓冲液含有以下组分：10mmol NaH₂PO₄，100mmol NaCl。

8、如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：每升所述复合制剂溶液中，所述活性成分的量为100-100000μg/mL。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于：每升所述复合制剂溶液中，所述活性成分的量为1000-10000μg/mL。

10、如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述复合制剂溶液中，所述活性成分的量为9000-10000μg/mL。

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