KR101620481B1 - 미세조류로부터 ｄｎａ를 효율적으로 추출하는 방법 - Google Patents

미세조류로부터 ｄｎａ를 효율적으로 추출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류에 페놀과 비드를 가하고, 동결 및 해동과정은 수회 반복하며, 비드비팅하여 세포벽을 파쇄하고, 상기 파쇄물로부터 DNA를 추출하는 단계를 포함하는 미세조류(eukaryote algae)로부터 DNA를 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법을 이용하면, 종래의 방법에 비하여 적은 양의 미세조류 시료로부터 다량의 DNA를 추출할 수 있으므로, DNA를 이용한 미세조류의 연구에 이바지할 수 있을 것이다.

Description

미세조류로부터 ＤＮＡ를 효율적으로 추출하는 방법{A Efficient Method for Extracting DNA from Eukaryote Algae}
본 발명은 미세조류(eukaryote algae)로부터 DNA를 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로, 본 발명은 미세조류에 페놀과 비드를 가하고, 동결 및 해동과정은 수회 반복하며, 비드비팅하여 세포벽을 파쇄하고, 상기 파쇄물로부터 DNA를 추출하는 단계를 포함하는 미세조류로부터 DNA를 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것이다.
미생물 전체 군집 구조의 분석은 16S rDNA를 이용하며, 군집 내 모든 개체의 DNA를 포함하고 있는 rDNA로 분석하며, 향후 유전자 클로닝과 염기서열분석이 요구된다. 이러한 분석을 위해서 처음으로 실시되는 과정인 DNA의 추출 과정은 전반적인 미생물 연구 분야에 필수적이다. 예를 들면, 미생물 대사분석을 위한 DNA 기술인 서든 블락 (southern blot), 리얼타임 PCR (real-time PCR)기법, 군집분석을 위한 디지지이 (Denatrued Gradient Gel Electrophoresis; DGGE) 및 마이크로어레이 분석기법과 같은 기술에 사용 될 수 있다. 이때, DNA의 손상이 없고, 순도가 높으면서도 간편하고, 신속한 DNA 추출 과정이 필수적이다.
세포로부터 DNA를 추출하는 과정에서 세포를 파쇄하는 방법을 선택하여야 하며, 세포 파쇄를 위한 방법을 비드비팅 (Cardinali et al. 2000), 엔자임을 통한 세포벽의 용해 (Varma and Kwon-Chung. 1991), 및 복잡한 시약을 통한 방법 (Holm et al. 1986, Lippke et al. 1987) 등이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법은 많은 세포의 양을 필요로 하며, DNA 추출 과정에서 비싼 비용과 많은 시간이 소모된다. 그 중에서 종래의 미세조류에서 DNA 및 RNA를 추출하는 전통적인 방법은 많은 시료의 세포를 필요로 하며, 매우 낮은 회수율을 가진다 (Nakajima et al. 2000, Turmel et al. 1999). 이는 미세조류의 세포벽의 구성이 다양하여, 단백질, 점액질 및 다당류 등의 많은 성분이 혼재되어 있기 때문이며, 이 때문에 손상 없이 DNA를 수거하기가 용이하지 않기 때문이다.
예컨대, 종래의 미세조류에서 DNA 추출 방법은 식물에서 사용되는 DNA 추출키트를 사용하고 있다. 이는 식물세포를 화학 처리하여 DNA가 부착되는 막을 이용하여 DNA를 분리하는 단계를 거친다. 그러나 상기 종래의 방법은 미세조류를 완전히 액화시키는데 약 10분~1시간 정도 소요되고, 그 후의 추출과정이 복잡하고 많은 시약들과 한시간 반 이상의 시간이 소요되는 등 많은 단점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 상술한 종래의 단점을 해결하고자, 예의 연구노력한 결과, 냉동해동방법과 물리적 파쇄방법을 조합하여 사용할 경우, 미세조류로부터 DNA를 효율적으로 추출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 미세조류(eukaryote algae)로부터 DNA를 효율적으로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태로서, 본 발명은 냉동해동방법과 물리적 파쇄방법을 포함하는 미세조류(eukaryote algae)로부터 DNA를 효율적으로 추출하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법은 (ⅰ) 미세조류 또는 이의 일부에 물, 페놀 및 비드를 가하여 혼합물을 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 혼합물의 동결 및 해동을 반복하여 수행하는 단계; (ⅲ) 상기 동결 및 해동된 반응물을 비드비팅시켜서, 세포벽을 파쇄하는 단계; 및, (ⅳ) 상기 세포벽이 파쇄된 반응물로부터 DNA를 추출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "미세조류(eukaryote algae)"는 단백질, 점액질 및 다당류 등의 다양한 성분을 포함하는 세포벽을 포함하는 광합성 단세포 생물을 의미하는데, 상기 미세조류는 특별히 이에 제한되지 않으나, Botryococcus braunii UTEX572, Scenedesmus sp. AG20831 또는 Chlamydomonas sp. AG20446을 포함할 수 있다.
본 발명에서 페놀은 세포벽을 용해하면서 동시에 세포가 파쇄 되었을 때 세포질을 포함한 세포 내에 존재하는 DNA 분해효소를 억제하는 역할을 수행하는데, 바람직하게는 가온되지 않은 10 내지 35℃의 것을 사용한다. 상기 온도 이상의 온도를 나타내는 페놀을 사용할 경우에는 반응용기 외부로 방출되는 현상이 발생할 수 있다.
본 발명의 용어 "비드"란, 비드비팅 (bead beating)에 이용되는 통상의 비드를 의미하는데, 상기 비드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 글라스비드, 실리카 비드, 지르코니아 비드, 지르코니아/실리카 비드를 사용할 수 있고, 바람직하게는 지르코니아/실리카 비드를 사용한다.
아울러, 상기 비드는 동일한 크기를 가지는 비드를 사용할 수도 있고, 서로다른 크기를 가지는 비드를 혼합하여 사용할 수도 있다. 서로 다른 크기를 가지는 비드를 혼합하여 사용할 경우에, 이들의 크기는 특별히 이에 제한되지 않으나 직경 0.1mm 및 0.5mm의 크기를 가지는 비드를 혼합하여 사용함이 바람직하고, 이들의 혼합비는 특별히 이에 제한되지 않으나 0.1mm의 비드와 직경 0.5mm의 비드를 1:3 내지 3:4(w/w)의 비율로 혼합하여 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 "동결 및 해동을 반복"하는 단계는 뜨거운 물과 액체 질소를 이용하여 미세조류 세포의 동결 및 해동을 수행하는 과정을 의미하는데, 이러한 동결 및 해동의 반복에 의하여 세포벽의 일부를 파쇄하거나 또는 전체적으로 세포벽을 약화시킬 수 있다. 이때, 동결수단은 특별히 이에 제한되지 않으나, 액체질소를 사용하여 수행함이 바람직하고, 해동수단 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 75 내지 100℃의 끓는 물을 이용하여 수행함이 바람직하다. 또한, 상기 동결 및 해동을 반복할 경우 반복횟수는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 5회 수행하고, 보다 바람직하게는 3회 수행한다.
본 발명의 용어 "비드비팅"이란 비드와 비드비팅 기계를 이용하여, 비드를 회전시켜서 회전된 비드의 충격으로 세포벽을 물리적으로 파쇄하는 방법을 의미하는데, 상기 비드의 회적속도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1,500 ~ 7,000rpm, 바람직하게는 2,000 ~ 5,000rpm에서, 5 ~ 300 초, 바람직하게는 10 ~ 60초 동안 수행할 수 있다. 상기 범위를 초과할 경우에는 세포벽 뿐만 아니라 DNA까지도 손상될 수 있고, 상기 범위에 미치지 못할 경우에는 세포벽이 정상적으로 파쇄되지 않을 수 있다. 본 발명의 비드비팅은 가장 바람직하게는 3800rpm에서 50초 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 용어 "DNA 추출"이란 세포벽이 파쇄된 미세조류로부터 노출된 DNA를 원심분리하여 분리한 후, 분리된 DNA에 포함된 불순물을 제거하여 정제하는 일련의 과정을 의미한다. 이때, 상기 불순물을 제거하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 페놀과 클로로포름을 처리하여 단백질 성분을 제거하거나, 아세트산나트륨을 처리하여 핵산을 농축시키거나, 이소프로릴 알코올 또는 70% 에탄올을 이용하여 DNA를 침전시키는 방법 등을 조합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 페놀과 클로로포름을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 과정을 포함한다.
본 발명자들은 미세조류에서 DNA를 추출하는 종래방법의 단점을 극복하기 위하여 다양한 연구를 수행한 결과, 비드비팅을 이용한 물리적 파쇄방법과 동결 및 해동을 반복하는 방법을 조합할 경우, 미세조류에서 DNA의 추출효율이 향상됨을 확인할 수 있었다(도 1). 도 1은 미세조류(eukaryote algae)로부터 고효율로 DNA를 추출하는 개요도이다. 이를 확인하기 위하여, 종래의 DNA 추출키트, 비드비팅을 이용한 물리적 파쇄방법 및 동결 및 해동을 반복하는 방법을 이용한 DNA 추출효율과 본 발명의 비드비팅을 이용한 물리적 파쇄방법과 동결 및 해동을 반복하는 방법을 조합한 방법을 이용한 DNA 추출효율을 비교한 결과, 본 발명의 방법을 사용할 경우 미세조류에서 DNA 추출효율을 현저하게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
한편, 상기 비드비팅을 이용한 물리적 파쇄시에 비드비팅의 최적 조건을 스크리닝한 결과, 한 종류의 비드를 사용하는 것 보다는 서로 다른 크기의 비드를 혼합하여 사용할 경우, DNA 추출효율이 더욱 향상됨을 알 수 있었고, 상기 비드 혼합물은 특별히 이에 제한되지 않으나 직경 0.1mm 크기의 비드와 직경 0.5mm 크기의 비드를 포함하는 혼합물을 사용함이 바람직하고, 상기 혼합비는 특별히 이에 제한되지 않으나, 0.1mm 비드와 0.5mm 비드의 혼합비가 1:3 내지 3:4(w/w)이고, 가장 바람직하게는 0.1mm 비드와 0.5mm 비드의 혼합비가 3:4(w/w)임을 확인하였다.
아울러, 상기 비드비팅시간이 증가할수록 DNA 추출효율이 증가하지만 60초 이상의 시간동안 비드비팅할 경우에는 오히려 DNA 추출효율이 감소하므로, 바람직한 비드비팅시간은 약 30초 내지 50초임을 알 수 있었다.
본 발명의 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법을 이용하면, 종래의 방법에 비하여 적은 양의 미세조류 시료로부터 다량의 DNA를 추출할 수 있으므로, DNA를 이용한 미세조류의 연구에 이바지할 수 있을 것이다.
도 1은 미세조류(eukaryote algae)로부터 고효율로 DNA를 추출하는 개요도이다.
도 2는 본 발명의 방법으로 추출된 DNA의 전기영동사진이다.
도 3은 종래의 식물에서 사용하는 DNA 추출 키트 (Qiagen DNeasy® Plant Mini Kit)를 이용하여 추출된 DNA의 전기영동사진이다.
도 4는 종래의 시아노박테리아에서 사용하는 RNA 추출 방법 (BPC 추출방법)을 이용하여 추출된 DNA의 전기영동사진이다.
도 5는 종래의 동결 및 해동방법을 통해 추출된 DNA의 전기영동사진이다.
도 6은 다양한 조합의 비드를 가하여 추출된 DNA의 전기영동사진이다.
도 7은 비드비팅 시간을 달리하여 추출된 DNA의 전기영동사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 미세조류로부터 DNA 의 추출
세가지 종류의 미세조류 Botryococcus braunii UTEX572(1번 균주), Scenedesmus sp. AG20831(2번 균주) 또는 Chlamydomonas sp. AG20446(3번 균주)의 배양액 3㎖를 원심분리하여, 각각의 미세조류 세포를 수득하였다. 상기 수득한 미세조류 세포에 증류수 800㎕ 및 페놀 600㎕(pH 8.0)을 가하여 현탁시키고, 추가로 지르코니아/실리카 비드(0.5 mm, 0.4 g : 0.1 mm, 0.3 g)를 가하였다. 이어, 100℃의 물과 액체 질소를 이용하여 상기 현탁액을 냉동 및 해동하는 과정을 3회 반복하였다. 다음으로, 상기 동결 및 해동절차를 수행한 현탁액을 3,800rpm 및 50초의 조건으로 비드비팅 기계에 적용하여 세포벽을 파쇄하였다.
상기 세포벽을 파쇄한 현탁액을 10,000 × g에서 10분간 원심분리하고, 이로부터 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액에 클로르포름 600㎕를 가하고, 15초간 혼합기(vortex)를 이용하여 격렬하게 교반한 다음, 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 이로부터 상층액을 수득하였다.
상기 상층액에 동량의 이소프로필알코올 및 10%(v/v)의 3M 소디움아세테이트를 가하고, 서서히 혼합한 다음, -20℃에 잠시 보관하였으며, 보관한 시료를 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 이어, 70% 에탄올 1㎖를 가하고 혼합한 다음, 또 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였으며, 침전된 DNA 펠렛을 5분동안 진공건조시킨 다음, 멸균 증류수 100㎕를 가하여 DNA를 용해시키고, 이를 -70℃에 보관하였다(도 2). 도 2는 본 발명의 방법으로 추출된 DNA의 전기영동사진으로서, M은 1kb 사이즈 마커를 나타내고, B는 Botryococcus braunii UTEX572로부터 추출된 DNA를 나타내며, S는 Scenedesmus sp. AG20831로부터 추출된 DNA를 나타내고, C는 Chlamydomonas sp. AG20446로부터 추출된 DNA를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, Botryococcus braunii UTEX572, Scenedesmus sp. AG20831 및 Chlamydomonas sp. AG20446의 세 가지 미세조류의 DNA가 추출되었음을 알 수 있었다.
비교실시예 1: 종래의 식물 DNA 추출 키트를 이용하여 DNA 를 추출하는 방법
실시예 1에서 추출된 DNA의 추출효율과 종래의 식물 DNA 추출키트를 이용한 DNA의 추출효율을 비교하고자 하였다. 이때, 종래에 사용된 식물 DNA 추출키트로는 상용화되어 있는 키트(Qiagen DNeasy® Plant Mini Kit)를 이용하여 실시예 1에서 사용한 3종의 미세조류와 동일한 미세조류로부터 DNA를 추출하였다.
구체적으로, 세가지 종류의 미세조류 Botryococcus braunii UTEX572(1번 균주), Scenedesmus sp. AG20831(2번 균주) 또는 Chlamydomonas sp. AG20446(3번 균주)의 배양액 3㎖를 원심분리하여, 각각의 미세조류 세포를 수득하였다. 상기 수득한 미세조류 세포에 상기 키트에 포함된 AP1 버퍼 400㎕와 RNase A stock solution(100 ml/ml) 4㎕를 첨가하여 현탁시키고, 65℃ 에서 20분간 방치하면서, 2~3분마다 시약과 시료가 잘 섞이도록 튜브를 가볍게 교반하였다. 그런 다음, AP2 버퍼를 첨가하여, 10초간 혼합하고, 얼음에서 5분간 방치하였으며, 이를 10,000 × g로 2분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액에 1.5배 부피의 AP3/E 버퍼를 가하고 피펫으로 혼합하였다. 혼합된 시료를 스핀컬럼(DNeasy® mini spin colume)에 적용하고, 6,000 × g로 원심분리하여 수층을 제거하였으며, 다시 AW 버퍼 500㎖를 가하고, 6,000 × g로 원심분리하여 수층을 제거하는 단계를 2회 반복하였다. 수층이 제거된 스핀컬럼에 65℃로 예열된 AE 버퍼 100㎕를 가하고 5분동안 반응시켜 스핀컬럼에 결합된 DNA를 용출시킨 다음, 10,000 × g로 원심분리하여 용출액을 수득하고, 상기 용출액을 -70℃에 보관하였다(도 3).
도 3은 종래의 식물에서 사용하는 DNA 추출 키트 (Qiagen DNeasy® Plant Mini Kit)를 이용하여 추출된 DNA의 전기영동사진으로서, M은 1kb 사이즈 마커를 나타내고, B는 Botryococcus braunii UTEX572로부터 추출된 DNA를 나타내며, S는 Scenedesmus sp. AG20831로부터 추출된 DNA를 나타내고, C는 Chlamydomonas sp. AG20446로부터 추출된 DNA를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, Botryococcus braunii UTEX572, Scenedesmus sp. AG20831 및 Chlamydomonas sp. AG20446의 세 가지 미세조류의 DNA가 추출되었음을 알 수 있었다.
비교실시예 2: 종래의 시아노박테리아 RNA 추출 방법 ( BPC 방법)을 이용하여 DNA를 추출하는 방법
실시예 1에서 추출된 DNA의 추출효율과 종래의 BPH 방법을 이용한 DNA의 추출효율을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 세가지 종류의 미세조류 Botryococcus braunii UTEX572(1번 균주), Scenedesmus sp. AG20831(2번 균주) 또는 Chlamydomonas sp. AG20446(3번 균주)의 배양액 3㎖를 원심분리하여, 각각의 미세조류 세포를 수득하였다. 상기 수득한 미세조류 세포에 증류수 800㎕ 및 페놀(pH 8.0) 600㎕와 지르코니아/실리카 비드 (0.5 mm, 0.5 g : 0.1 mm, 0.2 g)를 가하였다. 이어, 비드비팅 기계에 적용하고, 3,800rpm으로 50초간 세포벽을 파쇄하였다. 그런 다음, 상기 세포 파쇄물을 10,000 × g으로 원심분리하여 상등액을 수득한 다음, 상기 상등액에 페놀(pH 8.0) 600㎕을 추가하고, 5분간 10,000 × g 으로 원심분리하여 불순물이 제거된 상등액을 수득하였다.
상기 수득한 상등액에 클로로포름 600㎕을 가하고, 15초동안 혼합기를 이용하여 격렬하게 교반한 다음, 10,000 × g 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였으며, 상기 상등액에 동일 부피의 이소프로필알코올과 10% 부피의 3M 소디움아세테이트 용액을 가하고, 손으로 천천히 혼합한 후, -20℃에 잠시 보관하였으며, 이를 10,000 × g 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 침전된 DNA를 수득하였다.
상기 수득한 DNA에 1㎖의 70% 에탄올을 가하여 혼합하고, 10,000 × g 으로 5분동안 원심분리한 다음, 이로부터 상등액을 제거하고, 침전된 DNA를 5분간 건조시켰다. 이어, RNase가 없는 증류수 (RNA-free water)를 100㎕를 가하고 피펫으로 조심스럽게 혼합한 다음 -70℃에 보관하고 이중 일부를 전기영동하였다(도 4). 도 4는 종래의 BPH 방법을 이용하여 추출된 DNA의 전기영동사진으로서, M은 1kb 사이즈 마커를 나타내고, B는 Botryococcus braunii UTEX572로부터 추출된 DNA를 나타내며, S는 Scenedesmus sp. AG20831로부터 추출된 DNA를 나타내고, C는 Chlamydomonas sp. AG20446로부터 추출된 DNA를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, Botryococcus braunii UTEX572, Scenedesmus sp. AG20831 및 Chlamydomonas sp. AG20446의 세 가지 미세조류의 DNA가 추출되었음을 알 수 있었다.
비교실시예 3: 종래의 동결 및 해동 방법을 이용하여 DNA 를 추출하는 방법
실시예 1에서 추출된 DNA의 추출효율과 종래의 동결 및 해동방법을 이용한 DNA의 추출효율을 비교하고자 하였다.
구체적으로, 세가지 종류의 미세조류 Botryococcus braunii UTEX572(1번 균주), Scenedesmus sp. AG20831(2번 균주) 또는 Chlamydomonas sp. AG20446(3번 균주)의 배양액 3㎖를 원심분리하여, 각각의 미세조류 세포를 수득하였다. 상기 수득한 미세조류 세포에 증류수 800㎕ 가하여 현탁시키고 100℃의 물과 액체 질소를 이용하여 상기 현탁액을 냉동 및 해동하는 과정을 3회 반복하였다. 그런 다음, 상기 세포 파쇄물을 10,000 × g으로 원심분리하여 상등액을 수득한 다음, 상기 상등액에 페놀(pH 8.0) 600㎕을 추가하고, 5분간 10,000 × g 으로 원심분리하여 불순물이 제거된 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액에 클로로포름 600㎕을 가하고, 15초동안 혼합기를 이용하여 격렬하게 교반한 다음, 10,000 × g 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였으며, 상기 상등액에 동일 부피의 이소프로필알코올과 10% 부피의 3M 소디움아세테이트 용액을 가하고, 손으로 천천히 혼합한 후, -20℃에 잠시 보관하였으며, 이를 10,000 × g 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 침전된 DNA를 수득하였다. 상기 수득한 DNA에 1㎖의 70% 에탄올을 가하여 혼합하고, 10,000 × g 으로 5분동안 원심분리한 다음, 이로부터 상등액을 제거하고, 침전된 DNA를 5분간 건조시켰다. 이어, RNase가 없는 증류수 (RNA-free water)를 100㎕를 가하고 피펫으로 조심스럽게 혼합한 다음, 이를 -70℃에 보관하였다(도 5). 도 5는 종래의 동결 및 해동방법을 통해 추출된 DNA의 전기영동사진으로서, M은 1kb 사이즈 마커를 나타내고, B는 Botryococcus braunii UTEX572로부터 추출된 DNA를 나타내며, S는 Scenedesmus sp. AG20831로부터 추출된 DNA를 나타내고, C는 Chlamydomonas sp. AG20446로부터 추출된 DNA를 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 종래의 동결 및 해동방법을 이용할 경우, DNA 추출효율이 극도로 낮아짐을 알 수 있었다.
실시예 2: 미세조류로부터 추출된 DNA 의 추출효율의 비교
상기 실시예 1 및 비교실시예 1 내지 3의 방법으로 추출된 각기 3개의 DNA시료를 대상으로 DNA 농도, 총 DNA량 및 A260/280 비율을 비교하여, 어떠한 방법이 가장 높은 DNA 추출효율을 나타내는지 확인하였다(표 1).
다양한 방법을 이용하여 추출한 DNA의 추출효율 비교
시 료 DNA 농도 총 DNA량(㎍) A260/280 비율
실시예 1(1번 균주) 224.15ng/㎕ 22.42 2.01
실시예 1(2번 균주) 258.05ng/㎕ 25.81 2.00
실시예 1(3번 균주) 295.50ng/㎕ 29.55 2.04
비교실시예 1(1번 균주) 31.62ng/㎕ 3.16 2.00
비교실시예 1(2번 균주) 63.36ng/㎕ 6.34 1.99
비교실시예 1(3번 균주) 57.98ng/㎕ 5.80 2.08
비교실시예 2(1번 균주) 86.85ng/㎕ 5.21 2.10
비교실시예 2(2번 균주) 86.25ng/㎕ 5.18 2.14
비교실시예 2(3번 균주) 100.10ng/㎕ 6.01 2.13
비교실시예 3(1번 균주) 3.30ng/㎕ 0.33 2.54
비교실시예 3(2번 균주) 9.20ng/㎕ 0.92 2.30
비교실시예 3(3번 균주) 15.10ng/㎕ 1.51 2.24
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 방법(실시예 1)으로 추출한 DNA가 전체적으로 가장 우수함을 알 수 있었다. 아울러, 본 발명의 방법에 소요되는 시간은 약 1시간이었으나, 비교실시예 1 내지 3의 방법에 소요되는 시간은 약 1시간 30분이었으므로, 본 발명의 방법이 보다 짧은시간에 DNA를 추출할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 미세조류의 DNA의 추출 방법은 3 ml의 적은 양의 시료로도 1시간 정도의 매우 짧은 시간 내에 간편하게 세 종의 세균에 대해서 259.23㎍/㎖의 평균농도 및 총 25.93㎍의 DNA를 추출할 수 있으므로, 비교실시예의 결과와 각각 비교하여 볼 때, DNA 양은 4.3배 내지 67.9배 더 많이 추출해 낼 수 있는 고 효율의 DNA 추출 방법임을 알 수 있었다.
실시예 3: 두 가지 비드를 이용하여 미세조류로부터 추출된 DNA 의 추출효율의 비교
상기 실시예 2의 결과로부터 본 발명의 미세조류의 DNA의 추출 방법은 짧은 시간내에 다량의 DNA를 추출할 수 있는 고효율의 DNA 추출방법임을 확인하였으므로, 상기 비드비팅의 조건을 변화시키면서, 이에 따른 DNA 추출효율의 변화를 확인하고자 하였다.
미세조류 Botryococcus braunii UTEX572의 배양액 3㎖를 원심분리하여, 미세조류 세포를 수득하였다. 상기 수득한 미세조류 세포에 증류수 800㎕ 및 페놀 600㎕(pH 8.0)을 가하여 현탁시키고, 직경 0.1mm 및 0.5mm의 지르코니아/실리카 비드를 다양하게 조합하여 가하였다. 이어, 100℃의 물과 액체 질소를 이용하여 상기 현탁액을 냉동 및 해동하는 과정을 3회 반복하였다. 다음으로, 상기 동결 및 해동절차를 수행한 현탁액을 3,800rpm 및 50초의 조건으로 비드비팅 기계에 적용하여 세포벽을 파쇄하였다.
상기 세포벽을 파쇄한 현탁액을 10,000 × g에서 10분간 원심분리하고, 이로부터 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액에 클로르포름 600㎕를 가하고, 15초간 혼합기(vortex)를 이용하여 격렬하게 교반한 다음, 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 이로부터 상층액을 수득하였다.
상기 상층액에 동량의 이소프로필알코올 및 10%(v/v)의 3M 소디움아세테이트를 가하고, 서서히 혼합한 다음, -20℃에 잠시 보관하였으며, 보관한 시료를 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 이어, 70% 에탄올 1㎖를 가하고 혼합한 다음, 또 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였으며, 침전된 DNA 펠렛을 5분동안 진공건조시킨 다음, 멸균 증류수 100㎕를 가하여 DNA를 용해시키고, 이를 추출효율을 비교하였다(표 2 및 도 6).
다양한 조합의 비드를 가하여 추출된 DNA의 추출효율 비교
실험군 0.1mm
비드(g)		 0.5mm
비드(g)		 A260 A280 A260/280 DNA 농도
(ng/㎕)		 총 DNA
(ng)
1 0.10 0.80 4.135 2.044 2.02 206.75 20,675
2 0.15 0.70 2.636 1.281 2.06 131.80 13,180
3 0.20 0.60 4.070 1.984 2.05 203.50 20,350
4 0.25 0.50 4.611 2.207 2.09 230.55 23,055
5 0.30 0.40 4.930 2.398 2.06 246.50 24,650
6 0.35 0.30 3.993 1.900 2.10 199.65 19,965
아울러, 도 6은 다양한 조합의 비드를 가하여 추출된 DNA의 전기영동사진으로서, M은 1kb 사이즈 마커를 나타내고, 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 번호는 표 2의 실험군을 나타낸다.
표 2와 도 6에서 보듯이, 실험군 5의 조건에서 가장 높은 24.65 ug의 DNA가 추출되었음을 알 수 있었다.
따라서, 한 종류의 비드를 사용하는 것 보다는 서로 다른 크기의 비드를 혼합하여 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.
실시예 3: 비드비팅시간의 변화에 따른 미세조류로부터 추출된 DNA 의 추출효율의 비교
미세조류 Botryococcus braunii UTEX572의 배양액 3㎖를 원심분리하여, 미세조류 세포를 수득하였다. 상기 수득한 미세조류 세포에 증류수 800㎕ 및 페놀 600㎕(pH 8.0)를 가하여 현탁시키고, 지르코니아/실리카 비드(0.5 mm, 0.4 g : 0.1 mm, 0.3 g)를 가하였다. 이어, 100℃의 물과 액체 질소를 이용하여 상기 현탁액을 냉동 및 해동하는 과정을 3회 반복하였다. 다음으로, 상기 동결 및 해동절차를 수행한 현탁액을 3,800rpm의 조건으로 각각 30초, 40초, 50초, 60초 또는 70초동안 비드비팅 기계에 적용하여 세포벽을 파쇄하였다. 그런 다음, 상기 세포벽을 파쇄한 각각의 현탁액을 10,000 × g에서 10분간 원심분리하고, 이로부터 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 상등액에 클로르포름 600㎕를 가하고, 15초간 혼합기(vortex)를 이용하여 격렬하게 교반한 다음, 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 이로부터 상층액을 수득하였다. 상기 상층액에 동량의 이소프로필알코올 및 10%(v/v)의 3M 소디움아세테이트를 가하고, 서서히 혼합한 다음, -20℃에 잠시 보관하였으며, 보관한 시료를 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 이어, 70% 에탄올 1㎖를 가하고 혼합한 다음, 또 다시 10,000 × g에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였으며, 침전된 DNA 펠렛을 5분동안 진공건조시킨 다음, 멸균 증류수 100㎕를 가하여 DNA를 용해시키고, 이를 -70℃에 보관하였다(표 3 및 도 7).
비드비팅시간의 변화에 따른 DNA의 추출효율 비교
실험군 비드비팅시간
(초)		 A260 A280 A260/280 DNA 농도
(ng/㎕)		 총 DNA (ng)
11 30 4.483 2.226 2.01 224.15 22,415
12 40 5.161 2.577 2.00 258.05 25,805
13 50 5.910 2.892 2.04 295.50 29,550
14 60 3.532 1.695 2.08 176.6 17,660
15 70 2.832 1.322 2.14 141.6 19,195
도 7은 비드비팅 시간을 달리하여 추출된 DNA의 전기영동사진으로서, M은 1kb 사이즈 마커를 나타내고, 30, 40, 50, 60, 70의 번호는 시간에 따른 조건으로부터 추출된 DNA를 나타낸다. 도 7에서 보듯이 30초, 40초, 50초 시간으로 비드비팅 시간의 증가로 인해 추출된 DNA의 양이 증가되는 것을 확인하였다. 그러나, 비드비팅 시간이 60초와 70초로 증가되면 추출된 DNA의 양이 다시 감소되는 것을 알 수 있었다.
따라서, 적절한 비드비팅시간은 약 30 내지 50초임을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. (ⅰ) 녹색 미세조류에 물, 페놀 및 비드를 가하여 혼합물을 수득하는 단계;
    (ⅱ) 상기 혼합물의 동결 및 해동을 반복하여 수행하는 단계;
    (ⅲ) 상기 동결 및 해동된 반응물을 비드비팅시켜서, 세포벽을 파쇄하는 단계; 및,
    (ⅳ) 상기 세포벽이 파쇄된 반응물로부터 DNA를 추출하는 단계를 포함하는, 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 Botryococcus braunii UTEX572, Scenedesmus sp. AG20831 또는 Chlamydomonas sp. AG20446인 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 페놀은 가열되지 않은 10~35℃의 페놀인 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 비드는 글라스, 실리카, 지르코니아 또는 지르코니아/실리카 재질의 비드인 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 비드는 서로 다른 크기를 가지는 비드의 혼합물인 것인 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 비드의 혼합물은 직경 0.1mm의 비드와 직경 0.5mm의 비드의 혼합물인 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    0.1mm의 비드와 직경 0.5mm의 비드의 혼합비는 1:3 내지 3:4(w/w)인 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    비드비팅 시간은 30초 내지 50초인 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 동결 및 해동은 액체질소와 75~100℃의 끓는 물을 이용하는 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    반응물로부터 DNA를 추출하는 단계는 상기 파쇄물에 페놀 및 클로로포름을 동시 또는 순차적으로 처리하는 과정을 포함하는 것인 녹색 미세조류로부터 DNA를 추출하는 방법.
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