KR20090124923A - 활성탄을 이용한 고순도 플라스미드 ｄｎａ의 분리정제방법 - Google Patents

활성탄을 이용한 고순도 플라스미드 ｄｎａ의 분리정제방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090124923A
KR20090124923A KR1020090028765A KR20090028765A KR20090124923A KR 20090124923 A KR20090124923 A KR 20090124923A KR 1020090028765 A KR1020090028765 A KR 1020090028765A KR 20090028765 A KR20090028765 A KR 20090028765A KR 20090124923 A KR20090124923 A KR 20090124923A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
plasmid dna
activated carbon
acid fragments
dna
Prior art date
Application number
KR1020090028765A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101106969B1 (ko
Inventor
조병남
김재영
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Publication of KR20090124923A publication Critical patent/KR20090124923A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101106969B1 publication Critical patent/KR101106969B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/20—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising free carbon; comprising carbon obtained by carbonising processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 형질전환체로부터 핵산 추출물을 수득하고, 이에 활성탄을 처리하는 공정을 포함하는 고순도의 플라스미드 DNA의 분리정제방법에 관한 것이다. 본 발명의 고순도의 플라스미드 DNA의 분리정제방법은, (ⅰ) 형질전환체로부터 핵산 추출물을 수득하는 공정; 및, (ⅱ) 상기 핵산 추출물에 활성탄을 가하고, 교반한 다음, 이를 원심분리하여 상층액을 수득하는 공정을 포함한다. 본 발명의 고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법에 따르면, 종래의 RNase를 처리하는 방법과는 달리, RNA 핵산단편 뿐만 아니라 DNA 핵산단편 까지도 제거하여, 핵산단편에 의한 실험오차를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 대장균의 배양에 따른 미니프렙(mini-prep) 뿐만 아니라, 미디프렙(midi-prep)과 맥스프렙(maxi-prep)까지 모든 배양수준에서 활성탄을 이용하여 순도가 향상된 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있어서, 유전자 치료 및 백신 등 의약품의 개발 및 생산에 널리 이용할 수 있을 것이다.
플라스미드 DNA, 핵산단편, 활성탄

Description

활성탄을 이용한 고순도 플라스미드 ＤＮＡ의 분리정제방법{A Method for Purifying High-Quality Plasmid DNA Using Activated Charcoal}
본 발명은 활성탄을 이용한 고순도 플라스미드 DNA의 분리정제방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 형질전환체로부터 핵산 추출물을 수득하고, 이에 활성탄을 처리하는 공정을 포함하는, 고순도 플라스미드 DNA의 분리정제방법에 관한 것이다.
플라스미드 DNA는 숙주에서 빠르게 증식하며, 항생제 처리만으로 플라스미드 DNA의 도입 이전과 도입 이후의 숙주세포 선별이 가능한 특성을 지닌 폐쇄원형분자(closed circular molecule)로서 특정 유전자의 증폭이 가능하고, 이를 벡터로 이용할 경우, 다양한 종에서 특정 유전자를 고도로 발현시킨 형질전환 유기체(GMO, genetically modified organism)의 연구 및 그의 생산이 가능하다. 아울러, 고순도 플라스미드 DNA는 DNA 증폭(PCR, polymerase chain reaction amplification), DNA 염기서열 결정과 트랜스진(transgene)의 서브클로닝 등 후속연구를 성공적으로 수행하기 위한 중요한 요소이다.
이와 같은 이유로, 고수율과 고순도로 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 많은 노력을 기울여왔다(참조: Sambrook J and Russell DW, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). 일반적으로, 플라스미드 DNA의 분리정제는 숙주세포 배양 정도에 따라서, 미니프렙(mini-prep), 미디프렙(midi-prep)과 맥시프렙(maxi-prep)으로 수행하며, 제품화된 키트를 이용하기도 한다(참조: Sambrook J and Russell DW, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; Birnboim HC, Methods Enzymol., 100:243-255, 1983). 그러나, 이러한 종래의 방법으로 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산 추출물을 분리정제할 경우에는, 플라스미드 DNA 이외에 핵산단편을 포함하는 다양한 불순물들이 플라스미드 DNA와 함께 분리된다.
상기 핵산 추출물에서 플라스미드 DNA와 공존하는 불순물로는, 주로 분리정제과정에서 생성되는 DNA 단편, RNA 단편 등의 핵산단편들과, 소량의 페놀화합물, 다당류 및 추출시약에서 유래된 염들이 알려져 있다(참조: Do N, Adams RP, BioTechniques, 10:162-166, 1991). 핵산 추출물에 존재하는 핵산단편들은 정확한 플라스미드 DNA 양의 측정에서 오차를 증가시키며, DNA 중합효소의 효율을 감소시키고, 상기 다당류는 제한효소 HindIII의 절단작용을 저해하며, 추출시약에서 유래된 염들은 이온을 생성하여 단백질과 DNA결합을 불안정하게 하는 것으로 알려져 있다(참조: Norberg N, Arch. Biochem. Biophys., 410:48-68, 2003; Vinod K. Misra, et al., J. Mol. Biol., 238:264-280, 1994). 아울러, 이러한 불순물들은 일련의 후속 실험에 영향을 주어서 실험상의 오류를 유발하고, 실험의 재현성을 떨어뜨리며, 실험결과를 왜곡하기도 한다.
플라스미드 DNA의 분리정제시 불순물의 대부분을 차지하는 핵산단편을 제거하기 위하여, 지금까지는 RNase를 처리하여 핵산단편을 제거하는 방법을 사용하여 왔으나, 이 방법을 이용할 경우 전체 핵산단편 중 약 50% 정도에 해당하는 RNA 핵산단편을 제거할 수 있을 뿐, DNA 핵산단편을 제거할 수 없다는 문제점이 있었다. 한편, 유전자 치료 및 유전자 백신의 시장이 점차로 증대될 전망이 있어, 이미 미국의 식의약국(FDA)과 세계보건기구(WHO)에서는 유전자 치료 및 백신으로 사용할 핵산 추출물에 포함되는 불순물에 대한 범위를 정하기에 이르렀다(참조: http://www.fda.com/cber/, http://www.who.int/en/).
따라서, 유전자 치료 및 유전자 백신 등 의약품으로 사용하기 위한 대량의 플라스미드 DNA를 제조하기 위하여, 당업게에서는 보다 효과적으로 RNA 및 DNA 핵산단편을 제거할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 소량 및 대량의 플라스미드 DNA의 분리정제시 보다 효과적으로 RNA 및 DNA 핵산단편을 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력 한 결과, 플라스미드 DNA의 분리정제시에 RNase 대신에 활성탄을 처리하면, RNA 핵산단편 뿐만 아니라 DNA 핵산단편까지도 제거되어, 보다 고순도의 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 활성탄을 이용하여 고순도의 플라스미드를 분리정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법에 따르면, 종래의 RNase를 처리하는 방법과는 달리, RNA 핵산단편 뿐만 아니라 DNA 핵산단편 까지도 제거하여, 핵산단편에 의한 실험오차를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 대장균의 배양에 따른 미니프렙(mini-prep) 뿐만 아니라, 미디프렙(midi-prep)과 맥스프렙(maxi-prep)까지 모든 배양수준에서 활성탄을 이용하여 순도가 향상된 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있어서, 유전자 치료 및 백신 등 의약품의 개발 및 생산에 널리 이용할 수 있을 것이다.
우리 주변에서 흔히 볼 수 있는 숯은 일상생활에서 각종 오염물질을 제거하는데 사용하고 있고, 이러한 숯의 다공성을 강화시킨 활성탄(activated charcoal) 의 미세공극이 불순물을 흡착하는 성질을 이용하면(참조: Claudia Coelho, et al., J. Hazad. Materials, B138:343-349, 2006; Song-yung Wang, et al., Bioresour. Technol., 16;1-7, 2008), 수질, 토양 및 대기의 각종 오염물질을 제거하는데 사용할 수 있음이 알려져 있다(참조: Claudia Coelho, et al., J. Hazad. Materials, B138:343-349, 2006; Brian R, et al., J. Chromatography, 1133(A):49-57, 2006; Daniel Hammer, et al., Environ. Pollut., 143:407-415, 2006; Florian Eyer, et al., Basic Clin. Pharm. Toxicol., 102:337-346, 2007; B. Alvarez and J.A. Guijarro, Letters Appl. Microbiol., 44:569-572, 2007; Song-yung Wang, et al., Bioresour. Technol., 16;1-7, 2008).
본 발명자들은 이러한 활성탄의 물리적 특성 및 효과에 착안하여, 공지된 알칼리 용해(alkaline lysis) 방법으로 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산 추출물을 수득한 다음, 핵산 추출물에 RNase를 가하는 대신에 활성탄을 가하여 플라스미드 DNA를 분리정제하면, 활성탄에 의하여 상기 핵산 추출물로부터 플라스미드 DNA 이외의 RNA 및 DNA 핵산단편까지도 제거되어, 고순도로 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있을 것으로 기대하였다.
이를 확인하기 위하여, 핵산 추출물에 활성탄을 가하고, 이를 원심분리하여 수득한 상층액을 전기영동한 결과, 핵산 추출물에 포함된 핵산단편만이 제거되는 효과를 나타내었고, 이러한 효과는 처리 횟수보다는 처리 총량에 의존함을 알 수 있었다. 아울러, 활성탄을 가하지 않은 경우에는, 핵산 추출물에 플라스미드 DNA와 핵산단편이 함께 존재하였으나, 활성탄을 가하는 경우에는 플라스미드 DNA에 핵산단편이 거의 존재하지 않았는 바, 이는 활성탄이 플라스미드 DNA에는 영향을 미치지 않고, 핵산단편 만을 대부분 제거하였기 때문으로 확인하였다. 또한, 활성탄의 핵산단편의 분자량에 따른 흡착효과를 조사한 결과, 활성탄의 처리량이 증가하여도 500bp 이하의 핵산단편만이 제거될 뿐, 1,000bp의 크기를 갖는 핵산단편은 제거되지 않았으므로, 일정 크기 이상의 핵산단편은 활성탄에 의하여 제거되지 않음을 알 수 있었다.
한편, 활성탄을 가하지 않은 핵산 추출물과 활성탄을 가하여 수득한 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단한 결과, 활성탄을 처리하지 않은 핵산 추출물을 제한효소로 절단한 경우에는 플라스미드 DNA 부분에 정상적으로 절단되지 않은 밴드가 나타났으나, 활성탄을 처리하여 수득한 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단한 경우에는 대부분의 플라스미드 DNA가 정상적으로 절단되었음을 확인할 수 있었는 바, 활성탄을 이용하여 분리정제한 고순도의 플라스미드 DNA는 실험결과의 오차를 감소시킬 수 있을 것으로 예측되었다.
본 발명에 따르면, 대장균의 배양에 따른 미니프렙(mini-prep) 뿐만 아니라, 미디프렙(midi-prep)과 맥스프렙(maxi-prep)까지 모든 배양수준에서 활성탄을 이용하여 순도가 향상된 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있다. 예를 들면, 대장균을 62, 125, 250 및 500ml씩 각각 배양하여 수득한 플라스미드 DNA에 활성탄을 208, 416, 833 및 1,666mg를 처리한 실험군과 활성탄을 처리하지 않은 실험군의 플라스 미드 DNA를 취하여 1% 아가로스젤에 전기영동한 결과, 미디프렙에 해당하는 62와 125ml 대장균 배양과 맥시프렙에 상응하는 250과 500ml 대장균 배양에서 수득한 플라스미드 DNA에 활성탄을 처리함으로써, 플라스미드 DNA 이외에 불순물인 핵산단편들이 제거되었음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 플라스미드 DNA의 분리정제시 형질전환체로부터 수득한 핵산 추출물에 활성탄을 처리하면, 활성탄에 의하여 상기 핵산 추출물로부터 플라스미드 DNA 이외의 RNA 및 DNA 핵산단편이 모두 제거되어, 고순도의 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있고, 이처럼 핵산단편이 제거되어 순도가 향상된 플라스미드 DNA를 이용하면, 실험상의 오차를 감소시킬 수 있을 것이다.
결국, 본 발명의 고순도의 플라스미드 DNA의 분리정제방법은, (ⅰ) 형질전환체로부터 핵산 추출물을 수득하는 공정; 및, (ⅱ) 상기 핵산 추출물에 활성탄을 가하고, 교반한 다음, 이를 원심분리하여 상층액을 수득하는 공정을 포함한다. 이때, 핵산 추출물의 수득은 특별히 이에 제한되지 않으나, 알칼리 용해(alkaline lysis) 방법에 의하여 수행됨이 바람직하고, 상기 활성탄은 특별히 이에 제한되지 않으나, 분말형태, 증류수에 현탁된 형태 등으로 핵산 추출물에 가함이 바람직하며, 활성탄의 처리량, 교반조건, 원심분리조건 등은 결코 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: RNase를 이용한 플라스미드 DNA의 분리정제
RNase를 처리하는 공지된 방법으로 플라스미드 DNA를 분리정제하였다(참조: Sambrook J and Russell DW, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001): 우선, pOTB7(1.8 kb)에 인간 인히빈 알파 유전자(1.4 kb)가 삽입되어 있고, EcoRI 절단부위가 1곳 존재하는 발현벡터 pOTB7-hInhα(4.2 kb)(제품번호 4126990, Invitrogen, USA)를 숙주세포인 대장균(EcoRI DH10B)(Invitrogen, USA)에 도입하여 형질전환체를 수득하였다(참조: 도 1a). 도 1a는 발현벡터 pOTB7-hInhibin α의 유전자 지도이다.
상기 형질전환체를 테트라사이클린이 함유된 500ml의 배지에서, 37℃, 180rpm으로 밤새 배양하였다. 대장균 수확 4시간 전 클로람페니콜을 배지 ㎖당 170㎍의 농도로 첨가하였다. 수확된 형질전환 대장균 세포에 10㎖ Sol I(50 mM glucose, 10mM EDTA, 25mM Tris-Cl(pH 8.0))을 가하여 현탁시키고, 라이소자임을 처리하였다. 이어, Sol II(0.2N NaOH, 1% SDS) 20㎖를 넣고 10분간 얼음 속에 방치한 다음, 15㎖ Sol III(5M potassium acetate(pH 4.8): 60ml potassium acetate + 11.5ml glacial acetic acid + 28.5ml H2O)를 가하고 10분간 얼음에 방치하였다. 그런 다음, 얼음에서 꺼내어 4℃, 8000rpm으로 30분간 원심분리하고, 상층액을 취하여 2배 부피의 에탄올을 가하였다. 얼음에 30분간 방치한 후, 4℃, 8,000rpm으로 30분간 원심분리한 다음, 70% 에탄올로 세척하고, 침전물을 건조시켜 핵산 추출물을 수득하였다.
상기 핵산 추출물을 적당량의 멸균증류수에 용해시키고, RNase(Ribonuclease A, USB Corp., USA)를 처리하여 실온에서 30분간 반응시킨 다음, 페놀-클로로포름을 처리하고, 12,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액과 동량의 클로로포름을 다시 가하고, 원심분리하여 상층액을 취하였다. 상층액의 1/10 부피의 3M 소듐아세테이트와 2배 부피의 에탄올을 가하여 얼음에 30분간 방치하였다. 침전이 생기면, 4℃, 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 70% 에탄올로 세척하고 플라스미드 DNA가 포함된 침전물을 건조시켰다. 건조시킨 침전물에 적당량의 TE 용액을 가하여, 플라스미드 DNA(+RNase)를 수득하였다.
상기에서 수득한 RNase를 처리하지 않은 핵산 추출물(-RNase) 및 상기 핵산 추출물에 RNase를 처리하여 정제한 플라스미드 DNA(+RNase)를, 각각 1% 아가로스젤에 전기영동하였다(참조: 도 1b). 도 1b는 RNase의 처리에 따른 핵산단편의 제거정도를 나타내는 전기영동사진으로, M은 DNA 분자량 마커를 나타낸다. 도 1b에서 보듯이, RNase를 처리하여 수득한 플라스미드 DNA(+RNase)는 RNase를 처리하지 않 은 핵산 추출물에 비하여 플라스미드 DNA 이외의 핵산단편의 농도가 크게 감소하기는 하였으나, 핵산단편이 완전히 제거되지는 않음을 알 수 있었다.
실시예 2: 활성탄을 이용한 플라스미드 DNA의 분리정제
실시예 2-1: 활성탄의 흡착능력조사
활성탄이 각종 오염물질을 제거할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 활성탄의 수성잉크 입자에 대한 흡착능력을 조사하였다. 수성잉크(Parker, USA) 10㎕에 증류수("DW"), 50% 에탄올(증류수 + 에탄올, "DW/EtOH") 및 TE 완충용액("TE") 990㎕를 각각 가하고, 5mg의 활성탄(activated charcoal, Sigma, USA)을 첨가한 후 교반하였다. 이를 각각 원심분리기(Eppendorf 5810R, Germany)에 넣은 다음, 6,000rpm으로 5분간 원심분리하여 활성탄을 침전시키고 상층액을 취하였다(참조: 도 2a). 도 2a는 잉크에 활성탄을 첨가한 경우, 용매에 따른 활성탄의 잉크입자 흡착정도를 나타내는 사진으로, 대조군("Cont.")은 활성탄을 첨가하지 않은 실험군을 나타낸다. 도 2a에서 보듯이, 활성탄을 처리하지 않은 대조군(Cont.)에 비하여 활성탄을 처리한 실험군들은 잉크의 염료입자들이 제거되었으나, 50% 에탄올 용액에서는 잉크염료 제거효과가 반감됨을 알 수 있었다.
이러한 활성탄의 핵산단편에 대한 흡착능력을 조사하기 위하여, RNase를 처리하지 않는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 취한 시료 각 1, 2, 4, 8㎍에, 5mg의 활성탄을 처리하거나 또는 처리하지 않고, 1% 아가로스겔에 전기영동하였다(참조: 도 2b). 도 2b는 활성탄의 처리에 따른 핵산단편의 제거정도를 나타내는 전기영동사진으로서, 활성탄은 1mg 당 멸균증류수 10㎕에 현탁시켜서 사용하였다. 도 2b에서 보듯이, 활성탄을 처리하지 않은 실험군에는 핵산단편이 같이 존재하지만, 활성탄을 처리한 플라스미드 DNA에는 핵산단편이 존재하지 않았는 바, 활성탄이 핵산단편을 흡착하여 제거함을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 활성탄 처리량과 분할 반복처리 효과의 조사
활성탄의 처리량에 대한 플라스미드 DNA이외의 핵산단편 제거효과를 조사하기 위하여, RNase를 처리하지 않는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 미니프렙(mini-prep)에 해당하는 1.5㎖ 대장균 배양액에서 RNase를 처리하지 않은 핵산 추출물을 수득하고, 이에 활성탄 0, 1.25, 2.5 및 5mg를 가하여 교반하였으며, 이를 원심분리하여 활성탄을 침전시킨 다음, 이로부터 상층액을 취하여 1% 아가로스젤에 전기영동하였다(참조: 도 3a).
도 3a는, 활성탄의 처리량에 따른 핵산단편의 농도를 나타내는 전기영동사진이다. 도 3a에서 보듯이, 활성탄 처리량이 증가할수록 플라스미드 DNA이외의 약 100bp 이하의 크기를 갖는 핵산단편의 농도는 감소하였는 바, 상기 핵산단편이 활성탄 처리량에 비례하여 제거됨을 알 수 있었다.
활성탄의 처리 총량을 동일하게 하면서도 이를 분할 반복할 경우, 보다 향상된 효과(분할 반복처리 효과)를 나타내는지를 조사하기 위하여, 상기 수득한 핵산 추출물 5ug에 활성탄 5mg를 1회, 2.5mg은 2회 및 1.25mg은 4회 첨가하여 교반하였으며, 이를 원심분리하여 활성탄을 침전시킨 다음, 이로부터 상층액을 취하여 1% 아가로스젤에 전기영동하였다(참조: 도 3b). 도 3b는 활성탄을 분할 반복처리한 플라스미드 DNA의 전기영동사진으로서, 1번 레인은 마커를 나타내고, 2번 레인은 대조군으로서 활성탄을 처리하지 않은 플라스미드 DNA를 나타내며, 3번 레인은 활성탄 5mg를 1회 첨가한 실험군을 나타내고, 4번 레인은 활성탄 2.5mg을 2회 첨가한 실험군을 나타내며, 5번 레인은 활성탄 1.25mg을 4회 첨가한 실험군을 나타낸다. 도 3b에서 보듯이, 활성탄의 처리 총량이 동일한 경우에는, 분할 반복한다 하여도 핵산단편의 제거 효과면에서 별다른 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었다.
결과적으로, 플라스미드 DNA와 핵산단편을 포함하는 핵산 추출물에 활성탄을 처리하였을 경우, 약 100bp 이하의 크기를 갖는 핵산단편들 만이 활성탄의 농도의존적으로 제거되며, 처리 횟수보다는 처리 총량에 의하여 핵산단편들이 제거됨을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 핵산 분자량에 따른 활성탄의 흡착효과
활성탄의 핵산단편의 분자량에 따른 흡착효과를 조사하기 위하여, 10 내지 1000bp 크기의 다양한 핵산단편을 포함하는 DNA 래더(ladder)(Promega, USA) 15㎕을 포함하는 용액에 활성탄 0, 1.25, 2.5 또는 5mg를 각각 처리한 후, 교반하고 원심분리하여 활성탄을 침전시켰다. 그런 다음, 상층액을 취하여, 1% 아가로스젤에 전기영동하였다(참조: 도 4). 도 4는 활성탄의 처리량에 따른 핵산단편의 제거효과를 나타내는 전기영동사진이다. 도 4에서 보듯이, 활성탄의 처리량이 증가되어도 500bp 이하의 핵산단편만이 제거될 뿐, 1000bp의 크기를 갖는 핵산단편은 활성탄을 처리하더라도 제거되지 않았는 바, 일정 크기 이상의 핵산단편은 활성탄에 의하여 제거되지 않음을 알 수 있었다.
실시예 2-4: 활성탄 처리에 의한 플라스미드 DNA 양의 변화
RNase를 처리하지 않는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 1.5㎖ 대장균 배양액(Mini-preparation)에서 RNase를 처리하지 않은 핵산 추출물을 수득하고, 이에 활성탄 5mg을 가하여 교반하였으며, 이를 원심분리하여 활성탄을 침전시킨 다음, 이로부터 수득한 상층액과 상기 핵산 추출물을 1% 아가로스젤에 전기영동하였다. 또한, 상기 핵산 추출물과 상층액을 자외선 분광도계(Ultrospec, Pharmacia Biotech, England)에 적용하여 이들의 흡광도(A260/280)를 측정하고, 상기 전기영동한 겔을 화상분석기(Image Station 4000MM, Kodak, USA)에 적용하여, 상기 핵산 추출물 및 상층액에 포함된 플라스미드 DNA와 핵산단편을 각각 정량하였다(참 조: 도 5a 내지 5d).
도 5a는 활성탄의 첨가유무에 따른 핵산단편의 농도를 나타내는 전기영동사진이고, 도 5b는 활성탄 첨가 전후의 플라스미드 DNA의 흡광도에 따라 추정한 핵산총량을 나타내는 그래프이며, 도 5c는 화상분석기를 이용하여 측정한 플라스미드 DNA의 양을 나타내는 그래프이고, 도 5d는 화상분석기를 이용하여 측정한 핵산단편의 양을 나타내는 그래프로서, 각 도에 표시된 "+활성탄"은 상기 상층액을 의미하고, "-활성탄"은 상기 핵산 추출물을 의미한다. 도 5a에서 보듯이, 활성탄을 가하지 않은 경우에는, 핵산 추출물에 플라스미드 DNA와 핵산단편이 함께 존재하였으나, 활성탄을 첨가한 경우에는, 플라스미드 DNA에 핵산단편이 거의 존재하지 않았고, 도 5b에서 보듯이, 흡광도를 이용하여 전체 DNA의 양을 예측한 경우, 활성탄을 첨가하지 않았을 때 핵산 총량은 59.6 ± 4.73 ug이였고, 활성탄을 첨가하였을 때 핵산 총량은 41.0 ± 1.98 ug이었다. 또한, 도 5c에서 보듯이, 플라스미드 DNA의 농도는 활성탄의 처리여부와 관련성이 없었으나, 도 5d에서 보듯이 핵산단편의 농도는 활성탄을 처리할 경우에 현저하게 감소하였다.
상기 결과로부터, 활성탄 첨가한 후의 핵산 총량의 변화는 활성탄에 의한 핵산단편의 제거에 기인한 것임을 알 수 있었다.
아울러, 상기 도 5d의 결과를 도 1에 도시된 RNase를 처리한 결과와 비교하면, 도 1에서 RNase를 처리한 경우 약 50%의 핵산단편이 제거된 것에 비하여, 활성탄을 처리한 경우에는 약 90%의 핵산단편이 제거되었으므로, 활성탄을 처리한 경우 에 플라스미드 DNA의 순도를 더욱 향상시킬 수 있었는 바, 이는 RNase는 RNA 핵산단편만을 제거할 수 있는 반면, 활성탄은 RNA 핵산단편과 DNA 핵산단편을 모두 제거할 수 있기 때문인 것으로 분석되었다.
실시예 2-5: 활성탄 처리가 제한효소 작용에 미치는 효과
대장균에서 수득한 약 5ug(5ug/ul)의 핵산 추출물에 활성탄을 처리하지 않은 실험군과 활성탄(5mg)을 처리한 실험군을 각각 준비하고, 이들 각 실험군에 BSA 1㎕, 10× 반응완충용액 1㎕, EcoRI 0.5㎕와 멸균증류수 2.5㎕를 가하여, 37℃에서 10분간 반응시킨 다음, 이를 0.7% 아가로스젤에 전기영동하였다(참조: 도 6).
도 6은 활성탄의 처리여부에 따른, 제한효소로서 플라스미드 DNA를 절단한 정도를 나타내는 전기영동사진으로서, 대조군으로는 활성탄과 제한효소(EcoRI)를 처리하지 않은 핵산 추출물을 사용하였다. 도 6에서 보듯이, 활성탄을 처리하지 않은 핵산 추출물을 제한효소로 절단한 경우에는, 플라스미드 DNA 부분에 정상적으로 절단되지 않은 밴드가 일부 나타났으나, 활성탄을 처리하여 수득한 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단한 경우에는, 대부분의 플라스미드 DNA가 정상적으로 절단되었음을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 활성탄을 처리하지 않은 핵산 추출물에 포함된 핵산단편이 제한효소의 반응에 간섭하여 나타난 것이라 분석되었다.
실시예 2-6: 대량의 플라스미드 DNA에 대한 활성탄 처리효과
대장균을 62, 125, 250 및 500ml씩 각각 배양하여 수득한 플라스미드 DNA에 활성탄을 208, 416, 833 및 1,666mg를 처리한 실험군과 활성탄을 처리하지 않은 실험군의 플라스미드 DNA를 취하여 1% 아가로스젤에 전기영동하였다(참조: 도 7). 도 7에서 보듯이, 미디프렙(midi-prep)에 해당하는 62와 125ml 대장균 배양과 맥시프렙(maxi-prep)에 상응하는 250과 500ml 대장균 배양에서 수득한 플라스미드 DNA에 활성탄 처리를 함으로써, 플라스미드 DNA 이외에 불순물인 핵산단편들이 제거되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법에 따르면, 대장균의 배양에 따른 미니프렙(mini-prep) 뿐만 아니라, 미디프렙(midi-prep)과 맥스프렙(maxi-prep)까지 모든 배양수준에서 활성탄을 이용하여 순도가 향상된 플라스미드 DNA를 분리정제할 수 있어서, 유전자 치료 및 백신 등 의약품의 개발 및 생산에 널리 이용할 수 있을 것이다.
도 1a는 발현벡터 pOTB7-hInhα의 유전자 지도이다.
도 1b는 RNase의 처리에 따른 핵산단편의 제거정도를 나타내는 전기영동사진이다.
도 2a는 잉크에 활성탄을 첨가한 경우, 용매에 따른 활성탄의 잉크입자 흡착정도를 나타내는 사진이다.
도 2b는 활성탄의 처리에 따른 핵산단편의 제거정도를 나타내는 전기영동사진이다.
도 3a는 활성탄의 처리량에 따른 핵산단편의 농도를 나타내는 전기영동사진이다.
도 3b는 활성탄을 분할 반복처리한 플라스미드 DNA의 전기영동사진이다.
도 4는 활성탄의 처리량에 따른 핵산단편의 제거효과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5a는 활성탄의 첨가유무에 따른 핵산단편의 농도를 나타내는 전기영동사진이다.
도 5b는 활성탄을 가하기 전후의 플라스미드 DNA의 흡광도에 따라 추정한 핵산총량을 나타내는 그래프이다.
도 5c는 화상분석기를 이용하여 측정한 플라스미드 DNA의 양을 나타내는 그래프이다
도 5d는 화상분석기를 이용하여 측정한 핵산단편의 양을 나타내는 그래프이 다.
도 6은 활성탄의 처리여부에 따른, 제한효소로서 플라스미드 DNA를 절단한 정도를 나타내는 전기영동사진이다.
도 7은 대장균의 배양액 증가에 따른 활성탄 처리에 의한 핵산단편 제거효과를 나타내는 전기영동사진이다.

Claims (6)

  1. (ⅰ) 형질전환체로부터 핵산 추출물을 수득하는 공정; 및,
    (ⅱ) 상기 핵산 추출물에 활성탄을 가하고, 교반한 다음, 이를 원심분리하여 얻은 상층액으로 부터 플라스미드 DNA를 수득하는 공정을 포함하는, 고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    형질전환체는 분리정제하고자 하는 플라스미드 DNA에 의하여 숙주세포가 형질전환된 것인 것을 특징으로 하는
    고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는
    고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    핵산 추출물은 알칼리 용해(alkaline lysis) 방법에 의하여 수득되는 것을 특징으로 하는
    고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    활성탄은 분말형태 또는 증류수에 현탁된 형태로 핵산 추출물에 가하는 것을 특징으로 하는
    고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    핵산 추출물에 활성탄을 가함으로써, 500bp 이하의 핵산단편만을 제거하는 것을 특징으로 하는
    고순도 플라스미드 DNA를 분리정제하는 방법.
KR1020090028765A 2008-05-30 2009-04-03 활성탄을 이용한 고순도 플라스미드 ｄｎａ의 분리정제방법 KR101106969B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20080051261 2008-05-30
KR1020080051261 2008-05-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090124923A true KR20090124923A (ko) 2009-12-03
KR101106969B1 KR101106969B1 (ko) 2012-01-20

Family

ID=41686774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090028765A KR101106969B1 (ko) 2008-05-30 2009-04-03 활성탄을 이용한 고순도 플라스미드 ｄｎａ의 분리정제방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101106969B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110201085A1 (en) * 2010-02-16 2011-08-18 Phthisis Diagnostics Corporation Nucleic acid extraction from complex matrices
KR101380909B1 (ko) * 2013-03-20 2014-04-01 한국생명공학연구원 핵산 정제용 흡착제 및 그 흡착제를 이용한 정제방법
GB2537442A (en) * 2014-10-28 2016-10-19 Bisn Laboratory Services Ltd Molecular and bioinformatics methods for direct sequencing
US11865480B2 (en) 2019-05-07 2024-01-09 Electronics and Telecommunications Research Institute Cancer Rop Co., Ltd. Nucleic acid purification device and nucleic acid purification method

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3940935B2 (ja) * 1996-06-11 2007-07-04 東洋紡績株式会社 プラスミドｄｎａの抽出精製方法
KR20020059286A (ko) * 2002-06-11 2002-07-12 (주) 인더씨 코리아 규산염 광분을 이용한 플라스미드 디엔에이 추출 방법 및추출 키트
KR100829086B1 (ko) * 2002-08-19 2008-05-16 코오롱생명과학 주식회사 히아루론산 및 그의 염 정제방법
US20060281075A1 (en) * 2004-12-22 2006-12-14 Large Scale Biology Corporation Purification of viruses, proteins and nucleic acids

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110201085A1 (en) * 2010-02-16 2011-08-18 Phthisis Diagnostics Corporation Nucleic acid extraction from complex matrices
US8574890B2 (en) * 2010-02-16 2013-11-05 Phthisis Diagnostics Corporation Nucleic acid extraction from complex matrices
KR101380909B1 (ko) * 2013-03-20 2014-04-01 한국생명공학연구원 핵산 정제용 흡착제 및 그 흡착제를 이용한 정제방법
GB2537442A (en) * 2014-10-28 2016-10-19 Bisn Laboratory Services Ltd Molecular and bioinformatics methods for direct sequencing
US11865480B2 (en) 2019-05-07 2024-01-09 Electronics and Telecommunications Research Institute Cancer Rop Co., Ltd. Nucleic acid purification device and nucleic acid purification method

Also Published As

Publication number Publication date
KR101106969B1 (ko) 2012-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210230578A1 (en) Removal of dna fragments in mrna production process
Ooi et al. Regulation of host RNA levels during baculovirus infection
ES2950788T3 (es) Procedimiento para el aislamiento de ácidos nucleicos
Morin et al. An efficient DNA isolation protocol for filamentous cyanobacteria of the genus Arthrospira
KR101641113B1 (ko) Ｒｎａ 추출용 용액
KR101106969B1 (ko) 활성탄을 이용한 고순도 플라스미드 ｄｎａ의 분리정제방법
WO2012155577A1 (zh) 从生物材料中分离纯化rna的方法
Maurya et al. Evaluation of salt-out method for the isolation of DNA from whole blood: a pathological approach of DNA based diagnosis
Balijja et al. A non-phenol–chloroform extraction of double-stranded RNA from plant and fungal tissues
Bharudin et al. COMPARISON OF RNA EXTRACTION METHODS FOR TRANSCRIPT ANALYSIS FROM THE PSYCHROPHILIC YEAST, Glaciozyma antarctica.
US10323241B2 (en) Method for recovering short-chain nucleic acids
US20210207125A1 (en) Method of isolating nucleic acids for long sequencing reads
KR101380909B1 (ko) 핵산 정제용 흡착제 및 그 흡착제를 이용한 정제방법
Khatami et al. Magnetic nanoparticles: a promising component in RNA extraction process
CN113621608B (zh) 一种提取细菌质粒dna的菌体裂解液、试剂盒及方法
EP2196537A1 (en) Method for synthesis of single- or double-stranded dna, and kit for the synthesis
CN116510001B (zh) 一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法
WO2008150187A1 (fr) Utilisation du trichloracétate d'ammonium en tant que produit de dissociation de complexes naturels d'acides nucléiques et procédé d'extraction d'arn
KR102587121B1 (ko) Rna 분리용 조성물
KR20120129693A (ko) 미세조류로부터 ｄｎａ를 효율적으로 추출하는 방법
KR20010034995A (ko) 개질된 수정미세섬유막 및 그 이용
CN118165982A (zh) Rna快速提取试剂盒及其应用
JP2004105009A (ja) テトラフェニルホウ素化合物から成る核酸分離用試薬とそれを用いる核酸分離方法
CN114958610A (zh) 苯乳酸在制备酵母菌裂解液中的应用、试剂盒及方法
CN116926149A (zh) dsRNA的制备方法及其在制备dsRNA标准品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141223

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151006

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161205

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180110

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190102

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191203

Year of fee payment: 9