KR100829086B1 - 히아루론산 및 그의 염 정제방법 - Google Patents

히아루론산 및 그의 염 정제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히아루론산 및 그의 염 정제방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 히아루론산 생산 균주의 배양액으로부터 히아루론산 또는 그 염을 정제하는 방법에 있어서, 히아루론산 생산 균주의 배양액에 방향족 흡착수지를 가하여 불순물을 흡착시키고, 이를 제거하는 것을 특징으로 하는 정제방법에 관한 것으로, 본 발명으로 발열성물질, 단백질, 핵산 및 금속성 불순물을 매우 효율적으로 제거할 수 있으며, 수회 반복되는 유기용매 침전 횟수를 최소화하여 간편하고 경제적인 정제공정으로 고순도의 히아루론산을 제조할 수 있다.
히아루론산, 정제, 방향족계 흡착수지

Description

히아루론산 및 그의 염 정제방법{PURIFICATION METHOD OF HYALURONIC ACID OR SALT THEREOF}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 히아루론산 및 그의 염 정제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히아루론산 생산 균주의 배양액에 방향족계 흡착수지를 처리하여 히아루론산 또는 그의 염을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
히아루론산(Hyaluronic acid)은 분자량이 50,000 내지 13,000,000 Da에 이르는 무색의 고점도 다당류로, 반복단위인 글루쿠론산과 N-아세틸 글루코즈아민이 (1-3)과 (1-4)로 번갈아 결합되어 있다. 히아루론산은 보습효과를 가지며, 물리적 마찰에 대한 윤활효과 및 세균 등의 침입에 대한 보호효과가 우수하여 화장품 첨가제, 관절염치료제, 안과수술용 수술보조제 및 외과수술후의 유착저해제 등으로 광범위하게 사용된다. 이러한 히아루론산은 소의 안구, 닭벼슬, 동물의 완충조직, 태반, 암세포 및 피부 등에 다량 함유되어 있다.
히아루론산의 수득방법은 상기에서 언급한 생체조직으로부터 추출하거나(미 국특허 4,141,973 및 미국특허 4,303,676), 미생물을 발효시켜 발효산물로서 회수하는 방법이 있다. 그러나, 추출방법에 의하여 수득한 히아루론산에는 콘드로이친 설페이트, 글리코사미노 글리간설페이드 등의 불순물이 섞여 있어 이들을 제거하기 위한 복잡한 정제과정이 요구될 뿐만 아니라 그에 따른 고가의 비용으로 대량생산하기 어렵다. 반면에 미생물을 이용한 히아루론산의 생산은 상대적으로 생산비용이 적게 들고, 고분자량의 히아루론산을 비교적 간단한 방법으로 수득할 수 있다(일본특허공개 58-056692 및 미국특허86-00066).
미생물을 이용한 히아루론산 생산방법에서, 히아루론산의 분리 및 정제방법에 관한 공지기술은 하기와 같다.
미국특허 제 4,157,296호는 스트렙토코커스 파이오젠 배양액에 트리클로로 아세트산을 처리하여 균주를 제거한 다음 유기용매를 이용한 침전방법을 통하여 히아루론산을 정제하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 유기용매를 이용한 침전방법은 수회의 반복적인 실시가 요구되므로, 상대적으로 많은 비용과 시간이 소모되는 단점이 있다.
미국특허 제 4,782,046호에서는 스트렙토코커스 이퀴 배양액에 0.01% 음이온 계면활성제인 라우릴 황산염을 넣어 세표벽에 붙은 히아루론산을 분리시킨 후 비이온 계면활성제인 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드를 넣어 히아루론산 침전물을 만든 다음 알콜 침전과정을 통한 정제과정을 언급하고 있다.
미국특허 제 4,784,990호에서는 스트렙토코커스 주에피데미쿠스 배양액에 에탄올을 첨가하여 미생물로부터 히아루론산을 분리시킨 후 염화세틸 피리디늄 침전 과정을 통한 정제과정을 언급하고 있다.
일본특허공개 63-012293호에서는 히아루론산을 함유하는 용액을 마크로레티큘라 음이온 교환수지(Dianion HPA-25, HPA-75, IRA-900, IRA-904)로 처리하여 분자량이 1,500,000 Da 이하의 저분자량 히아루론산과 발열성물질을 제거하는 방법을 언급하고 있다.
일본특허공개 13-131503호에서는 히아루론산 함유액을 알루미나 또는 실리카겔 등으로 처리하여 발열성물질, 단백질, 핵산, 금속 불순물 등을 제거하고, 유기용매 침전을 통한 히아루론산을 정제방법을 언급하고 있다.
일본특허공개 06-199656호에서는 히아루론산을 함유하는 용액을 pH6 내지 10의 용액상에서 대전시킨 멤브레인 필터를 통과시켜 발열성물질을 제거하고, 알콜침전을 통한 히아루론산 정제방법이 언급되어 있다.
대한민국 특허공개 1994-2478호에서는 히아루론산 생산균주 배양액에 아연 알루미네이트 분말을 가하여 히아루론산을 정제하는 방법을 언급하고 있다.
또한 대한민국 특허공개 1997-42603호에서는 히아루론산을 함유하는 용액에 소수성 폴리머(폴리 에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리스틸렌)로 처리한 다음 활성 알루미나를 첨가하여 알콜침전을 통한 히아루론산 정제방법을 언급하고 있다.
상기에 열거한 방법들은 처리과정이 복잡하여 생산원가를 상승시키는 요인으로 작용할 뿐만 아니라, 발열성물질, 단백질 및 핵산 등의 불순물을 완전히 제거하기 어려운 실정이다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 히아루론산을 고순도로 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 히아루론산 생산 균주의 배양액으로부터 간편하고, 경제적으로 히아루론산 또는 그의 염을 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 히아루론산 생산 균주의 배양액으로부터 히아루론산 또는 그 염을 정제하는 방법에 있어서, 히아루론산 생산 균주의 배양액에 방향족 흡착수지를 가하고, 불순물을 흡착시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 정제방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 히아루론산 정제방법은 히아루론산 생산 균주의 배양액에 방향족계 흡착수지를 가하고 이를 여과하는 것을 특징으로 한다.
방향족계 흡착수지는 미츄비시(Mitsubishi)사의 스티렌 디비닐벤조 타입을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 HP10, HP20, HP21, HP30, SP800, SP825, SP850, SP875, SP205, SP206 및 SP207로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 HP20 및 SP207이 좋다.
히아루론산 생산 균주는 통상의 대사산물로 히아루로산을 생산하는 균주를 모두 사용할 수 있으며, 대표적인 것으로 스트렙토코커스 속 미생물을 들 수 있다. 스트렙토코커스 속 미생물로는 스트렙토코커스 파이오제넥스, 스트렙토코커스 패칼리스, 스트렙토코커스 디스갈락티에, 스트렙토코커스 주에피데미쿠르, 스트렙토코 커스 이퀴, 스트렙토코커스 이퀴시밀리스 및 스트렙토코커스 에스피 KL0188(KCTC10248BP)가 있다.
본 발명의 히아루론산 생산 균주는 통상적인 배양방법으로 배양하여 히아루론산을 포함하는 배양액을 제조할 수 있다.
보다 구체적인 히아루로산 또는 그의 염 정제방법은 (a) 히아루론산 생산 균주 배양액내의 균체를 제거하는 단계, (b) 상기 균체가 제거된 배양액에 활성탄을 가하고 교반한 다음 활성탄을 제거하여 히아루론산 수용액을 제조하는 단계, (c) 상기 히아루론산 수용액에 방향족계 흡착수지를 가하여 교반한 다음 흡착수지를 제거하여 히아루론산 수용액을 제조하는 단계 및 (d) 상기 히아루론산 수용액에 유기용매를 가하여 히아루론산 또는 그의 염을 침전시키고, 이를 건조시키는 단계를 포함한다. 또한 본 발명의 히아루론산 또는 그의 염 정제방법은 상기 (b) 단계를 (c) 단계 이후에 실시할 수도 있다.
상기 (a) 단계에서 균체는 원심분리 또는 여과방법에 의하여 제거할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 활성탄은 배양액에 NaCl을 가한 후 첨가할 수 있으며, 이때 활성탄은 0.1 내지 10 중량%로 첨가할 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 히아루론산 수용액의 pH를 7.5 내지 8.5로 적정한 다음 실시하는 것이 바람직하며, 방향족 흡착수지는 0.1 내지 10 중량%로 첨가하는 것이 좋다. 또한 방향족 흡착수지를 가한 다음 4 내지 10 ℃에서 교반하여 발열성 물질을 흡착시킬 수 있다.
상기 (d) 단계에서는 통상적인 유기용매 침전법으로 히아루론산 또는 그의 염을 수득할 수 있다. 상기 유기용매는 수용성 유기용매로 아세톤, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 에탄올이다. (d) 단계에서는 히아루론산 수용액에 0.5 내지 3 M 농도의 NaCl을 첨가한 다음 수용성 유기용매를 1 내지 5 부피배로 첨가하여 침전된 히아루론산 또는 그의 염을 수득할 수 있다.
본 발명의 정제방법은 미생물을 이용한 히아루론산 생산시 적용되던 종래의 기술에 비하여 발열성물질, 단백질, 핵산 및 금속성 불순물을 매우 효율적으로 제거할 수 있으며, 수회 반복되는 유기용매 침전 횟수를 최소화하여 간편하고 경제적인 정제공정으로 고순도의 히아루론산을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 정제방법으로 정제된 히아루론산은 99.9%의 고순도를 가져, 화장품 또는 의약적인 용도로 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 방향족계 흡착수지 SP207를 이용한 히알루론산 정제
(1) 히아루론산 생산균주의 배양액 준비
스트렙토코커스 에스피 KL0188(기탁번호 KCTC10248BP)은 100 ml의 토드-휴이트 배지에 접종하고, 35 ℃로 대수기까지 배양하여 이를 1차 종 배양액으로 사용하였다. 1차 종배양액은 1 L의 트립틱 소이 브로스(Difco, USA)에 접종하고, 35 ℃로 대수기까지 배양하여 2차 종 배양액으로 준비하였다.
30 L 발효조에 60 g/L의 글루코즈, 5 g/L의 이스트엑기스, 17 g/L의 카제인 펩톤, 7 g/L의 글루탐산, 0.7 g/L의 황산마그네슘, 2.5 g/L의 인산제이칼륨 및 5.0 g/L의 염화나트륨을 포함하는 히아루론산 생산용 배지 20 L를 넣어 멸균하고, 2차 종배양액 1000 ml을 접종하였다. 배양액의 pH는 6.95 내지 7.05, 온도는 35 ℃, 20 시간 배양하였다.
(2) 배양액내 균체 제거
히아루론산 배양액을 히아루론산의 농도가 0.1 내지 0.2 %가 되도록 희석한 후, 0.02 %의 라울릴 황산염 및 0.05 %의 포르말린 용액을 가하여 3시간 동안 교반하여 균체표면의 히아루론산을 분리시키고, 균체를 불활화 하였다. 이후 희석액은 원심분리 또는 여과하여 균체를 제거하고, 히아루론산 수용액을 준비하였다.
(3) SP207 수지처리단계
히아루론산 수용액의 pH를 7.5 내지 8.5로 적정하고, 방향족계 흡착수지로 SP207을 3 % 가한 다음 4 내지 10 ℃에서 3시간 동안 교반하면서 발열성 물질을 흡착시켰다. 이후 흡착수지처리액을 여과하여 흡착수지가 제거된 히아루론산 수용액을 수득하였다.
(4) 활성탄 처리
히아루론산 상청액에 NaCl을 0.9 %로 가하고, 활성탄을 3 % 첨가한 다음 2시간 동안 교반하여 단백질 및 핵산 등을 활성탄에 흡착시켰다. 상기의 활성탄 처리액은 여과하여 활성탄이 제거된 히아루론산 수용액을 수득하였다.
(5) 에탄올 침전
히아루론산 수용액에 1 M 농도로 NaCl을 첨가하고, 0.2 um의 여과지로 여과하였다. 이후 1.5 내지 3배의 부피의 에탄올을 가하여 히아루론산 나트륨을 침전시킨 후 70 % 에탄올로 수회 세척하였다. 침전물은 멸균된 조건하에서 건조시켜 히아루론산 나트륨을 수득하였다.
실시예 2: 방향족계 흡작수지 HP20을 이용한 히아루론산 정제
실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였고, 흡착수지로 HP20을 사용하여 히아루론산 나트륨을 정제하였다.
실시예 3: 활성탄 처리 후 방향족계 흡착수지 SP207를 이용한 히아루론산 정제
실시예 1과 동일한 방법으로 실시하여 히아루론산 나트륨을 정제하였다. 다만, 활성탄 처리후 SP207을 흡착시키는 과정으로 진행하였다.
실시예 4: 활성탄 처리 후 방향족계 흡작수지 HP20을 이용한 히아루론산 정제
실시예 2와 동일한 방법으로 실시하여 히아루론산 나트륨을 정제하였다. 다만, 활성탄 처리후 HP20을 흡착시키는 과정으로 진행하였다.
실시예 5 : SP207을 이용한 히아루론산 정제
실시예 1과 동일하게 실시하였으며 다만 히아루론산 생산균주로 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(KCTC 3318)를 사용하였다.
비교예
실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였고, 방향족 수지를 이용한 흡착단계를 생략하였다.
실험예: 히아루론산 정제수율 측정
실시예 1 내지 5 및 비교예의 방법으로 정제한 히아루론산 나트륨의 순도를 측정하였다.
히아루론산 수율: 변형된 카르바솔 방법으로 정량하여 초기의 부피와 최종부피를 비교하였다
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 비교예
수율 78 % 80 % 82 % 79 % 78% 79%
발열성물질 측정: 히아루론산 나트륨을 1.5 g/L가 되도록 발열성물질 함량이 0.001 EU/ml 이하인 물에 용해시킨 후, 찰스 리버 엔도세이프(Charles River Endosafe)의 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시약을 사용하여, 첨부된 매뉴얼에 따라 분석하였다. 분석치는 히아루론산염 1 mg 당 존재하는 엔도톡신단위(EU)로 나타내었다.
순도시험: 변형된 카르바솔 방법(Anal. Biochem., 4,330 1962))
단백질함량: 로리(Lowry)법
핵산함량: 히아루론산 나트륨을 생리식염수에 1 %로 용해시킨 다음 260 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
상기 각 측정결과는 하기 표 2에 기재하였다.
측정항목 측정결과
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 비교예
순도(%) 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 95
발열성물질(EU/mg) < 0.005 < 0.005 < 0.005 < 0.005 < 0.005 0.1
단백질(%) < 0.01 % < 0.01 % < 0.01 % < 0.01 % < 0.01 % 0.2
핵산 ND ND ND ND ND 0.1 %
분자량(백만 Da) 5.3 5.2 5.5 5.4 2.5 5.4
금속이온 철(ppm) < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm
납(ppm) < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm
비소(ppm) < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm < 1 ppm
표 2에서, 실시예 1 내지 실시예 5에서 정제된 히아루론산 나트륨은 순도가 99.9%로 높은 것으로 확인되었으나, 비교예의 경우 순도가 95% 수준에 머물렀다. 그 외 발열성물질, 단백질 및 핵산의 함량 역시 실시예 1 내지 실시예 5의 히아루론산 나트륨이 비교예에 비하여 월등히 낮은 것으로 측정되었다.
본 발명의 정제방법은 히아루론산 생산 균주의 배양액에 방향족계 흡착수지를 가하여 발열성물질, 단백질, 핵산 및 금속성 불순물을 매우 효율적으로 제거할 수 있으며, 수회 반복되는 유기용매 침전 횟수를 최소화하여 간편하고 경제적인 정제공정으로 고순도의 히아루론산을 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명의 정제방법으로 정제된 히아루론산은 99.9%의 고순도를 가져, 화장품 또는 의약적인 용도로 사용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 히아루론산을 생산하는 스트렙토코커스 속 균주의 배양액으로부터 히아루론산 또는 그 염을 정제하는 방법에 있어서,
    상기 균주의 배양액에 방향족 흡착수지를 가하고, 불순물을 흡착시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 정제방법은
    (a) 상기 스트렙토코커스 속 균주 배양액내의 균체를 제거하는 단계;
    (b) 상기 균체가 제거된 배양액에 활성탄을 가하고 교반한 다음 활성탄을 제거하여 히아루론산 수용액을 제조하는 단계;
    (c) 상기 히아루론산 수용액에 방향족계 흡착수지를 가하여 교반한 다음 흡착수지를 제거하여 히아루론산 수용액을 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 히아루론산 수용액에 유기용매를 가하여 히아루론산 또는 그의 염을 침전시키고, 이를 건조시키는 단계
    를 포함하는 것인 정제방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 정제방법은
    (a) 상기 스트렙토코커스 속 균주 배양액내의 균체를 제거하는 단계;
    (b) 상기 균체가 제거된 배양액에 방향족계 흡착수지를 가하여 교반한 다음 흡착수지를 제거하여 히아루론산 수용액을 제조하는 단계;
    (c) 상기 히아루론산 수용액에 활성탄을 가하고 교반한 다음 활성탄을 제거하여 히아루론산 수용액을 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 히아루론산 수용액에 유기용매를 가하여 히아루론산 또는 그의 염을 침전시키고, 이를 건조시키는 단계
    를 포함하는 것인 정제방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 스트렙토코커스 파이오제넥스, 스트렙토코커스 패칼리스, 스트렙토코커스 디스갈락티에, 스트렙토코커스 주에피데미쿠스, 스트렙토코커스 이퀴, 스트렙토코커스 이퀴시밀리스 또는 스트렙토코커스 에스피인 방법.
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