JP3989865B2 - クロレラ培養によるヒアルロン酸及びキチンの製造法 - Google Patents
クロレラ培養によるヒアルロン酸及びキチンの製造法 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロレラ培養によるヒアルロン酸及びキチンの同時製造方法と、これに用いられる新規なクロロウィルス(クロレラウィルス)に関する。
【0002】
【従来の技術】
ヒアルロン酸は、その多糖類特性のため、人工皮膚、関節潤滑液、眼科治療剤、化粧品、再生医療などの用途で市場は伸びており(国内:約5T/年)、更なる用途開発も行われている。
ヒアルロン酸の製造方法としては、ニワトリ鶏冠などから抽出して生産する方法、微生物培養によって生産する方法などが知られている。しかし、前者は原料確保の不安定性、生産工程の複雑さ、コストなどの問題がある。また、近年は微生物(乳酸菌等)培養による生産が多くなっていると言われているが、生産コストなどで問題が残っているのも事実である。
更に、クロレラがヒアルロン酸を生産すると言う報告も見られるが、実用化には至っていない(例えば、非特許文献1、非特許文献2参照。)。
キチンは、人工皮膚、手術縫合糸、生分解性プラスチック原料、繊維、機能性食品、キチン分解物としてグルコサミンの調味剤、化粧品素材、変形性関節炎剤等の用途が知られているが、エビ・カニの甲殻を化学的に処理し抽出して生産される(国内:約2000t/年:キチン・キトサン含む)。しかし、原料確保の不安定性、生産工程の複雑さ、コストなどに問題点がある。
また本発明者らはクロロウイルスであるCVK2がキチンシンターゼ遺伝子(chs)を有していることを先に見出し、更に、生成されたキチンを回収しその物性を解析した(非特許文献3参照。)。
現在行われているいずれの多糖類の製造方法も、原料を天然資源の廃棄物に求める限りは、原料確保の不安定性などによる数量並びに品質のバラツキに問題が残る。特に、化粧品、医療用材料として使用される場合には品質上の問題が大きい。また、微生物(乳酸菌等)培養によるヒアルロン酸製造方法の研究開発も盛んに行われているが、更なる技術開発が望まれている。
一方、クロレラを利用した各多糖類の生産はいずれもまだ実用化されるまでには至っていない。
【0003】
【非特許文献1】
DeAngelis P.:Science 278,1899−1993(1997)
【非特許文献2】
Graves M.et al:Virology 257,15−23(1999)
【非特許文献3】
田中允ら:平成13年度日本工学会大会講演要旨集236(200 1)
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、クロレラ培養によりヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を同時に且つ効率よく安価に製造する方法を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、宿主クロレラ細胞にヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を生産させるクロロウイルスに関する。
【0006】
また、本発明は、上記クロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることを特徴とする、ヒアルロン酸及びキチンの製造方法に関する。
【0007】
本発明者は、自然界より300種類のクロロウイルスをスクリーニングすることが出来た。これらのクロロウイルスの中には、ヒアルロン酸生産ウイルスとして、CVHI1、CVKA1、CVBR4、CVA1、CVNI1、CVNA1、CVTS1、CVSE1、CVO1があり、また、キチン生産ウイルスとして、CVK2、CVNA2、CVKU2が認められた。
また、感染過程のごく初期から(60〜90分)クロレラ細胞表面にヒアルロン酸繊維及びキチン繊維を同時に蓄積する興味ある2種類のクロロウイルス(CVIK1及びCVHA1)を分離した。
培養し増殖過程にあるクロレラにこの2種類のクロロウイルス(CVIK1又はCVHA1)を感染させたところ、感染後1〜1.5時間後にクロレラ細胞表面にヒアルロン酸繊維及びキチン繊維が蓄積し始め、数時間後の溶菌時までその量は増大した。対培養液(1L)当たりアルロン酸は100mg、キチンは100mgであった。
発酵法での物質生産は、常温・常圧で行えると言う特徴はあるものの、仕込み濃度が低く装置が大きくなる欠点を有する。本発明では、ヒアルロン酸並びにキチンと共にクロレラまでも同時に生産できる特徴がある。従って、本発明の方法は、今後各物質の安価な製造方法として有望な方法であると言うことが出来る。
【0008】
【発明の実施の形態】
クロロウィルス(クロレラウィルス)は、分類学上はPhycodnaviridae科 Phycodnavirus属に属するウィルスである。
クロロウィルスは自然界に広く分布し、日本においても各地の自然淡水中から検出されている(Yamada et al.,Appl Environ Microbiol,1991,57,3433−3437;Yamada et al.,Biosci Biotech Biochem,1993,57,733−739等)。
これまでに明らかにされた各種クロロウィルスに共通する特徴は、以下のように要約される。
(1)藻類クロレラを宿主とする。
(2)直径140〜190の巨大な正二十面体粒子であり(ショ糖密度勾配沈降係数2300s)、主としてタンパク質(64%)、DNA(25%)、及び脂質(10%)から成る。
(3)ウィルス粒子は50種以上の構成タンパク質から成り、その内主要タンパク質Vp54(Vp52)が約40%を占める。
(4)ウィルスゲノムは巨大な(300〜380kbp)線状dsDNAであり、特殊なヘアピン末端構造を有する。
(5)ウィルスゲノムには700個以上の遺伝子読み取り枠(ORF)があり、その多くが感染サイクル中に発現している。
(6)感染様式はバクテリオファージと類似し、プラークを形成する。
(7)ウイルス粒子は宿主細胞質で増殖する。
【0009】
本発明の2種のクロロウィルスは、何れもヒアルロナンシンターゼ遺伝子(ヒアルロン酸合成酵素遺伝子;has)及びキチンシンターゼ遺伝子(キチン合成酵素遺伝子;chs)の両方を有し、感染過程の初期(感染後1〜1.5時間後)から中期(感染後3〜4時間後)にかけて宿主細胞表面にヒアルロン酸繊維及びキチン繊維を生産する。
これらウイルスを識別する最も有効な方法は「DNAフィンガープリント法」である。即ち、ウイルスDNAを制限酵素EcoRIで切断し、その断片をアガロースゲル電気泳動法で分離してパターンを見る。
図1に示すように、各ウイルスは切断パターンに特徴があり、一見して識別できる。サイズマーカとの対比において、CVIK1、CVHA1特有のパターンが確認できる。このパターンが完全に一致するウイルスは他にはない。
図1において、各レーンはレーン1からレーン16まで順に、CVK2,CVHA1,CVHI1,CVKA1,CVBR4,CVA1,CVNI1,CVNA1,CVIK1,CVTS1,CVSE1,CVO1,CVNA2,CVKU2,PBCV−1,CVK2に対応する。サイズはkbp(キロ塩基対数)で示してある。
更に、このパターンの中で、特に重要なキチン合成酵素の遺伝子(chs)に相当するものは、図2に示すように3.0kbのシグナルである。
即ち、ウイルスDNAを制限酵素EcoRIで切断後、chs遺伝子をプローブとしてサザン解析を行うと、chs遺伝子を有する場合には3.0kbpの位置にシグナルが出現する。
なお、図2における各レーンは図1と同じである。
またヒアルロン酸合成遺伝子(has)に相当するものは、図3に示すように3.5kbpと0.4kbpのシグナルである。
即ち、ウイルスDNAを制限酵素EcoRIで切断後、has遺伝子をプローブとしてサザン解析を行うと、has遺伝子を有する場合には3.5kbpと0.4kbpの位置にシグナルが出現する。
図3における各レーンも図1と同じである。
これらを全部(即ち、3.0kbpのシグナル、3.5kbpのシグナル及び0.4kbpのシグナル)有するものは、これまでに発見されたクロロウィルスの中では、CVIK1とCVHA1のみである。
【0010】
本発明の2種のクロロウィルスは、他のクロロウィルスと同様、Phycodnaviridae科Phycodnavirus属に属するウィルスであるが、どちらも新種のウィルスと判断されるので、本発明者はこれらをそれぞれCVIK1及びCVHA1と命名した。
【0011】
本発明のクロロウイルスのスクリーニング方法は、プラークアッセイ法により行えばよい。
即ち、例えば、MBBM寒天培地(硝酸ナトリウム0.025%、塩化カルシウム0.0025%、硫酸マグネシウム0.0075%、リン酸1カリウム0.0175%、リン酸2カリウム0.0075%、食塩0.0025%、ペプトン0.1%、ショ糖0.5%、寒天1.5%、pH6.5)に培養クロレラ細胞(Chlorella sp.NC64A、C.prototechoides211−6等)107cellsと試料水(100μl),0.75%MBBM軟寒天培地の混合液を重層し。光照射下(白色光3000〜5000ルックス)、25℃で2〜4日間培養し、形成されたプラークからウイルスを回収する。ウイルスはプラークを爪楊枝でつつき培養クロレラ細胞液に接種し、6〜8時間後溶菌液を遠心分離(15,000G)した後沈殿として回収できる。ウイルスDNAを用いたサザン法によって(キチン合成酵素遺伝子chs、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子hasをプローブとする)、キチン生産型、ヒアルロン酸生産型を識別できるので、これらの中から両多糖類を生産するものをスクリーニングすれば本発明に係るCVIK1、CVHA1等が得られる。
【0012】
本発明に係るヒアルロン酸及びキチンの製造方法は、上記クロロウィルス(CVIK1又はCVHA1)を宿主クロレラ細胞に感染させることにより達成されるが、クロレラウィルスの使用量としては、通常、1Lのクロレラ培養液(107〜108cells/ml)にクロロウィルス(CVIK1又はCVHA1)をmoi1〜10程度(細胞あたりのウイルス数)で感染させる。
そして、通常、感染後2〜4時間で細胞を遠心分離により回収する。この菌体から多糖類を分離精製すれば、目的とする繊維状のヒアルロン酸及び繊維状のキチンが得られる。
得られたヒアルロン酸繊維、キチン繊維は、電子顕微鏡測定によりその長さを測定すると0.5〜1.0ミクロンにも達しており重合度が非常に高いことが判る。
【0013】
クロロウィルスを感染させる宿主クロレラ細胞としては、例えば、Chlorella sp.NC64AやC.prototechoides 211−6等のクロレラ株が用いられる。
クロレラの培養に用いられる培地としては、例えば、MBBM培地(硝酸ナトリウム0.025%、塩化カルシウム0.0025%、硫酸マグネシウム0.0075%、リン酸1カリウム0.0175%、リン酸2カリウム0.0075%、食塩0.0025%、ペプトン0.1%、pH6.5)やMAM培地(硝酸アンモニウム0.025%、硝酸カリウム0.01%、塩化カルシウム0.0025%、硫酸マグネシウム0.0075%、塩化ナトリウム0.0025%、β−グリセロリン酸ナトリウム0.1%、バクトペプトン0.1%、酵母エキス0.05%、カザミノ酸0.1%、マルトエキス0.05%)等が用いられる。
クロレラの培養は、通常、光照射下(白色光3000〜5000ルックス)、25℃で対数増殖期後期(107〜108cells/ml)まで培養する。増殖速度(倍加時間)は約6時間程度である。
【0014】
【実施例】
以下、実施例及び参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例、参考例により何ら限定されるものではない。
【0015】
実施例1 クロロウイルスのスクリーニング
スクリーニング方法は、プラークアッセイ法によって行った。
MBBM寒天培地(硝酸ナトリウム0.025%、塩化カルシウム0.0025%、硫酸マグネシウム0.0075%、リン酸1カリウム0.0175%、リン酸2カリウム0.0075%、食塩0.0025%、ペプトン0.1%、ショ糖0.5%、寒天1.5%、pH6.5)に培養クロレラ細胞(Chlorella sp.NC64A)107cellsと試料水(100μl)及び0.75%MBBM軟寒天培地の混合液を重層した。光照射下(白色光3000〜5000ルックスs)、25℃で4日間培養し、形成されたプラークからウイルスを回収した。ウイルスはプラークを爪楊枝でつつき培養クロレラ細胞液に接種し、8時間後、溶菌液を遠心分離(15,000G)した後、沈殿として回収した。ウイルスDNAを用いたサザン法(キチン合成酵素遺伝子chs、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子hasをプローブとする)によってキチン生産型、ヒアルロン酸生産型を識別した。
〈結果〉
分離されたクロロウイルスは300株であったが、その内に、ヒアルロン酸のみを生産するものとして、CVHI1,CVKA1,CVBR4,CVA1,CVNI1,CVNA1,CVTS1,CVSE1,CVO1等が(60%)、また、キチンのみを生産するものとして、CVK2,CVNA2,CVKU2等(27%)があり、更に、両多糖類を生産ものとしてCVIK1,CVHA1等(13%)がスクリーニングされた。
【0016】
参考例1 クロレラの培養
クロレラ株(Chlorella sp.NC64A)をMBBM培地(硝酸ナトリウム0.025%、塩化カルシウム0.0025%、硫酸マグネシウム0.0075%、リン酸1カリウム0.0175%、リン酸2カリウム0.0075%、食塩0.0025%、ペプトン0.1%、pH6.5)で光照射下(白色光3000〜5000ルックス)、25℃で対数増殖期後期(107〜108cells/ml)まで培養した。増殖速度(倍加時間)は約6時間であった。
【0017】
実施例2 CVIK1感染による多糖類の生産
参考例1で得られた1Lのクロレラ培養液(107〜108cells/ml)にクロロウイルス(CVIK1)をmoi1〜10程度(細胞あたりのウイルス数)で感染させ、感染後3時間で細胞を遠心分離により回収した。
〈結果〉
この菌体より多糖類を分離精製したところ対培養液あたりヒアルロン酸及びキチンはそれぞれ100mg/Lであった。キチンは細胞遊離不溶性多糖質でキチナーゼによって分解される画分として回収し定量した。ヒアルロン酸は不溶性多糖を除いた後、酢酸ナトリウム0.5%及びエチルアルコール3倍量(V/V)を加えて沈殿した画分をイオン交換クロマトグラフィー法で精製後定量した。
なお、別法として、感染3時間後、細胞を遠心分離により回収し、トミー精工MT−360ボルテックスミキサー(mixing speed 10)で室温にて5分間処理した後、低速遠心分離(1,000×G)により沈殿させると、上清表面に白い浮遊物としてキチンが回収出来た(回収量は100mg/Lであった。)。キチンを回収後、試料液を高速遠心分離(10,000×G)して沈殿物を除去し、上清に酢酸ナトリウム0.5%及びエチルアルコール3倍量(V/V)を添加してヒアルロン酸を析出させ、遠心分離(10,000×G)により沈殿としてこれを回収した。エチルアルコールによる析出を2回繰り返すことによって高純度のヒアルロン酸を得ることが出来た(100mg/L)。
また、上記ボルテックスミキサー処理の代りに超音波処理を行った場合もボルテックスミキサー処理の場合と全く同様な結果が得られた。
【0018】
実施例3 CVHA1感染による多糖類の生産
参考例1と同様にして得られた1Lのクロレラ培養液(107〜108cells/ml)にクロロウイルス(CVHA1)をmoi1〜10程度(細胞あたりのウイルス数)で感染させ、感染後3時間で細胞を遠心分離により回収した。
〈結果〉
この菌体より、実施例2の方法に準じて多糖類を分離精製したところ対培養液あたりヒアルロン酸及びキチンがそれぞれ100mg/L得られた。
【0019】
【発明の効果】
クロロウィルスを用いる本発明の方法によれば、
(1)極めて短時間(2〜4時間)に高純度のヒアルロン酸繊維、キチン繊維を生産できる。
(2)得られたヒアルロン酸繊維、キチン繊維は、どちらも電子顕微鏡測定により長さが0.5〜1.0ミクロンにも達しており重合度が非常に高い。
(3)培養したクロレラ自身も利用できる可能性が高い。
等の効果を奏する。
また、クロレラ培養には長い歴史があり特に日本においては、健康・安全のイメージが強いので、クロレラからの生産物として一般に受け入れられ易いと言う利点もある。
更にまた、大気温暖化ガス吸収プロセス等とカップリングさせれば更に高付加価値物質生産系として効果が大きい。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、各種クロレラウイルスのEcoRI切断DNAフィンガープリント法による比較を示す。
【図2】図2は、各種クロロウイルスについてキチン合成酵素遺伝子(chs)のパターン解析を行った結果を示す。
【図3】図3は、各種クロロウイルスについてヒアルロン酸合成酵素遺伝子(has)のパターン解析を行った結果を示す。
Claims (7)
- 宿主クロレラ細胞にヒアルロン酸及びキチンの両多糖類を生産させるクロロウイルスであって、DNAハイブリダイゼーション法により、ウイルスDNAを制限酵素EcoRIで切断し、その断片をアガロースゲル電気泳動で分離したときに、キチン合成酵素の遺伝子(chs)に相当する3.0kbのシグナルと、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子(has)に相当する3.5kbpと0.4kbpのシグナルの両方を有するクロロウィルス。
- クロロウイルスCVIK1である請求項1に記載のクロロウィルス。
- クロロウイルスCVHA1である請求項1に記載のクロロウィルス。
- 請求項1ないし3のいずれか1項に記載のクロロウィルスを宿主クロレラ細胞に感染させることを特徴とする、ヒアルロン酸及びキチンの製造方法。
- クロレラ培養液にクロロウイルスをmoi1〜10程度(細胞あたりのウイルス数)で感染させる請求項4に記載の製造方法。
- クロロウイルスCVIK1を用いる請求項4又は5に記載の製造方法。
- クロロウイルスCVHA1を用いる請求項4又は5に記載の製造方法。
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