CN112501156B - 一种海洋贝类生物沉积物总dna的高效提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋贝类生物沉积物研究技术领域，涉及一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，包括海洋贝类生物沉积物样品的预处理和样品总DNA提取两步，其中关键步骤为样品的预处理，依次使用3种不同成分的洗涤溶液对沉积物样品进行预处理，去除酚类物质、腐殖质等生物污染和杂质。除杂后的样品加入提取缓冲液，并进行细胞裂解、萃取等步骤，收集DNA沉淀。本发明运用生物化学、分子生物学和微生物学的原理，提取得到高质量的海洋贝类生物沉积物中微生物DNA，便于后续分子生物学准确全面研究。
Description
技术领域
本发明属于海洋贝类生物沉积物研究技术领域，涉及一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，主要包括海洋贝类生物沉积物样品的预处理和样品总DNA提取两步。
背景技术
海洋生态环境是自然界生态系统的重要组成部分，海底沉积物中的微生物多样性对维持海洋生态平衡至关重要。对于海洋沉积物中微生物多样性的研究，使用常规微生物DNA提取方法(如：酚-氯仿法、SDS高盐提取法、试剂盒法等)得到的DNA质量不高，且通常带有污染，影响后续数据分析。
由于海洋贝类沉积物中含有大量的腐殖质、酚类物质以及重金属等杂质，这些污染物的结构比较复杂，可能抑制某些活性物质且不易除去，对DNA的提取以及后续的PCR扩增等生物学研究过程会产生不利影响。另外，底泥微粒对于核酸物质具有吸附作用，使得细胞不易于分离。可见，海洋贝类生物沉积物DNA的高质量提取成为了后续分子生物学研究的重要基础。
目前，对于海洋贝类沉积物中DNA提取的研究方法主要有SDS高盐提取法及试剂盒提取等方法，但这些方法并没有有效的去除腐殖质、酚类物质等污染物，技术方法尚不完善，因此，对于海洋贝类生物沉积物中微生物总DNA的提取方法，尤其是在沉积物的预处理方面，仍然有很大的探究空间。
发明内容
本发明旨在运用生物化学、分子生物学和微生物学的原理，研究一种具有操作简单、高效、重复性好以及经济等特点的海洋生物贝类沉积物中微生物总DNA提取方法，所提DNA浓度、纯度及得率高，可直接用于PCR扩增等后续分子生物学实验研究，以解决海洋生物贝类沉积物中微生物总DNA提取过程中存在的问题。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
本发明提供了一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，包括如下步骤：
(1)样品的洗涤：依次使用洗涤溶液1、洗涤溶液2、洗涤溶液3对沉积物进行涡旋洗涤；
(2)细菌细胞溶解：在经过洗涤处理后的沉积物中加入提取缓冲液，混匀后将其浸入液氮中，使沉积混合物完全冻结，50-60℃水浴解冻，重复此冻融过程数次，加入溶菌酶，37℃水浴保温，加入SDS与蛋白酶K，50-60℃水浴保温；
(3)总DNA提取纯化：将经过上述处理后的沉积物进行涡流悬浮，添加0.4-0.6倍体积的NaCl溶液混合均匀，添加0.9-1.1倍体积的氯仿-异戊醇混合液萃取，离心取上清，重复此萃取步骤，直到上清液清澈为止；加入0.5-0.7倍体积的异丙醇并混匀，室温静置，离心弃上清；加入冰乙醇并涡旋，离心弃上清，待乙醇挥发后，加入无菌超纯水溶解沉淀，即为DNA提取液。
其中，所述步骤(1)中洗涤溶液1的成分是50mM Tris-HCl:200mM NaCl:5mM Na2-EDTA:0.05％TritionX-100:1％CTAB:1％PVP，洗涤溶液2的成分是50mM Tris-HCl:200mMNaCl:5mM Na2-EDTA:1％CTAB:1％PVP，洗涤溶液3的成分是10mM Tris-HCl:0.1mM Na2-EDTA:1％CTAB:1％PVP，三种溶液所用Tris-HCl的pH为8.3。
优选地，所述步骤(2)中提取缓冲液的成分是100mM Tris-HCl:100mM Na2-EDTA:100mM Na3PO4:1.5M NaCl:1％CTAB:1％PVP，其中所用Tris-HCl的pH为8.0，Na3PO4的pH为8.0。
优选地，所述步骤(2)中溶菌酶浓度为100mg/ml，SDS的质量分数为20％，蛋白酶K的TE缓冲液溶液浓度为20mg/ml。
优选地，所述步骤(3)中NaCl溶液浓度为4.5M，氯仿-异戊醇混合液的体积比为24:1。
优选地，所述步骤(1)中涡旋条件为涡旋震荡2min，12000rpm离心7min后，弃上清。
优选地，所述步骤(2)中使用液氮冻融2次，溶菌酶保温20-30min，蛋白酶K保温2-2.5h。
优选地，所述步骤(3)中氯仿-异戊醇混合液萃取条件为轻微摇动萃取15min，12000rpm离心5min，取上清。
优选地，所述步骤(3)中异丙醇萃取条件为室温静置15min，12000rpm离心15min，弃上清。
优选地，所述步骤(3)中冰乙醇萃取条件为涡旋震荡，12000rpm离心15min，弃上清。
本发明的有益效果是：
本发明针对海洋贝类生物沉积物中的微生物总DNA提取，包括海洋贝类生物沉积物样品的预处理和样品总DNA提取两步，其中关键步骤为样品的预处理，先后使用3种不同溶液对沉积物进行洗涤预处理，去除海洋贝类生物沉积物中的腐殖质和酚类物质等杂质。
本发明在DNA提取缓冲液中添加表面活性剂1％CTAB和1％PVP，提取过程中加入SDS进一步去除剩余杂质，最大程度上消除杂质对后续过程的影响，提取得到高质量的海洋贝类生物沉积物中微生物DNA，无需纯化，可直接进行PCR扩增等后续步骤。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为实施例1和对比例1中提取所得海洋贝类生物沉积物总DNA的1％琼脂糖凝胶电泳图片。其中Marker(分子量标记)为D2000(Novagen，USA)，1、2、3为实施例1的3个平行样品，4、5、6为对比例1的3个平行样品。电泳条件：1×TAE电泳缓冲液，120V电压下约电泳30min。
图2为实施例1和对比例1中提取的DNA进行细菌V3V4区的16S测序结果。其中1、2、3为实施例1的3个平行样品，4、5、6为对比例1的3个平行样品。
图3为酚氯仿方法提取所得海洋贝类生物沉积物总DNA的1％琼脂糖凝胶电泳图片。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本实施例中，所用试剂成分(水混合溶剂终浓度)如下：
(1)洗涤溶液1的成分是50mM Tris-HCl(pH8.3):200mM NaCl:5mM Na2-EDTA:0.05％TritionX-100:1％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵):1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；
(2)洗涤溶液2的成分是50mM Tris-HCl(pH8.3):200mM NaCl:5mM Na2-EDTA:1％CTAB:1％PVP；
(3)洗涤溶液3的成分是10mM Tris-HCl(pH8.3):0.1mM Na2-EDTA:1％CTAB:1％PVP；
(4)提取缓冲液的成分是100mM Tris-HCl(pH8.0):100mM Na2-EDTA:100mM Na3PO4(pH8.0):1.5M NaCl:1％CTAB:1％PVP
(5)蛋白酶K的浓度为20mg/ml TE缓冲液；
(6)TE缓冲液的成分是10mM Tris-HCl(pH8.0):1mM EDTA。
一、海洋沉积物样品中总DNA的提取
实施例1
取同样的沉积物，按照如下步骤，进行3组平行操作，获得3组平行样品。
(1)样品的洗涤：
(1.1)取400mg沉积物样品于2ml离心管中，加入600μl洗涤溶液1涡旋2min，12000
rpm离心7min，弃上清。
(1.2)加入600μl洗涤溶液2涡旋2min，12000rpm离心7min，弃上清。
(1.3)加入600μl洗涤溶液3涡旋2min，12000rpm离心7min，弃上清。
(2)细菌细胞溶解：
(2.1)向步骤(1.3)处理后的沉积物中加入400μl提取缓冲液，在5000rpm的迷你搅拌器上均质10s混匀。
(2.2)将离心管浸入液氮中，直到沉积物混合物完全冻结，置于55℃水浴中解冻，重复此冻融过程2次。
(2.3)加入5μl溶菌酶(100mg/ml)，置于37℃水浴中30min，隔15min轻微摇匀一次。
(2.4)加入40μl SDS(20％，w/w)和4μl蛋白酶K(20mg/ml TE缓冲液)，置于55℃水浴中2h，每隔30min摇匀一次。
(3)总DNA提取纯化：
(3.1)将步骤(2.4)处理后的沉积物进行涡流悬浮，加入225μl的4.5M NaCl溶液并混匀。
(3.2)加入675μl氯仿-异戊醇(24:1，v/v)轻微摇动15min，12000rpm离心5min，取上清于一新的2ml离心管。
(3.3)重复步骤(3.2)，直至上清液清澈。
(3.4)于所得上清液中加入400μl异丙醇并混匀，室温静置15min后，12000rpm离心15min，弃上清。
(3.5)加入1ml冰乙醇(70％，v/v)并涡旋，12000rpm离心15min，弃上清。待乙醇蒸发后，加入30μl无菌超纯水，置于4℃冷藏12h溶解沉淀，即为DNA提取液。
对比例1
为了比较与现有提取方法的平行效果，同时进行了对比实验，按照贺惠等人(贺惠,张玉,甄毓,米铁柱,陈阳阳,于志刚.海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2017,47(06):17-24.)报道的SDS高盐法进行海洋沉积物样品中总DNA的提取，此方法实验过程中用到的沉积物样品同实施例1。
二、提取总DNA的提取效率检测
分别将实施例1和对比例1提取所得6组DNA加水溶解，SDS高盐法提取所得DNA溶液呈现浅棕色，使用实施例1方法提取得到的DNA溶液呈无色透明状。
分别将实施例1和对比例1提取得到的DNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，可见，两种提取方法得到的DNA均大于2000bp，使用实施例1方法(样品1、2、3)提取所得DNA条带比对比例1SDS高盐法(样品4、5、6)提取所得DNA的条带亮。
对实施例1和对比例1中提取的DNA进行细菌V3V4区16S测序。
目的片段长度为480bp，使用上游引物338F:5ˊ-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3ˊ和下游引物806R:5ˊ-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3ˊ作为宏基因组的引物对，进行PCR扩增，以扩增产物为模板进行测序文库的制备，文库质量检测，上机测序策略采用NovaSeq-PE250(上海派森诺生物科技股份有限公司)，测序数据量保持每个样品的有效序列在6万条左右(允许单样品数据量下浮10％)，最后进行数据统计分析，OTU划分和分类地位鉴定结果见图2，本发明方法测序样品的OTU数(样品1、2、3)在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)水平上均高于SDS高盐法测序样品的OTU数(样品4、5、6)，由此可见，本发明方法提取得到的DNA质量更高，有利于后续PCR等分子生物学研究。
另外，在得出本发明方法之前，使用传统DNA提取的酚氯仿方法对沉积物样品进行了总DNA提取，此方法实验过程中用到的沉积物样品同实施例1，将提取得到的DNA加水溶解，经1％琼脂糖凝胶电泳检测(样品7，8)，结果见图3，可见，使用酚氯仿方法提取所得DNA几乎不能分辨出条带，不能提取得到沉积物样品的高质量DNA。
综合上述测定结果可以看出，本发明方法可成功提取高质量DNA，且有利于进行后续分子生物学研究，说明本发明适用于海洋贝类生物沉积物中微生物总DNA的提取。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）样品的洗涤：依次使用洗涤溶液1、洗涤溶液2、洗涤溶液3对沉积物进行涡旋洗涤，其中，洗涤溶液1的成分是50mM Tris-HCl: 200mM NaCl: 5mM Na2-EDTA: 0.05%TritionX-100: 1% CTAB: 1% PVP，洗涤溶液2的成分是50mM Tris-HCl: 200mM NaCl: 5mMNa2-EDTA: 1% CTAB: 1% PVP，洗涤溶液3的成分是10mM Tris-HCl: 0.1mM Na2-EDTA: 1%CTAB: 1% PVP，三种溶液所用Tris-HCl的pH为8.3；
（2）细菌细胞溶解：在经过洗涤处理后的沉积物中加入提取缓冲液，混匀后将其浸入液氮中，使沉积混合物完全冻结，50-60℃水浴解冻，重复此冻融过程数次，加入溶菌酶，37℃水浴保温，加入SDS与蛋白酶K，50-60℃水浴保温，其中，溶菌酶浓度为100mg/ml，SDS的质量分数为20%，蛋白酶K的TE缓冲液溶液浓度为20 mg/ml；
提取缓冲液的成分是100mM Tris-HCl: 100mM Na2-EDTA: 100mM Na3PO4: 1.5M NaCl:1% CTAB: 1% PVP，其中所用Tris-HCl的pH为8.0，Na3PO4的pH为8.0；
使用液氮冻融2次，溶菌酶保温20-30min，蛋白酶K保温2-2.5h；
（3）总DNA提取纯化：将经过上述处理后的沉积物进行涡流悬浮，添加0.4-0.6倍体积的NaCl溶液混合均匀，添加0.9-1.1倍体积的氯仿-异戊醇混合液萃取，离心取上清，重复此萃取步骤，直到上清液清澈为止；加入0.5-0.7倍体积的异丙醇并混匀，室温静置，离心弃上清；加入冰乙醇并涡旋，离心弃上清，待乙醇挥发后，加入无菌超纯水溶解沉淀，即为DNA提取液。
2.根据权利要求1所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中NaCl溶液浓度为4.5M，氯仿-异戊醇混合液的体积比为24:1。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤（1）中涡旋条件为涡旋震荡2 min，12000 rpm离心7 min后，弃上清。
4.根据权利要求3所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中氯仿-异戊醇混合液萃取条件为轻微摇动萃取15 min，12000 rpm离心5min，取上清。
5.根据权利要求3所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中异丙醇萃取条件为室温静置15 min，12000 rpm离心15 min，弃上清。
6.根据权利要求3所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法，其特征在于，所述步骤（3）中冰乙醇萃取条件为涡旋震荡，12000 rpm离心15 min，弃上清。
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