CN112501156A - 一种海洋贝类生物沉积物总dna的高效提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋贝类生物沉积物研究技术领域,涉及一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,包括海洋贝类生物沉积物样品的预处理和样品总DNA提取两步,其中关键步骤为样品的预处理,依次使用3种不同成分的洗涤溶液对沉积物样品进行预处理,去除酚类物质、腐殖质等生物污染和杂质。除杂后的样品加入提取缓冲液,并进行细胞裂解、萃取等步骤,收集DNA沉淀。本发明运用生物化学、分子生物学和微生物学的原理,提取得到高质量的海洋贝类生物沉积物中微生物DNA,便于后续分子生物学准确全面研究。
Description
技术领域
本发明属于海洋贝类生物沉积物研究技术领域,涉及一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,主要包括海洋贝类生物沉积物样品的预处理和样品总DNA提取两步。
背景技术
海洋生态环境是自然界生态系统的重要组成部分,海底沉积物中的微生物多样性对维持海洋生态平衡至关重要。对于海洋沉积物中微生物多样性的研究,使用常规微生物DNA提取方法(如:酚-氯仿法、SDS高盐提取法、试剂盒法等)得到的DNA质量不高,且通常带有污染,影响后续数据分析。
由于海洋贝类沉积物中含有大量的腐殖质、酚类物质以及重金属等杂质,这些污染物的结构比较复杂,可能抑制某些活性物质且不易除去,对DNA的提取以及后续的PCR扩增等生物学研究过程会产生不利影响。另外,底泥微粒对于核酸物质具有吸附作用,使得细胞不易于分离。可见,海洋贝类生物沉积物DNA的高质量提取成为了后续分子生物学研究的重要基础。
目前,对于海洋贝类沉积物中DNA提取的研究方法主要有SDS高盐提取法及试剂盒提取等方法,但这些方法并没有有效的去除腐殖质、酚类物质等污染物,技术方法尚不完善,因此,对于海洋贝类生物沉积物中微生物总DNA的提取方法,尤其是在沉积物的预处理方面,仍然有很大的探究空间。
发明内容
本发明旨在运用生物化学、分子生物学和微生物学的原理,研究一种具有操作简单、高效、重复性好以及经济等特点的海洋生物贝类沉积物中微生物总DNA提取方法,所提DNA浓度、纯度及得率高,可直接用于PCR扩增等后续分子生物学实验研究,以解决海洋生物贝类沉积物中微生物总DNA提取过程中存在的问题。
本发明是采用以下的技术方案实现的:
本发明提供了一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,包括如下步骤:
(1)样品的洗涤:依次使用洗涤溶液1、洗涤溶液2、洗涤溶液3对沉积物进行涡旋洗涤;
(2)细菌细胞溶解:在经过洗涤处理后的沉积物中加入提取缓冲液,混匀后将其浸入液氮中,使沉积混合物完全冻结,50-60℃水浴解冻,重复此冻融过程数次,加入溶菌酶,37℃水浴保温,加入SDS与蛋白酶K,50-60℃水浴保温;
(3)总DNA提取纯化:将经过上述处理后的沉积物进行涡流悬浮,添加0.4-0.6倍体积的NaCl溶液混合均匀,添加0.9-1.1倍体积的氯仿-异戊醇混合液萃取,离心取上清,重复此萃取步骤,直到上清液清澈为止;加入0.5-0.7倍体积的异丙醇并混匀,室温静置,离心弃上清;加入冰乙醇并涡旋,离心弃上清,待乙醇挥发后,加入无菌超纯水溶解沉淀,即为DNA提取液。
其中,所述步骤(1)中洗涤溶液1的成分是50mM Tris-HCl:200mM NaCl:5mM Na2-EDTA:0.05%TritionX-100:1%CTAB:1%PVP,洗涤溶液2的成分是50mM Tris-HCl:200mMNaCl:5mM Na2-EDTA:1%CTAB:1%PVP,洗涤溶液3的成分是10mM Tris-HCl:0.1mM Na2-EDTA:1%CTAB:1%PVP,三种溶液所用Tris-HCl的pH为8.3。
优选地,所述步骤(2)中提取缓冲液的成分是100mM Tris-HCl:100mM Na2-EDTA:100mM Na3PO4:1.5M NaCl:1%CTAB:1%PVP,其中所用Tris-HCl的pH为8.0,Na3PO4的pH为8.0。
优选地,所述步骤(2)中溶菌酶浓度为100mg/ml,SDS的质量分数为20%,蛋白酶K的TE缓冲液溶液浓度为20mg/ml。
优选地,所述步骤(3)中NaCl溶液浓度为4.5M,氯仿-异戊醇混合液的体积比为24:1。
优选地,所述步骤(1)中涡旋条件为涡旋震荡2min,12000rpm离心7min后,弃上清。
优选地,所述步骤(2)中使用液氮冻融2次,溶菌酶保温20-30min,蛋白酶K保温2-2.5h。
优选地,所述步骤(3)中氯仿-异戊醇混合液萃取条件为轻微摇动萃取15min,12000rpm离心5min,取上清。
优选地,所述步骤(3)中异丙醇萃取条件为室温静置15min,12000rpm离心15min,弃上清。
优选地,所述步骤(3)中冰乙醇萃取条件为涡旋震荡,12000rpm离心15min,弃上清。
本发明的有益效果是:
本发明针对海洋贝类生物沉积物中的微生物总DNA提取,包括海洋贝类生物沉积物样品的预处理和样品总DNA提取两步,其中关键步骤为样品的预处理,先后使用3种不同溶液对沉积物进行洗涤预处理,去除海洋贝类生物沉积物中的腐殖质和酚类物质等杂质。
本发明在DNA提取缓冲液中添加表面活性剂1%CTAB和1%PVP,提取过程中加入SDS进一步去除剩余杂质,最大程度上消除杂质对后续过程的影响,提取得到高质量的海洋贝类生物沉积物中微生物DNA,无需纯化,可直接进行PCR扩增等后续步骤。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。
在附图中:
图1为实施例1和对比例1中提取所得海洋贝类生物沉积物总DNA的1%琼脂糖凝胶电泳图片。其中Marker(分子量标记)为D2000(Novagen,USA),1、2、3为实施例1的3个平行样品,4、5、6为对比例1的3个平行样品。电泳条件:1×TAE电泳缓冲液,120V电压下约电泳30min。
图2为实施例1和对比例1中提取的DNA进行细菌V3V4区的16S测序结果。其中1、2、3为实施例1的3个平行样品,4、5、6为对比例1的3个平行样品。
图3为酚氯仿方法提取所得海洋贝类生物沉积物总DNA的1%琼脂糖凝胶电泳图片。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白,下面结合附图,对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
本实施例中,所用试剂成分(水混合溶剂终浓度)如下:
(1)洗涤溶液1的成分是50mM Tris-HCl(pH8.3):200mM NaCl:5mM Na2-EDTA:0.05%TritionX-100:1%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵):1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮);
(2)洗涤溶液2的成分是50mM Tris-HCl(pH8.3):200mM NaCl:5mM Na2-EDTA:1%CTAB:1%PVP;
(3)洗涤溶液3的成分是10mM Tris-HCl(pH8.3):0.1mM Na2-EDTA:1%CTAB:1%PVP;
(4)提取缓冲液的成分是100mM Tris-HCl(pH8.0):100mM Na2-EDTA:100mM Na3PO4(pH8.0):1.5M NaCl:1%CTAB:1%PVP
(5)蛋白酶K的浓度为20mg/ml TE缓冲液;
(6)TE缓冲液的成分是10mM Tris-HCl(pH8.0):1mM EDTA。
一、海洋沉积物样品中总DNA的提取
实施例1
取同样的沉积物,按照如下步骤,进行3组平行操作,获得3组平行样品。
(1)样品的洗涤:
(1.1)取400mg沉积物样品于2ml离心管中,加入600μl洗涤溶液1涡旋2min,12000
rpm离心7min,弃上清。
(1.2)加入600μl洗涤溶液2涡旋2min,12000rpm离心7min,弃上清。
(1.3)加入600μl洗涤溶液3涡旋2min,12000rpm离心7min,弃上清。
(2)细菌细胞溶解:
(2.1)向步骤(1.3)处理后的沉积物中加入400μl提取缓冲液,在5000rpm的迷你搅拌器上均质10s混匀。
(2.2)将离心管浸入液氮中,直到沉积物混合物完全冻结,置于55℃水浴中解冻,重复此冻融过程2次。
(2.3)加入5μl溶菌酶(100mg/ml),置于37℃水浴中30min,隔15min轻微摇匀一次。
(2.4)加入40μl SDS(20%,w/w)和4μl蛋白酶K(20mg/ml TE缓冲液),置于55℃水浴中2h,每隔30min摇匀一次。
(3)总DNA提取纯化:
(3.1)将步骤(2.4)处理后的沉积物进行涡流悬浮,加入225μl的4.5M NaCl溶液并混匀。
(3.2)加入675μl氯仿-异戊醇(24:1,v/v)轻微摇动15min,12000rpm离心5min,取上清于一新的2ml离心管。
(3.3)重复步骤(3.2),直至上清液清澈。
(3.4)于所得上清液中加入400μl异丙醇并混匀,室温静置15min后,12000rpm离心15min,弃上清。
(3.5)加入1ml冰乙醇(70%,v/v)并涡旋,12000rpm离心15min,弃上清。待乙醇蒸发后,加入30μl无菌超纯水,置于4℃冷藏12h溶解沉淀,即为DNA提取液。
对比例1
为了比较与现有提取方法的平行效果,同时进行了对比实验,按照贺惠等人(贺惠,张玉,甄毓,米铁柱,陈阳阳,于志刚.海洋沉积物中微生物基因组DNA提取方法的比较研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2017,47(06):17-24.)报道的SDS高盐法进行海洋沉积物样品中总DNA的提取,此方法实验过程中用到的沉积物样品同实施例1。
二、提取总DNA的提取效率检测
分别将实施例1和对比例1提取所得6组DNA加水溶解,SDS高盐法提取所得DNA溶液呈现浅棕色,使用实施例1方法提取得到的DNA溶液呈无色透明状。
分别将实施例1和对比例1提取得到的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1,可见,两种提取方法得到的DNA均大于2000bp,使用实施例1方法(样品1、2、3)提取所得DNA条带比对比例1SDS高盐法(样品4、5、6)提取所得DNA的条带亮。
对实施例1和对比例1中提取的DNA进行细菌V3V4区16S测序。
目的片段长度为480bp,使用上游引物338F:5ˊ-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3ˊ和下游引物806R:5ˊ-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3ˊ作为宏基因组的引物对,进行PCR扩增,以扩增产物为模板进行测序文库的制备,文库质量检测,上机测序策略采用NovaSeq-PE250(上海派森诺生物科技股份有限公司),测序数据量保持每个样品的有效序列在6万条左右(允许单样品数据量下浮10%),最后进行数据统计分析,OTU划分和分类地位鉴定结果见图2,本发明方法测序样品的OTU数(样品1、2、3)在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)水平上均高于SDS高盐法测序样品的OTU数(样品4、5、6),由此可见,本发明方法提取得到的DNA质量更高,有利于后续PCR等分子生物学研究。
另外,在得出本发明方法之前,使用传统DNA提取的酚氯仿方法对沉积物样品进行了总DNA提取,此方法实验过程中用到的沉积物样品同实施例1,将提取得到的DNA加水溶解,经1%琼脂糖凝胶电泳检测(样品7,8),结果见图3,可见,使用酚氯仿方法提取所得DNA几乎不能分辨出条带,不能提取得到沉积物样品的高质量DNA。
综合上述测定结果可以看出,本发明方法可成功提取高质量DNA,且有利于进行后续分子生物学研究,说明本发明适用于海洋贝类生物沉积物中微生物总DNA的提取。
当然,以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)样品的洗涤:依次使用洗涤溶液1、洗涤溶液2、洗涤溶液3对沉积物进行涡旋洗涤;
(2)细菌细胞溶解:在经过洗涤处理后的沉积物中加入提取缓冲液,混匀后将其浸入液氮中,使沉积混合物完全冻结,50-60℃水浴解冻,重复此冻融过程数次,加入溶菌酶,37℃水浴保温,加入SDS与蛋白酶K,50-60℃水浴保温;
(3)总DNA提取纯化:将经过上述处理后的沉积物进行涡流悬浮,添加0.4-0.6倍体积的NaCl溶液混合均匀,添加0.9-1.1倍体积的氯仿-异戊醇混合液萃取,离心取上清,重复此萃取步骤,直到上清液清澈为止;加入0.5-0.7倍体积的异丙醇并混匀,室温静置,离心弃上清;加入冰乙醇并涡旋,离心弃上清,待乙醇挥发后,加入无菌超纯水溶解沉淀,即为DNA提取液。
2.根据权利要求1所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(1)中洗涤溶液1的成分是50mM Tris-HCl:200mM NaCl:5mM Na2-EDTA:0.05%TritionX-100:1%CTAB:1%PVP,洗涤溶液2的成分是50mM Tris-HCl:200mM NaCl:5mMNa2-EDTA:1%CTAB:1%PVP,洗涤溶液3的成分是10mM Tris-HCl:0.1mM Na2-EDTA:1%CTAB:1%PVP,三种溶液所用Tris-HCl的pH为8.3。
3.根据权利要求1所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(2)中提取缓冲液的成分是100mM Tris-HCl:100mM Na2-EDTA:100mM Na3PO4:1.5M NaCl:1%CTAB:1%PVP,其中所用Tris-HCl的pH为8.0,Na3PO4的pH为8.0。
4.根据权利要求1所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(2)中溶菌酶浓度为100mg/ml,SDS的质量分数为20%,蛋白酶K的TE缓冲液溶液浓度为20mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(3)中NaCl溶液浓度为4.5M,氯仿-异戊醇混合液的体积比为24:1。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(1)中涡旋条件为涡旋震荡2min,12000rpm离心7min后,弃上清。
7.根据权利要求6所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(2)中使用液氮冻融2次,溶菌酶保温20-30min,蛋白酶K保温2-2.5h。
8.根据权利要求6所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(3)中氯仿-异戊醇混合液萃取条件为轻微摇动萃取15min,12000rpm离心5min,取上清。
9.根据权利要求6所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(3)中异丙醇萃取条件为室温静置15min,12000rpm离心15min,弃上清。
10.根据权利要求6所述的一种海洋贝类生物沉积物总DNA的高效提取方法,其特征在于,所述步骤(3)中冰乙醇萃取条件为涡旋震荡,12000rpm离心15min,弃上清。
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