CN103266106A - 一种高含腐殖质的河口底泥总dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高含腐殖质河口底泥总DNA的提取方法。用无菌生理盐水洗涤底泥，去除部分腐殖质等杂质，同时对微生物起浓缩作用；再利用CTAB、蛋白酶K和溶菌酶在液氮和65℃水浴中反复冻融，使细胞破壁，然后加SDS在65℃水浴中保温2h，以结合蛋白质；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，去除蛋白质；加等体积异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤沉淀，晾干后，用TE(pH8.0)溶解DNA；加3倍体积的无水乙醇重新沉淀DNA，70％乙醇洗涤沉淀，晾干后，用TE溶解沉淀DNA，储存在-20℃下备用。本发明的方法操作简单、价格便宜；用本发明的方法提取的河口底泥总DNA具有纯度高和生物多样性完整的优点，可以用于分子生物学研究和微生物多样性分析。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物学和分子生物学技术领域，具体阐述一种高含腐殖质河口底泥总DNA提取的高效方法。
背景技术
河口底泥与陆地表面土壤一样，都含有丰富的微生物，但这些微生物绝大多数也都不能在实验室进行培养，因而无法开展研究工作，而近些年的宏基因组学的发展给土壤微生物的研究带来了希望。近年来关于土壤微生物DNA的提取方法有许多报道，但针对沟河底泥微生物DNA有效提取方法的相关报道极少。土壤中含有的大量腐殖质是造成土壤微生物高质量DNA提取困难的主要原因，然而沟河底泥中所含有的腐殖质等杂质更复杂，因此沟河底泥微生物高质量DNA的提取难度更大。提取的底泥微生物DNA中通常含有大量的腐殖质、色素等杂质，不能进行后续的分子生物学研究，为去除这些杂质，主要有两种做法：一种做法是在提取DNA前对底泥样品进行处理，这种方法对腐殖质含量高的底泥样品作用不大；另一种做法是用DNA特异性吸附柱纯化底泥微生物DNA，这种做法对大多数底泥样品都是有效的，但价格相对昂贵。此外，市场上有多种土壤DNA提取试剂盒，这些试剂盒不仅价格不菲，而且对腐殖质含量高的沟河底泥或土壤DNA的提取效果也不好。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从高含腐殖质河口底泥中提取高质量DNA的方法，本方法操作方便，价格低廉，克服了现有方法提取高含腐殖质河口底泥总DNA质量不高的缺陷。
本发明从高含腐殖质河口底泥中提取高质量DNA的方法，包括以下步骤：
1.底泥样品的预处理：称取10g河口底泥放入50ml离心管中，加入30ml生理盐水，涡旋振荡5min，静置2min，在4℃下先2500r/min低速离心3min，再10000r/min高速离心8min，弃上清，取沉淀的上部1/2转移到另一新的离心管中；重复上步2次，将得到1.25g底泥转移到10ml离心管中；用生理盐水洗涤底泥，在4℃下10000r/min离心8min，洗涤次数直到离心后的上清为无色透明为止。
2.底泥微生物的细胞裂解：1.25g经过预处理的底泥加2.5mL CTAB溶液，涡旋充分混匀；在液氮和65℃水浴中反复冻融3次；在37℃下摇30min。
3.DNA的分离：加10％的SDS到终浓度2％，65℃水浴保温2h，每隔15-20min颠倒混匀一次；室温12000r/min离心10min，收集上清；上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀；室温12000r/min离心10min，留上清；酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提3次；上清加等体积的异丙醇，沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清；用70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀；70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀3次，自然干燥；用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到河口底泥总DNA粗提液。
4.DNA的纯化：步骤3中DNA粗提液加3倍体积的冰冻无水乙醇，在-20℃下沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，留沉淀；沉淀用70％的冰冻乙醇洗涤2次，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀，自然干燥；用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到最终河口底泥总DNA。DNA跑0.8％的琼脂糖凝胶电泳。
5.16S rDNA的PCR：以步骤4提取的DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1387R(5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′)进行PCR，PCR产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳。
所述步骤1中生理盐水为0.85％的NaCl溶液，用4M NaOH溶液调节至pH＝9.5，121℃高压灭菌20min；所述步骤2中的CTAB溶液，由终浓度为100mM的Tris-HCl，100mM的EDTA，1.5M的NaCl，1％的CTAB，1mg/ml的溶菌酶和0.2mg/ml的蛋白酶K组成(溶菌酶和蛋白酶K用时再加入)。
本发明所具有的优点：
1.本发明对河口底泥总DNA的提取方法进行改进，提高了底泥总DNA的质量。底泥样品中提取的总DNA电泳图谱为一条线，说明DNA纯度高、杂质少，使后续的分子生物学实验变得更加容易。
2.本发明所述的河口底泥总DNA提取方法应用范围广泛，不仅适用于各种高含腐殖质的沟河底泥总DNA的提取，还适用于各种高含腐殖质的土壤总DNA的提取，更可以用于含腐殖质少的沟河底泥和土壤总DNA的提取。
3.本发明所述的河口底泥总DNA提取方法能够保持底泥微生物多样，使对底泥微生物多样的分析真实可信。
4.本发明所述的河口底泥总DNA提取方法对DNA纯化操作简单、价格低廉。
附图说明
图1为河口底泥和土壤总DNA的0.8％琼脂糖凝胶电泳图谱。编号为1、2、3的泳道分别为昌江河口底泥、赣江河口底泥和梅岭土壤的总DNA，M1为λ-Hind III digest DNA Marker，M2为1kb DNA Marker。
图2为河口底泥和土壤总DNA的16S rDNA PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图谱。编号为1、2、3的泳道分别为昌江河口底泥、赣江河口底泥和梅岭土壤总DNA的16S rDNA PCR扩增结果，M3为DL2000DNA Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
利用本发明所述方法提取昌江河口底泥总DNA。昌江河口底泥来自昌江与乐安河交汇处的上游200m处西侧，取上层0-3cm的底泥作为样品，该底泥样品呈灰黑色，腐殖质含量高。以下为具体实施步骤：
1.底泥样品的预处理：称取10g河口底泥放入50ml离心管中，加入30ml生理盐水，涡旋振荡5min，静置2min，在4℃下先2500r/min低速离心3min，再10000r/min高速离心8min，弃上清，取沉淀的上部1/2转移到另一新的离心管中；重复上步2次，将得到1.25g底泥转移到10ml离心管中；用生理盐水洗涤底泥，在4℃下10000r/min离心8min，洗涤次数直到离心后的上清为无色透明为止。
2.底泥微生物的细胞裂解：1.25g经过预处理的底泥加2.5mL CTAB溶液，涡旋充分混匀；在液氮和65℃水浴中反复冻融3次；在37℃下摇30min。
3.DNA的分离：加10％的SDS到终浓度2％，65℃水浴保温2h，每隔15-20min颠倒混匀一次；室温12000r/min离心10min，收集上清；上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀；室温12000r/min离心10min，留上清；酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提3次；上清加等体积的异丙醇，沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清；用70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀；70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀3次，自然干燥；用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到河口底泥总DNA粗提液。
4.DNA的纯化：步骤3中DNA粗提液加3倍体积的冰冻无水乙醇，在-20℃下沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，留沉淀；沉淀用70％的冰冻乙醇洗涤2次，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀，自然干燥；用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到最终河口底泥总DNA。DNA跑0.8％的琼脂糖凝胶电泳。
5.16S rDNA的PCR：以步骤4提取的DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1387R(5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′)进行PCR，PCR产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳。PCR参数为95℃变性5min；95℃变性35s，54℃退火40s，72℃延伸100s，30个循环；72℃延伸8min。
所述步骤1中生理盐水为0.85％的NaCl溶液，用4M NaOH溶液调节至pH＝9.5，121℃高压灭菌20min；所述步骤2中的CTAB溶液，由终浓度为100mM的Tris-HCl，100mM的EDTA，1.5M的NaCl，1％的CTAB，1mg/ml的溶菌酶和0.2mg/ml的蛋白酶K组成(溶菌酶和蛋白酶K用时再加入)。
如图1所示，泳道1DNA电泳图谱条带单一清晰，无拖尾现象，说明DNA纯度高、没有断裂；如图2所示，泳道1的PCR产物电泳图谱，能够清晰的看到约1380bp的目的片断，说明利用本发明所述方法提取昌江河口底泥的总DNA质量高，可以用于后续的分子生物研究。
实施例2
利用本发明所述方法提取赣江河口底泥总DNA。赣江河口底泥来自赣江和修河交汇处的上游150m处北侧，取上层0-3cm的底泥作为样品，该底泥样品为黄色粘土，含有腐殖质，特别是色素含量高。
具体实施步骤与实施例1相同。
如图1所示，泳道2DNA电泳图谱条带单一清晰，无拖尾现象，说明DNA纯度高、没有断裂；如图2所示，泳道2的PCR产物电泳图谱，能够清晰的看到约1380bp的目的片断，说明利用本发明所述方法提取赣江河口底泥的总DNA质量高，可以用于后续的分子生物研究。
实施例3
利用本发明所述方法提取土壤总DNA。土壤来自江西省南昌市梅岭，取山上落叶腐败多的表层土壤作为样品，该土壤样品为灰黑色，含有大量腐殖质。
具体实施步骤与实施例1相同。
如图1所示，泳道3DNA电泳图谱条带单一清晰，无拖尾现象，说明DNA纯度高、没有断裂；如图2所示，泳道3的PCR产物电泳图谱，能够清晰的看到约1380bp的目的片断，说明利用本发明所述方法提取梅岭土壤的总DNA质量高，可以用于后续的分子生物研究。
Claims (4)
1.一种从高含腐殖质的河口底泥中提取总DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)底泥样品的预处理：
①称取10g河口底泥放入50ml离心管中，加入30ml生理盐水，涡旋振荡5min，静置2min，在4℃下先2500r/min低速离心3min，再10000r/min高速离心8min，弃上清，取沉淀的上部1/2转移到另一新的离心管中；
②重复上步2次，将得到1.25g底泥转移到10ml离心管中；
③用生理盐水洗涤底泥，在4℃下10000r/min离心8min，洗涤次数直到离心后的上清为无色透明为止；
(2)底泥微生物的细胞裂解：
①1.25g经过预处理的底泥加2.5mL CTAB溶液，涡旋充分混匀；
②在液氮和65℃水浴中反复冻融3次；
③在37℃下摇30min；
(3)DNA的分离：
①加10％的SDS到终浓度2％，65℃水浴保温2h，每隔15-20min颠倒混匀一次；
②室温12000r/min离心10min，收集上清；
③上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀；室温12000r/min离心10min，留上清；酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提3次；
④上清加等体积的异丙醇，沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清；
⑤用70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀；70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀3次，自然干燥；
⑥用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到河口底泥总DNA粗提液；
(4)DNA的纯化：
①步骤(3)中DNA粗提液加3倍体积的冰冻无水乙醇，在-20℃下沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，留沉淀；
②沉淀用70％的冰冻乙醇洗涤2次，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀，自然干燥；
③用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到最终河口底泥总DNA；DNA跑0.8％的琼脂糖凝胶电泳；
(5)16S rDNA的PCR：以步骤(4)提取的DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1387R(5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′)进行PCR，PCR产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)的生理盐水：0.85％的NaCl溶液，用4M NaOH溶液调节至pH＝9.5，121℃高压灭菌20min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的CTAB溶液，由终浓度为100mM的Tris-HCl，100mM的EDTA，1.5M的NaCl，1％的CTAB，1mg/ml的溶菌酶和0.2mg/ml的蛋白酶K组成(溶菌酶和蛋白酶K用时再加入)。
4.如权利要求1所述的方法在各种类型的沟河底泥和土壤总DNA提取中的应用。
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