CN102260666A

CN102260666A - 一种池塘底泥样品高纯度总dna的提取方法

Info

Publication number: CN102260666A
Application number: CN 201010183580
Authority: CN
Inventors: 周帅; 房文红; 周俊芳; 写腊月
Original assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-05-24
Publication date: 2011-11-30

Abstract

一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，涉及分子生物学技术领域，本发明首先用EDTA缓冲液和PBS缓冲液预处理池塘底泥样品，然后进行底泥总DNA的粗提取，具体为：向底泥样品中加入适量石英砂、DNA提取缓冲液和蛋白酶K，37℃于摇床震荡20～30min，再加入SDS缓冲液混匀，65℃水浴60～90min，离心取上清；用等体积的氯仿-异戊醇抽提，离心，取水相；再用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇抽提1～2次；加入冷乙醇和乙酸钠，-20℃放置2h，离心，收集DNA沉淀，经乙醇润洗后干燥，加入TE溶解，即得到池塘底泥总DNA的粗提液。本发明可用于PCR扩增、酶切和杂交等分子生物学操作。

Description

一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是池塘底泥样品总DNA的提取方法。

背景技术

池塘底泥中富含细菌、病毒、原生动物、寄生虫卵和其它微生物，其微生物多样性丰富、群落结构复杂。研究底泥微生物种群结构的时空动态变化，分析养殖池塘底泥微生态的功能变化趋势，一直具有十分重要的学术意义和应用价值。早期的微生物研究多采用传统的培养方法，主要是根据微生物的个体形态、培养特性和生理生化等特征，运用平板计数、镜检等方法进行环境微生物学研究。然而环境中能被分离培养的微生物种类只占自然界微生物总量的1％左右，通过传统方法得到的研究结果并不能真实、全面反映出养殖池塘底泥微生物的真实情况，难以获得微生物群落结构和空间分布的有关信息。

随着近十余年来分子生物学技术的日益成熟，池塘底泥的研究也得到了进一步的发展。借助分子生物学手段可以进行微生物的特异性检测，分析微生物群落的组成、结构和种群演替状况，不过开展这些研究的前提是建立高效、可靠的微生物总DNA提取方法。目前关于从土壤、水体、海洋沉积物取DNA的方法已得到较好发展，如专利CN101372689A、CN101230342A中分别介绍了土壤基因组DNA的两种提取方法，CN1824809A介绍了一种水生动物粪样细菌DNA提取试剂盒及其使用方法，和CN1584051A提出了一种分析城市污水污泥微生物群落构成的方法等。不过由于土壤、污泥等环境样品成分复杂，所含腐殖质和微生物类群存在较大的差异(如菌种的多样性、大小和丰度)，从而导致不同提取方法获得的DNA质量差异较大。对于有机质含量丰富的土壤或活性污泥样品来说，“机械破壁+酶作用”的提取方法对样品中腐植酸等杂质的去除能力有限，所得总DNA中残余的腐植酸或其它一些杂质会对后续的PCR扩增、酶切和克隆等操作造成非常大的影响。

池塘底泥样品在物理、化学性质上与土壤和活性污泥样品相比，均存在一定的异质性，微生物数量和种群分布也明显不同，所以建立简单易行并能最大限度反映池塘底泥微生物多样性的DNA提取方法成为亟待解决的问题，同时在研究中还需根据不同池塘底泥特点对DNA的提取和纯化方法加以优化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法。

本发明采用了以下技术方案：

1.池塘底泥预处理：

①称取采集的池塘底泥样品1～5g置于离心管中，8000rpm室温离心3min，弃上清；

②向离心管中加入3倍体积20mmol/L EDTA缓冲液，与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，并将此步骤重复一次；

③向离心管中加入PBS缓冲液5～15mL，该缓冲液按以下配比配制：NaCl 4g，KCl 0.1g，Na₂HPO₄ 0.72g，KH₂PO₄ 0.12g，加ddH₂O至500mL，pH7.4，与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，即样品预处理完毕；上述预处理后的样品用于后续分析；

2.粗提取池塘底泥总DNA：

①向预处理后的样品中加入0.8～3g酸洗石英砂，然后加入3～15mL的DNA提取缓冲液和10～50μL蛋白酶K 20mg/L，强力震荡5min混匀后，用摇床在37℃、225rpm条件下震荡20～30min；

②向上述样品中加入500～2000μL SDS缓冲液，于65℃水浴60～90min，每15min反复上下颠倒离心管3次，将样品摇匀；然后于8000rpm室温离心10mim，并将上清转移到干净的离心管中；

③向沉淀中加入1～5mL的DNA提取缓冲液和200～800μL SDS缓冲液，于65℃水浴10min，然后10000rpm室温离心10min，合并上清后，再重复一次；

④收集的上清中加入等体积的氯仿-异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，收集上清；

⑤收集的上清中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，收集上清，抽提1～2次；

⑥收集的上清中加入1.5倍体积的冷乙醇和0.2倍体积的乙酸钠，漩涡震荡5min，-20℃放置2h；

⑦将步骤⑥处理后的样品于12000rpm室温离心10min，弃上清，并加入100～500μL 70％乙醇，摇匀后于40℃干燥；

⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50～200μL TE缓冲液，即得到底泥总DNA的粗提液；

上述步骤①中DNA提取缓冲液为Tris 100mM，EDTA 100mM，NaCl 200mM，PVPP 1％，CTAB 2％，调pH至8.0；步骤②中SDS缓冲液为Tris 100mM，NaCl 200mM，SDS 2％，调pH至8.0；步骤④中氯仿-异戊醇体积比为24∶1；步骤⑤中苯酚-氯仿-异戊醇体积比为25∶24∶1；

如果总DNA的粗提液呈淡棕黄或淡棕黑色，则采用柱式腐殖酸清除剂对获得的DNA粗提液进行过柱纯化。

本发明具有的优点是提取底泥总DNA的方法具有针对性，技术方案简单易行，本发明通过样品预处理和总DNA粗提液去腐植酸的纯化过程，可有效去除底泥样品中的腐植酸等杂质，提取的池塘底泥样品总DNA纯度高，OD_260nm/OD_280nm可达1.57以上，可直接用于后续的PCR、酶切和杂交等分子生物学操作。本发明与割胶回收的纯化方式相比，不仅成本低，而且对操作者更安全。

附图说明

图1为采用本方法提取出的某虾蟹混养池塘底泥总DNA的琼脂糖凝胶(1％)电泳图。

图2为16S rDNA V3区基因片段琼脂糖凝胶(1％)电泳图。

具体实施方式

实例1：

1.准确称取1g底泥样品(采集自某养殖场的虾蟹混养池塘)，置于10mL灭菌离心管中，8000rpm室温离心3min，弃上清；向离心管中加入3mL 20mmol/L EDTA缓冲液，与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，重复一次；向离心管中加入PBS缓冲液5mL，混匀后再离心5min，弃上清，所得样品即可用于后续分析。其中PBS缓冲液为NaCl 4g，KCl 0.1g，Na₂HPO₄ 0.72g，KH₂PO₄ 0.12g，加ddH₂O至500mL，调溶液pH至7.4即可。

2.底泥样品总DNA的粗提取

①向预处理后的样品中加入0.8g酸洗石英砂，然后加入3mL的DNA提取缓冲液和10μL蛋白酶K(20mg/L)，强力震荡5min混匀后，在37℃、225rpm条件下用摇床震荡20min。其中DNA提取缓冲液为Tris100mM，EDTA 100mM，NaCl 200mM，PVPP 1％，CTAB 2％，调溶液pH至8.0即可。

②向上述样品中加入500μL SDS缓冲液，于65℃水浴60min，每15min反复上下颠倒离心管3次，将样品摇匀；然后于8000rpm室温离心10min，并将上清转移到新的离心管中。其中SDS缓冲液为Tris100mM，NaCl 200mM，SDS 2％，调溶液pH至8.0即可。

③向沉淀中加入1mL的DNA提取缓冲液和200μL SDS缓冲液，于65℃水浴10min，然后10000rpm室温离心10min，合并上清后，再重复一次。

④收集的上清中加入等体积的氯仿-异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，取上清，其中氯仿-异戊醇的体积比为24∶1。

⑤收集的上清中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10min，取上清，抽提1～2次，其中苯酚-氯仿-异戊醇的体积比为25∶24∶1。

⑥加入1.5倍体积的冷乙醇和0.2倍体积的乙酸钠至上清液，漩涡震荡5min，-20℃放置2h。

⑦将步骤⑥处理后的样品于12000rpm室温离心10min，弃上清，并加入100μL 70％乙醇，摇匀后于40℃干燥。

⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50～100μL TE缓冲液，即得到底泥总DNA的粗提液。

3.由于总DNA粗提液呈淡棕黄色，故采用柱式腐殖酸清除剂对获得的DNA粗提液进行过柱纯化，结果见附图1，图中从右至左依次为：泳道1是DNA marker，泳道2-5是提取出的底泥总DNA。

4.使用细菌16S rDNA V3区的通用引物，对获得的底泥总DNA进行扩增。上引物序列为5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；下引物为5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。PCR扩增反应体系：10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，25mmol/L引物各1μL，Taq酶0.2μL(250U)，DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL。反应条件为94℃预变性5min，94℃预变性60s，55℃退火60s，72℃延伸40s，30个循环，72℃延伸6min。然后用1％琼脂糖电泳检测，结果见附图2，图中从左至右依次为：泳道1是DNA marker，泳道2-5是某虾蟹混养池塘底泥总DNA为模板进行细菌16S rDNA V3区的PCR扩增产物，图谱上均出现清晰的条带，表明用本发明的方法提取的底泥总DNA样品可以直接进行PCR等后续分子生物学操作。

实例2：

1.准确称取5g底泥样品(采集自某异育银鲫、花鲢和白鲢混养池塘)，置于10mL灭菌离心管中，8000rpm室温离心3min，弃上清；向离心管中加入15mL 20mmol/L EDTA缓冲液，与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，重复一次；向离心管中加入PBS缓冲液15mL，混匀后再离心5min，弃上清，所得样品即可用于后续分析。其中PBS缓冲液为NaCl 4g，KCl 0.1g，Na₂HPO₄ 0.72g，KH₂PO₄ 0.12g，加ddH₂O至500mL，调溶液pH至7.4即可。

2.底泥样品总DNA的粗提取

①向预处理后的样品中加入3g酸洗石英砂，然后加入15mL的DNA提取缓冲液和50μL蛋白酶K(20mg/L)，强力震荡5min混匀后，在37℃、225rpm条件下用摇床震荡30min。其中DNA提取缓冲液为Tris100mM，EDTA 100mM，NaCl 200mM，PVPP 1％，CTAB 2％，调溶液pH至8.0即可。

②向上述样品中加入2mL SDS缓冲液，于65℃水浴90min，每15min反复上下颠倒离心管3次，将样品摇匀；然后于8000rpm室温离心10min，并将上清转移到新的离心管中。其中SDS缓冲液为Tris100mM，NaCl 200mM，SDS 2％，调溶液pH至8.0即可。

③向沉淀中加入5mL的DNA提取缓冲液和800μL SDS缓冲液，于65℃水浴10min，然后10000rpm室温离心10min，合并上清后，再重复一次。

⑤收集的上清中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇进行抽提，12000rpm室温离心10mim，取上清，抽提1～2次，，其中苯酚-氯仿-异戊醇的体积比为25∶24∶1。

⑦将步骤⑥处理后的样品于12000rpm室温离心10min，弃上清，并加入500μL 70％乙醇，摇匀后于40℃干燥。

⑧向干燥后的DNA沉淀中加入100～200μL TE缓冲液，即得到底泥总DNA的粗提液。

序列表

<110>中国水产科学研究院东海水产研究所

<120>一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法

<140>201010183580.4

<141>2010-05-24

<160>2

<210>1

<211>57

<212>DNA

<213>细菌(Bacteria)

<400>1

-CGCCCGCCGC GCGCGGCGGG CGGGGCGGGG GCACGGGGGG

CCTACGGGAG GCAGCAG-

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>细菌(Bacteria)

<400>2

-ATTACCGCGG CTGCTGG-

Claims

1.一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，包含池塘底泥的预处理、总DNA的粗提取和DNA粗提液的纯化，其特征在于池塘底泥预处理按以下步骤进行：

③向离心管中加入PBS缓冲液5～15mL与样品充分混匀，于8000rpm室温离心5min，弃上清，即样品预处理完毕；上述预处理后的样品用于后续分析；

粗提取池塘底泥总DNA按以下步骤进行：

②向上述样品中加入500～2000μL SDS缓冲液，于65℃水浴60～90min，每15min反复上下颠倒离心管3次，将样品摇匀；然后于8000rpm室温离心10min，并将上清转移到干净的离心管中；

⑧向干燥后的DNA沉淀中加入50～200μL TE缓冲液，即得到底泥总DNA的粗提液。

2.按权利要求1所述的一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，其特征在于用柱式腐殖酸清除剂对获得的呈现淡棕黄或淡棕黑色的DNA粗提液进行过柱纯化。

3.按权利要求1所述的一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，其特征在于PBS缓冲液为NaCl 4g，KCl 0.1g，Na₂HPO₄ 0.72g，KH₂PO₄ 0.12g，加ddH₂O至500mL，调pH至7.4。

4.按权利要求1所述的一种池塘底泥样品高纯度总DNA的提取方法，其特征在于所述DNA提取液为Tris 100mM，EDTA 100mM，NaCl 200mM，PVPP 1％，CTAB 2％，调pH至8.0；所述SDS缓冲液为Tris 100mM，NaCl 200mM，SDS 2％，调pH至8.0；所述氯仿-异戊醇和苯酚-氯仿-异戊醇体积分别为24∶1和25∶24∶1。