CN104087573B - 一种水培液中微生物基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，属于生物技术领域。本发明的提取方法先将水培液中的杂质通过定性滤纸进行过滤去除，进一步0.22μm的滤膜收集水体微生物，用液氮/65℃水浴的冻融方法破碎微生物细胞，再加入SDS及溶菌酶裂解细胞，CTAB结合蛋白质及多聚糖、游离核酸，加入酚、氯仿混合物萃取后，萃取液用异丙醇沉淀，最终获得水体微生物基因组DNA。利用该方法提取的核酸纯度较高，且产量较高。试验证明，此法提取的水体微生物DNA，完整性好，纯度较高，进一步纯化后可用于下游的基因组文库构建、qPCR、高通量测序等。
Description
技术领域
本发明涉及一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
水培种植法作为无土栽培的重要形式，具有节肥、节水、省工、省药、高产、优质、洁净等优点。由于其不受时间限制，可供植物利用的营养充分、均匀等优点，因而在现代农业设施生产过程中逐渐被大范围采用。在这些水培种植系统中，微生物也广泛存在于水培液中，这些微生物能够对溶液中的矿质营养元素以及植物根系释放的次生物质进行转化，在植物与矿质养分之间起到了重要的媒介作用，因而是水培种植条件下，植物能够正常生长发育的重要因子。因此，研究水培液中微生物的结构组成与数量分布，能够为优化植物的最佳水培种植条件提供重要基础。然而，由于传统的微生物研究方法存在着无法获得环境中全部微生物的限制因素，由此导致对相应环境中微生物遗传背景信息的了解也不全面，从而也限制了水体微生物宏基因组信息的深入发掘。利用现代生物技术，如高通量测序技术，以及基于PCR的末端限制性长度态性(T-RFLP)技术、单链构型多态性(SSCP)、变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)技术，长度多态性(AFLP)技术则克服了传统培养方法所造成的土壤微生物信息大量丢失的弊端，更加全面、精确地揭示出水体微生物群落结构和功能的多样性。
对于此，如何简便快捷地从水培液中获得微生物的DNA是深入研究水培液中微生物组成的关键，由于水培液的相对体积大，微生物分布分散，直接提取往往会因为样品初始体积、微生物数量低而导致提取效率低下，因此需要研制适用于水体微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法，解决使用常规方法所获得的微生物总量少、细胞裂解率低、DNA产量低的问题。
发明内容
本发明提供一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，利用该方法提取的核酸纯度较高，且产量较高。
一种水培液微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)水体样品杂质的去除：取100~250ml的水培液用定性滤纸过滤3~5次，并收集滤液；进一步用孔径为0.22μm的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于10ml的离心管中；
(2)水体微生物细胞裂解：往步骤（1）10ml的离心管中加入500μl无菌水，漩涡震荡，然后在液氮2~3min和65℃水浴5min中反复冻融3~5次，冻融结束后，于4℃13000rpm下离心10min，弃上清，收集沉淀，加入100μl1×TE，重悬沉淀，加入30μl50mg/ml的溶菌酶，37℃温浴1~3h，再加入500μl的10%SDS，以及10ul20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1~2h；
(3)核酸游离及沉淀：步骤（2）温浴结束后加入200μl5M的NaCl，加入100μl65℃预热的3×CTAB/NaCl，65℃温浴1h，待冷却后，加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体积比为（1:1），4℃11000rpm离心10min，取上清，再加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体积比为（1:1），4℃11000rpm离心10min，将上清移至新管并加入等体积预冷的异丙醇，-20℃放置1h，然后4℃11000rpm离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇重悬并于4℃11000rpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30~50ul的无菌水中，-80℃保存。
所述水培液微生物基因组DNA的提取方法，优选的步骤如下：
(1)水体样品杂质的去除：取100ml的水溶液用定性滤纸重复过滤3次，以去除水体中含有的杂质，并收集滤液；进一步用孔径为0.22μm的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于10ml的离心管中。
水体微生物细胞裂解：往离心管中加入500μl无菌水，漩涡震荡，液氮冻2min后置于65℃水浴锅中温浴5min，如此反复冻融3次。冻融结束后，样品于4℃13000rpm下离心10min，弃上清，收集沉淀。加入100μl1×TE，重悬沉淀。加入30μl50mg/ml的溶菌酶，37℃温浴1h。加入500μl的10%SDS，以及10ul20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1h。
核酸游离及沉淀：加入200μl5M的NaCl，加入100μl65℃预热的3×CTAB/NaCl，65℃温浴1h。待冷却后，加入等体积酚氯仿，酚、氯仿的体积比为（1:1），4℃11000rpm离心10min，取上清，再加入等体积的酚氯仿，4℃11000rpm离心10min，将上清移至新管。加入等体积的预冷异丙醇，-20℃放置1h，4℃11000rpm离心20min，弃上清。沉淀用70%乙醇于4℃11000rpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30ul的无菌水中。
本发明的提取方法先将水培液中的杂质通过定性滤纸进行过滤去除，进一步0.22μm的滤膜收集水体微生物，用液氮/65℃水浴的冻融方法破碎微生物细胞，再加入SDS及溶菌酶裂解细胞，CTAB结合蛋白质及多聚糖、游离核酸，加入酚、氯仿混合物萃取后，萃取液用异丙醇沉淀，最终获得水体微生物基因组DNA。所得的核酸的纯度可达1.758，浓度达15.3μg/μl。对提取的DNA进行纯化，可进行16srDNA的扩增和荧光定量PCR分析，结果见图3、4、5，证实本发明的方法提取水体微生物DNA的有效性。反复试验证明，此法提取的水体微生物DNA，完整性好，纯度较高，进一步纯化后可用于下游的基因组文库构建、qPCR、高通量测序等。
本发明的显著优点：
1.适合于不同来源的水培液以及水体，具有广谱适用性。
2.所得的DNA完整性好、纯度较高。
3.提取便捷、无需复杂的处理工艺，提取的条件不严格。
附图说明
图1为不同水稻水培液中微生物DNA的电泳检测结果，其中1-4泳道为水稻品种Lemont水培液中的微生物DNA;5-8为水稻品种PI312777水培液中的微生物DNA。
图2为稗草水培液中水体微生物DNA的电泳检测结果，其中1-3泳道为稗草的酚酸水培液中的微生物DNA;4-6为稗草的萜类水培液中的微生物DNA。
图3为以水培液微生物DNA为模板进行16srDNA的PCR扩增产物电泳检测结果，其中1表示以水稻品种Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，2表示以水稻品种PI312777水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，3表示100bpDNAMarker，4表示以稗草Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物。
图4为以水稻水培液微生物DNA为模板进行16srDNA的定量PCR检测结果。
图4（1）表示定量PCR的扩增曲线。
图4(2)表示定量PCR的熔解曲线。
图5为以水稻水培液微生物DNA为模板进行ITS的定量PCR检测结果。
图5（1）表示定量PCR的扩增曲线。
图5(2)表示定量PCR的熔解曲线。
具体实施方式
实施例1
本发明的水培液微生物基因组DNA的提取方法，具体步骤如下：
(1)原料：水稻的水培液，来自福建福州（福建农林大学教学农场）；
(2)水体样品杂质的去除：取100ml的水稻水溶液用定性滤纸进行过滤，以去除水体中含有的杂质，重复过滤3次，收集滤液；进一步用孔径为0.22μm的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于10ml的离心管中，用于提取基因组DNA。
(3)水体微生物细胞裂解：往离心管中加入500μl无菌水，漩涡震荡，液氮冻2min后置于65℃水浴锅中温浴5min，如此反复冻融3次。冻融结束后，样品于4℃13000rpm下离心10min，弃上清，收集沉淀。加入100μl1×TE，重悬沉淀。加入30μl50mg/ml的溶菌酶，37℃温浴1h。加入500μl的10%SDS，以及10ul20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1h。
(4)核酸游离及沉淀：加入200μl5M的NaCl，加入100μl65℃预热的CTAB/NaCl(3×)，65℃温浴1h。待冷却后，加入等体积酚氯仿，4℃11000rpm离心10min，取上清，再加入等体积的酚氯仿，4℃11000rpm离心10min，将上清移至新管。加入等体积的预冷异丙醇，-20℃放置1h，4℃11000rpm离心20min，弃上清。沉淀用70%乙醇于4℃11000rpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30ul的无菌水中。取5μlDNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。检测结果见图1，其中1-4泳道均为水稻品种Lemont水培液中的微生物DNA;5-8均为水稻品种PI312777水培液中的微生物DNA，从图中可见各个泳道中的DNA条带清晰，条带亮度，泳道中的杂质背景淡，重复性好，提取效果佳。以此DNA模板，利用qPCR对细菌、真菌的数量进行检测，其中细菌16srDNA的qPCR扩增曲线见图4(1)，图中A箭头指示以水稻品种PI312777水培液DNA为模板进行qPCR的扩增曲线，B箭头指示以水稻品种Lemont水培液DNA为模板进行qPCR的扩增曲线，两种DNA模板的扩增过程中CT值重复性好。图4(2)表示细菌16srDNA熔解曲线，箭头C指示16srDNA熔解曲线形成的峰。真菌ITS的qPCR扩增曲线见图5(1)，图中D箭头指示以水稻品种PI312777水培液DNA为模板进行qPCR的扩增曲线，E箭头指示以水稻品种Lemont水培液DNA为模板进行qPCR的扩增曲线，两种DNA模板的扩增过程中CT值重复性好。图5(2)表示细菌ITS熔解曲线，箭头F指示ITS熔解曲线形成的峰。从图中可以看出各熔解曲线主峰单一，并明显高于基线。上述试验结果表明运用此方法提取得到的DNA能够用于下游的试验，进一步对水培液中的微生物数量进行计算，结果显示每毫升PI312777水培液中约有细菌1200个，真菌1465个；每毫升Lemont水培液中约有细菌490个，真菌190个。
实施例2
(1)原料：稗草的水培液，来自福建福州（福建农林大学教学农场）；
(2)水体样品杂质的去除：取100ml的稗草水溶液用定性滤纸进行过滤，以去除水体中含有的杂质，重复过滤3次，收集滤液；进一步用孔径为0.22μm的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于10ml的离心管中，用于提取基因组DNA。
(3)水体微生物细胞裂解：往离心管中加入500μl无菌水，漩涡震荡，液氮冻2min后置于65℃水浴锅中温浴5min，如此反复冻融3次。冻融结束后，样品于4℃13000rpm下离心10min，弃上清，收集沉淀。加入100μl1×TE，重悬沉淀。加入30μl50mg/ml的溶菌酶，37℃温浴1h。加入500μl的10%SDS，以及10ul20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1h。
(4)核酸游离及沉淀：加入200μl5M的NaCl，加入100μl65℃预热的CTAB/NaCl(3×)，65℃温浴1h。待冷却后，加入等体积酚氯仿，4℃11000rpm离心10min，取上清，再加入等体积的酚氯仿，4℃11000rpm离心10min，将上清移至新管。加入等体积的预冷异丙醇，-20℃放置1h，4℃11000rpm离心20min，弃上清。沉淀用70%乙醇于4℃11000rpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30ul的无菌水中。取5μlDNA水溶液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。检测结果见图2，其中1-3泳道为稗草的酚酸水培液中的微生物DNA;4-6为稗草的萜类水培液中的微生物DNA，从图中可见DNA的条带清晰，条带亮度，泳道中的杂质背景淡，重复性好，提取效果佳。以此DNA模板，利用qPCR对其中粘细菌的数量进行检测，结果显示稗草的酚酸水培液中每毫升最高含有粘细菌800个，稗草的萜类水培液中每毫升最高含有粘细菌260个。
此外，分别以实例1、实例2中的水稻品种PI312777、Lemont以及稗草水培液中微生物的DNA为模板进行细菌16srDNA的PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3，其中泳道1是以水稻品种Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，泳道2是以水稻品种PI312777水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，泳道是4以稗草Lemont水培液中的微生物DNA为模板的PCR扩增产物，从图中可以看出16srDNA条带清晰，亮度高，此结果再次说明了运用此方法提取得到的DNA能够用于下游的试验。
Claims (1)
1.一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：
(1)水体样品杂质的去除：取100~250ml的水培液用定性滤纸过滤3~5次，并收集滤液；进一步用孔径为0.22μm的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于10ml的离心管中；
(2)水体微生物细胞裂解：往步骤（1）10ml的离心管中加入500μl无菌水，漩涡震荡，然后在液氮2~3min和65℃水浴5min中反复冻融3~5次，冻融结束后，于4℃13000rpm下离心10min，弃上清，收集沉淀，加入100μl1×TE，重悬沉淀，加入30μl50mg/ml的溶菌酶，37℃温浴1~3h，再加入500μl的10%SDS，以及10μl20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1~2h；
(3)核酸游离及沉淀：步骤（2）温浴结束后加入200μl5M的NaCl，加入100μl65℃预热的3×CTAB/NaCl，65℃温浴1h，待冷却后，加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体积比为1:1，4℃11000rpm离心10min，取上清，再加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体积比1:1，4℃11000rpm离心10min，将上清移至新管并加入等体积预冷的异丙醇，-20℃放置1h，然后4℃11000rpm离心20min，弃上清，沉淀用70%乙醇重悬并于4℃11000rpm下离心10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30~50μl的无菌水中，-80℃保存。
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