CN106047869A - 一种海水微生物宏基因组的提取方法 - Google Patents
一种海水微生物宏基因组的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106047869A CN106047869A CN201610706216.9A CN201610706216A CN106047869A CN 106047869 A CN106047869 A CN 106047869A CN 201610706216 A CN201610706216 A CN 201610706216A CN 106047869 A CN106047869 A CN 106047869A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- seawater
- centrifuged
- sea water
- mmol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013535 sea water Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 9
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 6
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 5
- -1 saline ions Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 abstract 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 abstract 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 abstract 1
- 238000011070 membrane recovery Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种海水微生物宏基因组的提法方法。本发明针对海水这一特殊的样本给予去盐离子处理、双重滤膜过滤再回收处理相结合，旨在提供一种高效、快速的提取海水微生物宏基因组的方法，具体包括以下几个步骤：海水中杂质的去除、海水微生物的裂解、DNA的游离与吸附、DNA洗脱。本发明能够有效的去除海水中较多的盐离子的干扰；充分裂解海水中的微生物细胞，使DNA充分释放。本发明方法提取的DNA，其A260/280比值维持在1.8‑2.0之间，所得DNA质量好、纯度高；能够满足基因文库构建和qPCR以及高通量测序的需求，为研究微生物基因组遗传变异多样性提供了良好的基础。
Description
技术领域
本发明提供一种海水微生物宏基因组的提取方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
海水微生物是生物活性物质的重要源泉。海洋环境的特殊性以及海洋生物物种间复杂的相互作用赋予了海洋微生物有别于陆生生物的新陈代谢途径和适应机制，从而产生新的遗传特异性，合成结构独特、具有特定生物活性的次级代谢产物。这些结构异常、作用特殊的活性物质是陆栖微生物所无法比拟的。20世纪以来，人们一直采用分离培养的方法来研究海水微生物的多样性。即将海水微生物从环境中分离纯化，然后通过实验室培养的手段进行后续的研究。
然而随着研究的深入，发现很多微生物不能够培养繁殖，给进一步的分子生物学研究提出了新的难题。但近年来分子生物学手段的飞速发展使海洋微生物的研究进入了新的领域，摆脱了对传统培养技术的依赖。特别是新一代测序技术的兴起，使微生物基因组的研究延伸到了前所未有的领域。二代测序特别适合微生物实验室，因其基因组小，且数据分析相对简单；与其他实验室方法相比极具吸引力。序列检测的结果可直接关联到基因组位点，有利于分析该位点可能带来的生物学影响；另外，我们能够测定基因组中的单个碱基的变化，以追踪微生物在短期内对环境的适应性。例如，全球流行病的蔓延往往需要几年的时间来追踪，有了单碱基分辨率的细菌基因组新一代测序，有望在几周内快读追溯到局部地区人群、医院甚至家庭中的流行病原因。而提取海水微生物DNA是开展关于海水微生物研究、开发、利用的基础。但海水微生物含有大量的无机盐离子、无机化合物及有机化合物、重金属离子等干扰提取反应进行的杂质。且不同水域的海水微生物种类不同，这都为从海水微生物群中提取DNA带来了困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、快速的海水微生物宏基因组的提法方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种海水微生物宏基因组的提法方法，包括海水中杂质的去除、海水微生物的裂解、DNA的游离与吸附、DNA洗脱等步骤。所述海水微生物宏基因组的提取步骤如下：
（1）海水中杂质的去除：海水样本中按照2% 的质量体积比加入α-纤维素，常温下，静置0.5 h；将0.8 um的滤膜安装于已灭菌的过滤器上，连接好负压泵，将海水样本倒入过滤器上方，打开负压泵电源，执行过滤；然后更换0.2 um的滤膜对滤液进行再次过滤；把两种滤膜都进行收集；将回收的滤膜迅速置于液氮中冻存1 min，然后置于室温下90 s，如此反复冻融5次；
（2）海水微生物的裂解：将滤膜剪碎置于5 ml离心管中，再加入250 μl细胞裂解液、40μl浓度为20 mg/ml的溶菌酶以及10 μl浓度为2 mmol/L的EDTA；将反应液置于56 ℃水浴锅中孵育10 min，期间每隔5 min震荡一次；然后把样品放入均质分散机中，设定程序5 min、120000 g离心15 min；取上清至干净的2 ml离心管中；
（3）DNA的游离与吸附：往上清液中加入250 μl浓度为10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用枪头混匀；12000 0g离心5 min，然后小心取上清至新的2 ml离心管中；往离心管中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1进行抽提；14000 g离心3 min，将上清转移至吸附柱中；将吸附柱置于离心管中，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；
（4）DNA洗脱：往离心柱中加入70%的乙醇750 μl，然后12000 g离心3 min，弃收集管中的废液；再次加入等体积的70%乙醇，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；然后加入成分为10 mmol/L的Tris-Cl、1 mmol/L的EDTA、pH=8.0的DNA洗脱液80 μl；14000 g离心5min，收集离心管中的DNA洗脱液，测定浓度。
本发明的优点在于：
首先，有效去除了盐离子等杂质干扰并提高了DNA的浓度。本发明针对海水这一特殊的样本，给予去盐离子处理、双重滤膜过滤再回收处理两步结合的方法，旨在提供一种高效、快速的提取海水微生物宏基因组的方法。采取两步结合法一方面能够有效的去除海水中较多的盐离子的干扰，使DNA的A260/280的纯度维持在1.8-2.0之间。另一方面双重过滤双回收能够浓缩样本浓度达到加快实验速率以及最大限度的提高DNA浓度的效果。盐离子的处理是在海水中加入2%的α-纤维素；α-纤维素能够有效的与海水中CaCO3、Mg（OH）2等悬浮的杂质颗粒交联，形成较大的凝体而沉淀从而避免海水中杂质的影响。
其次，本发明将海水微生物细胞充分裂解，DNA得以释放。此外由于海水微生物和其他物质种类繁多，不仅含有革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌还有真菌、噬菌体、病菌等。如何有效且充分的将其裂解，释放出DNA物质是关键。本实验采用冻融法和酶溶法相结合的处理方式，一方面能够有效的避免采用机械处理方式带来的非专一性，碎片破碎大小不一的缺点。另一方面由于使用滤膜过滤时，传统的方法要求必须置于-80 ℃过夜，使得实验耗时长；采用冻融法后一方面能够直接处理样本，减少-80 ℃过夜的繁琐步骤，此外能够在一定程度上破碎细胞，提高后续抽提的效率和收率。在裂解细胞壁的时候，传统的方法一般仅仅使用溶菌酶；本发明中使用的溶菌酶需和EDTA混合使用，一方面溶菌酶能够有效的裂解革兰氏阳性菌细胞壁，但是对革兰氏阴性菌裂解效果较差，必须加螯合剂才能将革兰氏阴性菌细胞壁有效的破除。通过这样的组合可以同时破除两种细胞壁，简单有效。
具体实施方式
图1为不同海水样本基因组的16S rDNA的V3-V4区PCR扩增电泳图。其中M泳道为DNA Marker；H1-H4分别为不同海水样本基因组模板的PCR产物。
实施例
一种海水微生物宏基因组的提取方法，首先取得海水样本并进行预处理，然后提取其微生物宏基因组。具体的步骤包括：
（1）海水中杂质的去除：海水样本中按照2% 的质量体积比加入α-纤维素，常温下，静置0.5 h；将0.8 um的滤膜安装于已灭菌的过滤器上，连接好负压泵，将海水样本倒入过滤器上方，打开负压泵电源，执行过滤；然后更换0.2 um的滤膜对滤液进行再次过滤；把两种滤膜都进行收集；将回收的滤膜迅速置于液氮中冻存1min，然后置于室温下90 s，如此反复冻融5次；
（2）海水微生物的裂解：将滤膜剪碎置于5 ml离心管中，再加入250 μl细胞裂解液、40μl浓度为20 mg/ml的溶菌酶以及10 μl浓度为2 mmol/L的EDTA；将反应液置于56℃水浴锅中孵育10 min，期间每隔5 min震荡一次；然后把样品放入均质分散机中，设定程序5 min、120000 g离心15 min；取上清至干净的2 ml离心管中；
（3）DNA的游离与吸附：往上清液中加入250 μl浓度为10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用枪头混匀；120000 g离心5 min，然后小心取上清至新的2 ml离心管中；往离心管中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1进行抽提；14000 g离心3 min，将上清转移至吸附柱中；将吸附柱置于离心管中，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；
（4）DNA洗脱：往离心柱中加入70%的乙醇750 μl，然后12000 g离心3 min，弃收集管中的废液；再次加入等体积的70%乙醇，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；然后加入成分为10 mmol/L的Tris-Cl、1 mmol/L的EDTA、pH=8.0的DNA洗脱液80 μl；14000 g离心5min，收集离心管中的DNA洗脱液，测定浓度。
将提取所得DNA洗脱液使用Nanodrop 2000测定的DNA浓度，本发明（试验组）与常规方法（对照组）提取海水微生物宏基因组的效果分别如表1所示。从表1可以看出按照本发明方法提取的DNA浓度高于常规方法提取所得基因组浓度，可满足测序、PCR反应等分子生物学操作的浓度要求；其次，A260/280的比值均位于1.8-2.0范围内，说明本发明提取所得DNA纯度高，表明本发明提取海水微生物宏基因组提取率高且提取提取效果良好。
表1 两种方法提取海水微生物宏基因组效果对比
以所提宏基因组DNA洗脱液为模板进行PCR反应扩增16s rDNA V3-V4区，并进行琼脂糖凝胶电泳验证，排除其他动植物的干扰。其中16S rDNA V3-V4引物为：
319F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'
806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'
以上述两组基因组为模板进行PCR扩增，所得16S rDNA V3-V4片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证结果见图1。图1显示试验组PCR扩增产物条带单一、长度符合预期值且条带比对照组亮，说明PCR过程特异性高、扩增效果好，满足后续分子生物学研究使用。试验组的PCR效果也更优于对照组。该结果进一步论证了本发明达到了理想的技术效果。
所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门基源医疗科技有限公司
<120> 一种海水微生物宏基因组的提取方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actcctacgg gaggcagcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggactachvg ggtwtctaat 20
Claims (3)
1.一种海水微生物宏基因组的提法方法，其特征在于：所述提取方法包括如下步骤：海水中杂质的去除、海水微生物的裂解、DNA的游离与吸附、DNA洗脱。
2.根据权利要求1所述的一种海水微生物宏基因组的提法方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）海水中杂质的去除：海水样本中按照2 % 的质量体积比加入α-纤维素，常温下，静置0.5 h；将0.8 um的滤膜安装于已灭菌的过滤器上，连接好负压泵，将海水样本倒入过滤器上方，打开负压泵电源，执行过滤；然后更换0.2 um的滤膜对滤液进行再次过滤；把两种滤膜都进行收集；将回收的滤膜迅速置于液氮中冻存1 min，然后置于室温下90 s，如此反复冻融5次；
（2）海水微生物的裂解：将滤膜剪碎置于5 ml离心管中，再加入250 μl细胞裂解液、40μl浓度为20 mg/ml的溶菌酶以及10 μl浓度为2 mmol/L的EDTA；将反应液置于56 ℃水浴锅中孵育10 min，期间每隔5 min震荡一次；然后把样品放入均质分散机中，设定程序5 min、120000 g离心15 min；取上清至干净的2 ml离心管中；
（3）DNA的游离与吸附：往上清液中加入250 μl浓度为10 mg/kg的蛋白酶k溶液，用枪头混匀；120000g离心5min，然后小心取上清至新的2 ml离心管中；往离心管中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇=25:24:1进行抽提；14000 g离心3 min，将上清转移至吸附柱中；将吸附柱置于离心管中，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；
（4）DNA洗脱：往离心柱中加入70%的乙醇750 μl，然后12000 g离心3 min，弃收集管中的废液；再次加入等体积的70%乙醇，14000 g离心5 min，弃掉收集管中的废液；然后加入成分为10 mmol/L的Tris-Cl、1 mmol/L的EDTA、pH=8.0的DNA洗脱液80 μl；14000 g离心5min，收集离心管中的DNA洗脱液，测定浓度。
3.根据权利要求2所述的一种海水微生物宏基因组的提法方法，其特征在于：所述细胞裂解液成分为：150 mmol/L NaCl、1% vol的NP-40、0.5% w/v的脱氧胆酸钠、0.1% w/v的SDS和50 mmol/L的Tris，pH=8.0。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610706216.9A CN106047869B (zh) | 2016-08-23 | 2016-08-23 | 一种海水微生物宏基因组的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610706216.9A CN106047869B (zh) | 2016-08-23 | 2016-08-23 | 一种海水微生物宏基因组的提取方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106047869A true CN106047869A (zh) | 2016-10-26 |
| CN106047869B CN106047869B (zh) | 2019-05-24 |
Family
ID=57195394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610706216.9A Active CN106047869B (zh) | 2016-08-23 | 2016-08-23 | 一种海水微生物宏基因组的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106047869B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109852532A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-07 | 中国科学院深海科学与工程研究所 | 一种全海深微生物核酸原位提取装置 |
| CN111394348A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-10 | 南华大学 | 污水中游离态dna的提取及检测方法 |
| CN114561378A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-05-31 | 华中农业大学 | 一种提取蟹稻共生模式下水体环境基因组dna的方法 |
| CN114921573A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-08-19 | 集美大学 | 一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1718738A (zh) * | 2005-06-28 | 2006-01-11 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组dna和总rna的方法 |
| CN1763225A (zh) * | 2005-09-01 | 2006-04-26 | 上海交通大学 | 海绵共附生优势细菌组成及宿主特异菌的分子鉴定方法 |
| CN101314773A (zh) * | 2008-05-21 | 2008-12-03 | 中国科学技术大学 | 一种近海环境微生物高纯度大片段基因组的制备方法 |
| CN102229926A (zh) * | 2011-05-24 | 2011-11-02 | 南开大学 | 河流环境样品中微生物dna的简易提取 |
| CN102477436A (zh) * | 2010-11-29 | 2012-05-30 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一株产新结构镇痛作用单吲哚化合物的大肠杆菌工程菌5c11及其含的深海宏基因组基因簇 |
| CN103266106A (zh) * | 2013-06-04 | 2013-08-28 | 江西省科学院生物资源研究所 | 一种高含腐殖质的河口底泥总dna提取方法 |
| CN103333883A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-10-02 | 内蒙古科技大学 | 一种高效提取用于pcr扩增的地下水微生物dna的方法 |
| CN104946740A (zh) * | 2015-05-07 | 2015-09-30 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 一种海洋褐潮生物群落结构的检测方法 |
| CN107418952A (zh) * | 2017-09-11 | 2017-12-01 | 广东美格基因科技有限公司 | 一种土壤微生物宏基因组dna的提取方法及相应的试剂盒 |
-
2016
- 2016-08-23 CN CN201610706216.9A patent/CN106047869B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1718738A (zh) * | 2005-06-28 | 2006-01-11 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组dna和总rna的方法 |
| CN1763225A (zh) * | 2005-09-01 | 2006-04-26 | 上海交通大学 | 海绵共附生优势细菌组成及宿主特异菌的分子鉴定方法 |
| CN101314773A (zh) * | 2008-05-21 | 2008-12-03 | 中国科学技术大学 | 一种近海环境微生物高纯度大片段基因组的制备方法 |
| CN102477436A (zh) * | 2010-11-29 | 2012-05-30 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 一株产新结构镇痛作用单吲哚化合物的大肠杆菌工程菌5c11及其含的深海宏基因组基因簇 |
| CN102229926A (zh) * | 2011-05-24 | 2011-11-02 | 南开大学 | 河流环境样品中微生物dna的简易提取 |
| CN103266106A (zh) * | 2013-06-04 | 2013-08-28 | 江西省科学院生物资源研究所 | 一种高含腐殖质的河口底泥总dna提取方法 |
| CN103333883A (zh) * | 2013-07-11 | 2013-10-02 | 内蒙古科技大学 | 一种高效提取用于pcr扩增的地下水微生物dna的方法 |
| CN104946740A (zh) * | 2015-05-07 | 2015-09-30 | 辽宁省海洋水产科学研究院 | 一种海洋褐潮生物群落结构的检测方法 |
| CN107418952A (zh) * | 2017-09-11 | 2017-12-01 | 广东美格基因科技有限公司 | 一种土壤微生物宏基因组dna的提取方法及相应的试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ALEXANDER I. CULLEY ET AL.: "The characterization of RNA viruses in tropical seawater using targeted PCR and Metagenomics", 《MBIO》 * |
| 吴旧生 等: "宏基因组学与动物病原微生物检测", 《中国比较医学杂志》 * |
| 夏骏 等: "以宏基因组技术探讨渤海秋冬季节病毒多样性", 《海洋与湖沼》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109852532A (zh) * | 2019-04-01 | 2019-06-07 | 中国科学院深海科学与工程研究所 | 一种全海深微生物核酸原位提取装置 |
| CN111394348A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-10 | 南华大学 | 污水中游离态dna的提取及检测方法 |
| CN114561378A (zh) * | 2022-03-14 | 2022-05-31 | 华中农业大学 | 一种提取蟹稻共生模式下水体环境基因组dna的方法 |
| CN114921573A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-08-19 | 集美大学 | 一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106047869B (zh) | 2019-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McGrath et al. | Isolation and analysis of mRNA from environmental microbial communities | |
| Leff et al. | Comparison of methods of DNA extraction from stream sediments | |
| EP1556480B1 (en) | Method for isolating and culturing unculturable microorganisms | |
| CN106047869A (zh) | 一种海水微生物宏基因组的提取方法 | |
| CN101696410B (zh) | 一种适用于底泥中微生物群落结构分析的dna提取方法 | |
| CN101712953B (zh) | 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法 | |
| Ueki et al. | Symbiotic bacteria associated with ascidian vanadium accumulation identified by 16S rRNA amplicon sequencing | |
| CN105483036B (zh) | 一种粘质沙雷氏菌及其应用 | |
| CN104357035B (zh) | 防治高温水体中srb的生物菌剂及其抑制srb的方法 | |
| CN106635904B (zh) | 一种具有降解苯胺能力的鞘氨醇杆菌及其应用 | |
| EP2499246B1 (en) | Method for isolating dna | |
| CN106244580B (zh) | 一种肺泡灌洗液宏基因组的提取方法 | |
| Reigstad et al. | Preparation of high-molecular weight DNA and metagenomic libraries from soils and hot springs | |
| CN106929578A (zh) | 一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法 | |
| CN104178481A (zh) | 一种30分钟内提取土壤微生物基因组dna的试剂盒 | |
| CN103789300B (zh) | 一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组dna的提取方法 | |
| CN107151666A (zh) | 一种水体中微生物dna的提取方法 | |
| CN104480103A (zh) | 一种土壤微生物基因组的提取方法 | |
| CN105349447B (zh) | 弧菌菌株及其用途 | |
| CN109423458B (zh) | 一种红球菌及其鉴定方法和应用 | |
| Handelsman | Soils—the metagenomics approach | |
| JP2006067890A (ja) | 核酸抽出方法および核酸抽出キット | |
| Mehanni et al. | A new bacterial strain Alcaligenes aquatilis MAG 1 associated with the mediterranean sea Lithophaga (Bivalvia) precipitating in nutrient free medium shell-like calcium carbonate polymorphs | |
| CN103333883A (zh) | 一种高效提取用于pcr扩增的地下水微生物dna的方法 | |
| Patil et al. | Isolation of marine actinomycetes from the mangrove swamps for biotechnological exploration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240419 Address after: Room 304, No. 59-1 Wanghai Road, Siming District, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Patentee after: Xiamen Jiyuan medical laboratory Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 361000 22 / F, building a, Haiyi building, 666 Xiahe Road, Siming District, Xiamen City, Fujian Province Patentee before: XIAMEN GENOKON MEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Country or region before: China |