CN114921573A - 一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法，属于化工材料检测技术领域。所述的利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法，包括如下步骤：1)样品采集；2)DNA提取和PCR扩增；3)高通量测序；4)生信分析，所述的生信分析包括聚类分析、多样性指数分析和丰度分析。本发明利用高通量测序技术对涂层表面的微生物群落演替过程进行分析，探寻微生物污损机理，评价防污涂料防污性能和寿命，对防污涂料的研发具有指导作用。本发明利用高通量测序技术对微生物腐蚀机理的研究不仅可以评价已有防污涂料的防污性能和使用寿命而且对防污涂料设计具有深刻的指导意义。

Description

一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法
技术领域
本发明属于化工材料检测技术领域，具体涉及一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法。
背景技术
目前，远洋船舶和深远海养殖装备等海上装备都存在海洋微生物腐蚀问题，然而据统计，如果采取有效的腐蚀防护措施，可以减少25％-40％的腐蚀损失。因此，大力发展深远海防腐材料和技术，对于保障深远海装备服役安全与可靠性，减少重大事故的发生，延长深远海设施的使用寿命具有十分重大的意义。
在防污性能方面：海洋微生物、生物和藻类的附着不但会导致船舶航行阻力和动力损失、加大航行成本，还会引起海水对流、养殖水体质量下降，导致鱼苗滋生细菌，导致孢子病，降低鱼苗存活率，而且附着于船舶上的海洋生物会腐蚀装备，缩短其寿命，加快更换周期，大大增加运行成本。因此，如何减少微生物、生物和藻类富集，减小船舶航行阻力，延长养殖装备的更换周期，成为备受关注的技术难题。
海洋生物污损是腐蚀的主要类型之一，海洋工程装备表面上生物污损层的形成经历三个阶段，即修整膜、生物被膜和生物污损层。海洋材料在浸入海水中数分钟内表面就会吸附一层有机物质，即形成修整膜；然后细菌和硅藻等各类微生物相继在修整膜上附着并分泌胞外多聚物形成微生物被膜；生物被膜为海洋中原核生物、真菌、藻类以及大型生物的孢子及幼虫提供生长繁殖的适宜场所，最后形成复杂的大型污损生物群落。生物污损对材料的腐蚀机理可以概括为：(1)生物污损阻隔氧扩散，降低材料腐蚀速率；(2)生物污损造成贫氧环境，形成氧浓差电池，造成局部腐蚀；(3)生物污损产生腐蚀性产物或反应性产物，促进材料局部腐蚀；(4)生物污损以材料作为营养成分，造成材料局部腐蚀。
据报道，微生物腐蚀造成的腐蚀损失约占总腐蚀损失的20％，在世界范围内，微生物腐蚀造成的直接经济损失估计为每年300-500亿美元。为了降低海洋腐蚀所造成的危害，涂装防腐防污涂层是目前解决该问题唯一可以广泛应用、既经济又高效的重要途径。传统的有机涂层虽然能提供一定的保护，但同时也存在防护时间短，防护性能不能满足海洋环境的使用要求，微生物污损腐蚀会减少其使用寿命的缺点。目前有关海洋环境微生物腐蚀机理的专门研究还很少，无法从机理改善涂料性能，提高涂层使用寿命。而且目前尚未见有利用高通量测序技术评价防污损涂料的防污效果的相关报道。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法，包括如下步骤：
1)样品采集；2)DNA提取和PCR扩增；3)高通量测序；4)生信分析，所述的生信分析包括聚类分析、多样性指数分析和丰度分析。
所述的防污损涂料优选为树脂；所述的树脂优选包括但不限于环氧树脂、硅改性树脂、氟改性树脂。
所述的样本采集包括：冲洗防污损涂料表面的生物附着物，取下生物附着物并离心去上清的操作。
所述的DNA提取优选通过基因组DNA提取试剂盒进行。
所述的PCR扩增的引物优选为：
338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
所述的PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃复性90s，72℃延伸10s，27个循环；72℃延伸5min。
所述的用于冲洗防污损涂料表面的生物附着物的试剂优选为PBS缓冲液。
所述的多样性指数分析包括但不限于ACE指数分析、Chao指数分析、Shannon指数分析和Simpson指数分析。
所述的丰度分析包括但不限于PERMANOVA/Anosim分析、heatmap热图分析和PCoA分析。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明利用高通量测序技术对涂层表面的微生物群落演替过程进行分析，探寻微生物污损机理，评价防污涂料防污性能和寿命，对防污涂料的研发具有指导作用。
(2)本发明公开了一种利用高通量测序技术评价防污涂料防污效果和寿命的方法，利用高通量测序技术对微生物腐蚀机理的研究不仅可以评价已有防污涂料的防污性能和使用寿命而且对防污涂料设计具有深刻的指导意义。
附图说明
图1为利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的技术路线图。
图2为实施例1实海挂板试验基地实物图；其中，a为实海挂板试验点试验基地图；b为环氧板尺寸图。
图3为不同板材涂层表面附着的微生物的OTU分析结果图；其中，a为分别经海水浸泡第1、3、7、15天的5个环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着的微生物的OTU分析结果图；其中，横坐标的con1d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天1号样品、con1d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天2号样品、con1d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天3号样品、con1d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天4号样品、con1d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天5号样品，con3d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天1号样品、con3d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天2号样品、con3d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天3号样品、con3d4 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天4号样品、con3d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天 5号样品，con7d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、con7d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天2号样品、con7d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天3号样品、con7d4 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、con7d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天 5号样品，con15d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天1号样品、con15d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天2号样品、con15d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天3号样品、 con15d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天4号样品、con15d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天5号样品，Total代表5个环氧树脂涂覆的板材浸泡第1、3、7、15天的所有样品；b为不同浸泡时间对环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着的微生物的OTU数量结果图；c 为不同浸泡时间对环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着的微生物的OTU Venn图，其中，多个颜色图形之间交叠部分数字为多个样品之间共有的OTU个数，非交叠部分为各样品特有的 OTU个数；Group1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天；Group2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天；Group3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天；Group4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天；d为环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天涂层表面附着的微生物的OTU平均数量变化结果图，其中， con7d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、con7d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天2号样品、con7d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天3号样品、con7d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、con7d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天5号样品， F15d1代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天1号样品、F15d2代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天2号样品、F15d3代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天3号样品、F15d4代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天4号样品、F15d5代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15 天5号样品，Si7d1代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、Si7d2代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天2号样品、Si7d3代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天3号样品、Si7d4 代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、Si7d5代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7 天5号样品，Total代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15 天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天的所有样品；e为不同浸泡时间的环氧树脂涂覆的板材、氟改性树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材涂层表面附着的微生物的OTU平均数量结果图；f为环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天涂层表面附着的微生物的OTU Venn图。
图4为不同浸泡时间点的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的PERMANOVA/Anosim和heatmap分析结果图；其中，a为不同浸泡时间点的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的PERMANOVA/Anosim分析结果图；b为不同浸泡时间点的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的heatmap分析结果图；其中，Group1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天；Group2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天；Group3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天；Group4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天；b为不同浸泡时间点的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的heatmap分析结果图，其中，Group1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天；Group2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天；Group3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天；Group4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天；All between treat1代表所有组间样品Beta距离数据；All within treat1代表所有组内样品Beta距离数据；con1d1 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天1号样品、con1d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天 2号样品、con1d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天3号样品、con1d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天4号样品、con1d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天5号样品，con3d1 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天1号样品、con3d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天 2号样品、con3d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天3号样品、con3d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天4号样品、con3d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天5号样品，con7d1 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、con7d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天 2号样品、con7d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天3号样品、con7d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、con7d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天5号样品，con15d1 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天1号样品、con15d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15 天2号样品、con15d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天3号样品、con15d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天4号样品、con15d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天5号样品。
图5为不同浸泡时间点的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的PCoA分析结果图， Group1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡1天；Group2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡3天；Group3 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡7天；Group4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡15天。
图6为环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天涂层表面附着的微生物的PERMANOVA/Anosim和Heatmap分析结果图；其中，a为环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天涂层表面附着的微生物的PERMANOVA/Anosim分析结果图；其中，All between treat1代表所有组间样品Beta距离数据；All within treat1代表所有组内样品Beta距离数据；con7代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、F15代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天、Si7代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天；b为环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天涂层表面附着的微生物的Heatmap分析结果图；其中，con7代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、F15 代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天、Si7代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天；con7d1 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、con7d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天 2号样品、con7d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天3号样品、con7d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、con7d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天5号样品，F15d1 代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天1号样品、F15d2代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第 15天2号样品、F15d3代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天3号样品、F15d4代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天4号样品、F15d5代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天5号样品，Si7d1代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、Si7d2代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天2号样品、Si7d3代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天3号样品、Si7d4代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、Si7d5代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天5号样品。
图7为环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天涂层表面附着的微生物的PCoA分析结果图；其中，con7代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、F15代表氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天、Si7代表硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天。
图8为环氧树脂涂覆的板材浸泡第1、3、7、15天涂层表面附着的微生物的门和纲水平上物种统计分布结果图；其中，a为环氧树脂涂覆的板材浸泡第1、3、7、15天涂层表面附着的微生物的门水平上物种统计分布结果图；b为环氧树脂涂覆的板材浸泡第1、3、7、15 天涂层表面附着的微生物的纲水平上物种统计分布结果图；其中，con1d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天1号样品、con1d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天2号样品、con1d3 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天3号样品、con1d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天 4号样品、con1d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天5号样品，con3d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天1号样品、con3d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天2号样品、con3d3 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天3号样品、con3d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天4号样品、con3d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天5号样品，con7d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、con7d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天2号样品、con7d3 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天3号样品、con7d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天 4号样品、con7d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天5号样品，con15d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天1号样品、con15d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天2号样品、con15d3 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天3号样品、con15d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15 天4号样品、con15d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天5号样品。
图9为环氧树脂涂覆的板材浸泡第1、3、7、15天涂层表面附着的微生物的属水平上物种统计分布结果图；其中，Group1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天；Group2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天；Group3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天；Group4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天；con1d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天1号样品、con1d2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天2号样品、con1d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天3号样品、con1d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天4号样品、con1d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天5号样品，con3d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天1号样品、con3d2 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天2号样品、con3d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天 3号样品、con3d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天4号样品、con3d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天5号样品，con7d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、con7d2 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天2号样品、con7d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天 3号样品、con7d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、con7d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天5号样品，con15d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天1号样品、con15d2 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天2号样品、con15d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15 天3号样品、con15d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天4号样品、con15d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天5号样品。
图10为环氧树脂涂覆的板材浸泡第1、3、7、15天涂层表面附着的微生物的种水平上物种统计分布结果图；其中，Group1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天；Group2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天；Group3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天；Group4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天；con1d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天1号样品、con1d2 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天2号样品、con1d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天 3号样品、con1d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天4号样品、con1d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天5号样品，con3d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天1号样品、con3d2 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天2号样品、con3d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天 3号样品、con3d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天4号样品、con3d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天5号样品，con7d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天1号样品、con7d2 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天2号样品、con7d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天 3号样品、con7d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天4号样品、con7d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天5号样品，con15d1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天1号样品、con15d2 代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天2号样品、con15d3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15 天3号样品、con15d4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天4号样品、con15d5代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天5号样品。
图11为环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的Alpha多样性分析结果图。
图12为环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的LDA值结果图；其中，Group1代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第1天；Group2代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第3天；Group3代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天；Group4代表环氧树脂涂覆的板材浸泡第15天。
图13为环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的相关性分析结果图。
图14为不同浸泡时间的环氧树脂涂覆的板材、氟改性树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材涂层的挂板实物图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
正己烷、丁腈、二甲苯、偶氮二异丁腈(AIBN)均购自国药集团化学试剂有限公司；环氧树脂购自昂森建材河北有限公司；甲醇、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMA)、甲基丙烯酸-3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯(TMSPMA)购自阿拉丁试剂 (上海)有限公司。
本发明利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的技术路线如图1所示。
实施例1：
(1)树脂来源及制备方法
硅改性树脂的合成方法：
(1)分别将称量好的甲基丙烯酸甲酯(MMA)50mmol、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMA，平均分子量950)15mmol和甲基丙烯酸-3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯(TMSPMA)20mmol与引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)(4.25mmol，引发剂添加量为单体(MMA、PEGMA、TMSPMA)摩尔量的0.5％)充分混合之后加入恒压滴液漏斗之中，连接好装置并密封，搅拌并通入氮气30min，得到溶液；
(2)将50mmol二甲苯加入到烧瓶中，缓慢加热二甲苯，大约到30min时加热到90℃；
(3)打开恒压滴液漏斗，缓慢滴加溶液到加热后的二甲苯中，滴加完全后持续通入氮气下保温4个小时，以提高单体的转化率，得到产物。随后将产物用过量的正己烷和甲醇混合溶液，反复沉淀3次，并在60℃下真空干燥24小时以上，即得硅改性树脂。
氟改性树脂的合成方法：
(1)将单体甲基丙烯酸甲酯(MMA，10g，100mmoL)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA，，平均分子量950，4.75g，10mmoL)、偶氮二异丁腈(AIBN，0.07375g，0.45mmoL)和二甲苯(5mL)搅拌均匀装入滴液漏斗中，密封好装置后通入氮气20min以排除空气，得到混合溶液；
(2)将二甲苯(10mL)放入带有磁力搅拌子的烧瓶之中，将烧瓶置于油浴锅中，将油浴锅加热到90℃并保持此温度；
(3)此时打开滴液漏斗向加热后的二甲苯中缓慢匀速滴加混合溶液，并保持在4小时左右滴加完成，得到溶液。然后将甲基丙烯酸六氟丁酯(HFBMA，3g，12mmoL)和偶氮二异丁腈(AIBN，0.03g，0.183mmoL)溶解在6mL二甲苯中，得到溶有HFBMA和AIBN的二甲苯，并将溶有HFBMA和AIBN的二甲苯在氮气氛围中，于两小时内滴加到上述溶液中，滴加完成后，保温1小时，得到产物；随后将产物用过量的正己烷反复沉淀3次，并在60℃下真空干燥24小时以上，即得氟改性树脂。
环氧树脂购自昂森建材河北有限公司。
(2)实海挂板
实际海洋环境下挂板实验在厦门大离浦屿(24°33'N，118°09'E)海上浮筏进行，如图2a，此处测试海域污损生物种类繁多。
环氧树脂涂覆的板材是以环氧板为基材(100mm×80mm×3mm)(如图2b所示)，利用溶液-浇筑成膜法在基材表面涂覆环氧树脂，使环氧板基材表面形成涂层，然后在自然状态下挥发涂层表面的溶剂，之后真空干燥72小时得到。
氟改性树脂涂覆的板材是以环氧板为基材(100mm×80mm×3mm)(如图2b所示)，利用溶液-浇筑成膜法在基材表面涂覆氟改性树脂，使环氧板基材表面形成涂层，然后在自然状态下挥发涂层表面的溶剂，之后真空干燥72小时得到。
硅改性树脂涂覆的板材是以环氧板为基材(100mm×80mm×3mm)(如图2b所示)，利用溶液-浇筑成膜法在基材表面涂覆硅改性树脂，使环氧板基材表面形成涂层，然后在自然状态下挥发涂层表面的溶剂，之后真空干燥72小时得到。
环氧树脂涂覆的板材、氟改性树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材的涂层厚度均为 100-200μm。
(3)样品采集
将环氧树脂涂覆的板材、氟改性树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材放置于厦门大离浦屿海区的海水中浸泡90天进行挂板实验，期间分别于第1天、第3天、第7天、第15天、第30天、第60天、第90天对三种树脂挂板涂层表面附着的生物进行采样保存：具体是用无菌PBS缓冲液(1×PBS缓冲液)轻柔冲洗挂板3次，然后用无菌细胞刮刀刮取涂层表面的生物附着物，并盛装于无菌离心管中，1000r/min冷冻离心弃去上清，得到混合物(附着生物环境样品)，而后储存在-80℃冰箱直至DNA提取。
(4)DNA提取
使用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒(购于Qiagen公司)对附着生物环境样品进行总DNA的提取。具体操作步骤如下：
1)取100mg样品，置于离心管中；
2)加入1mL Inhibit EX Buffer，涡旋振荡1min，使样品均匀分散于溶液中；
3)75℃水浴5min，涡旋振荡15秒；
4)14000rpm离心1min，取200μL上清液转移至新的离心管中；
5)上清液中加入15μL Proteinase K，然后添加200μL Buffer AL，涡旋混合15秒；
6)70℃孵育10min；
7)向溶解液中添加200μL乙醇，涡旋混匀；
8)将600μL裂解液转移至吸附柱中，14000rpm离心1min，弃废液；
9)向吸附柱中加入500μL Buffer AW1，14000rpm离心1min，丢掉收集管及其中的废液，将吸附柱重新放回新的收集管中；
10)向吸附柱中加入500μL Buffer AW2，14000rpm离心3min，丢掉收集管及其中的废液，将吸附柱重新放回新的收集管中；
11)将收集管液体14000rpm离心3min；
12)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50μL BufferATE，室温放置1min，14000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
(5)PCR扩增
使用细菌16S rRNA基因的V3-V4区引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)进行PCR扩增。总反应体系为25μL：Ex Taq 酶为12.5μL、338F为1μL(10μmol/L)、806R为1μL(10μmol/L)、DNA模板为2.5μL、去离子水为8μL。反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃复性90s，72℃延伸10s， 27个循环；72℃延伸5min。将PCR质检合格的DNA样品用封口膜密封置于冰盒中送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。
(6)Illunmina MiSeq高通量测序及数据分析
Illunmina MiSeq高通量测序得到的是双端序列数据，根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，过滤50bp以下的reads和10bp以下的overlap。根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，优化序列。
OTU(Operational Taxonomic Units)是分类单元，根据97％相似水平对所有序列进行OTU 聚类。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97％相似水平的OTU进行分类学分析，并比对数据库Silva(Release132 http://www.arb-silva.de)统计各样品的群落物种组成。
为研究不同样品物种组成结构的相似性和差异关系，使用UPGMA(UnweightedPair-group Method with Arithmetic Mean，非加权组平均法)对样品距离矩阵进行聚类分析，构建样品层级聚类树，用Qiime计算beta多样性距离矩阵，然后用R语言绘制树图。Heatmap图使用R 语言绘制，使用FastTree(version 2.1.3http://www.microbesonline.org/fasttree/)最大似然法构建进化树，然后利用FastUniFrac(http://UniFrac.colorado.edu/)分析得到样品间距离矩阵。
1)OTU分析
分别取环氧树脂涂覆的板材5个，于浸入海水中的第1、3、7、15天对环氧树脂表面附着微生物进行OTU分析，发现OTU数量随时间的推移而上升，到第15天接近饱和，群落演替的高峰期在第1-7天(图3a和图3b)；OTU Venn图(图3c)显示第1天和第3天共享803 个OTU，各自专享53和100个OTU，第7天和之前相比，有101个专享OTU，第15天与之前相比，仅有9个专享OTU，说明群落演替的高峰期在第1-7天。
分别取浸泡第7天的环氧树脂涂覆的板材、浸泡第15天的氟改性树脂涂覆的板材和浸泡第7天的硅改性树脂涂覆的板材各5个，通过对环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天的涂层表面附着微生物进行 OTU分析，发现三组样品涂层表面附着微生物的OTU种类数量较为接近(图3d和3e)，三组样品共享948个OTU，各自专享13、4和5个OTU(图3f)。
2)PERMANOVA/Anosim分析、heatmap图分析和PCoA分析
PERMANOVA(Adonis)又称置换多元方差分析，Anosim(analysis ofsimilarities)分析，也叫相似性分析，它们主要是用于分析多维度数据组间相似性的统计方法。在PCoA分析、 NMDS分析中不同分组的样本点之间的差异是否显著，没有相应的统计检验结论。 PERMANOVA或Anosim分析可以对不同分组的样品之间beta多样性是否显著差异进行检验。使用R语言中的vegan包进行分析，使用python绘图。PERMANOVA分析得到的R2表示不同分组对样品差异的解释度，即分组方差与总方差的比值，R2越大表示分组对差异的解释度越高，表示分组差异越大，P值小于0.05时说明检验的可信度高。Anosim分析得到的R值越接近1表示组间差异越大于组内差异，R值越小则表示组间和组内没有明显差异，P值小于0.05时说明检验的可信度高。
分别取环氧树脂涂覆的板材5个，将环氧树脂涂覆的板材浸泡于海水中，分别于第1、3、 7、15天对环氧树脂涂覆的板材涂层表面的微生物进行PERMANOVA/Anosim、heatmap图和 PCoA图分析。
利用PERMANOVA/Anosim对不同浸泡时间点的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物进行分析，图4a显示不同浸泡时间点的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物的组间差异显著大于组内差异，证明污损的早期过程伴随着剧烈的群落演替；
heatmap图(图4b)和PCoA分析图(图5)表明，第7天和第15天的样品在物种多样性方面的相似程度较高，而与第1天和第3天的相似度较低。
利用PERMANOVA/Anosim对环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天(环氧树脂组)、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天(氟改性树脂组)和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天(硅改性树脂组)的涂层表面附着微生物进行分析，发现组间无明显差异(图6a)；
Heatmap分析(图6b)显示三个组的界限难以分清；
PCoA分析(图7)表明环氧树脂组和硅改性树脂组在物种多样性方面较相似，提示氟改性树脂的防污损性能更佳。
3)物种统计分布
分别取环氧树脂涂覆的板材5个，将环氧树脂涂覆的板材浸泡于海水中，分别于第1、3、 7、15天对环氧树脂涂覆的板材涂层表面的微生物进行不同等级物种统计，总计22个门，467 个属，532个种；对其不同水平的物种分布进行分析，物种分布图显示在门的水平上(图8a) 随时间演替并不明显，总体来看，Proteobacteria占绝对优势，1-3天蓝细菌(Cyanobacteria) 和放线菌门(Actinobacteria)有所增加，3-7天蓝细菌和放线菌占比减少，第15天拟杆菌门 Bacteroidetes占比增加；在纲的水平上(图8b)，有较为明显的演替过程，最初以γ-变形菌纲 (Gammaproteobacteria)为主导，之后逐渐演替为由α-变形菌(Alphaproteobacteria)占主导；在属的水平上(图9)，演替过程明显，最初以Oleibacters属为主导，之后逐渐演替为由 Methylophaga属占主导，再到由Methylotenera属占主导，最后由Erytgrobacter和Tenacibaculum 占主导；在种的水平上(图10)，分为两支：第1天和第3天较为相似，第7天和第15天较为相似，这表明群落组成随着时间推移而发生演替，且重复性较好。
4)Alpha多样性分析
将环氧树脂涂覆的板材浸泡于海水中，分别于第1、3、7、15天对环氧树脂涂覆的板材涂层表面的微生物进行Alpha多样性分析，如图11所示，发现在1-7天，物种丰度不断上升， 7-15天则趋于平稳；物种多样性在1-3天有所增加，3-7天则急剧下降，7-15天略微回升，这些结果分别从物种丰度和物种多样性的角度证明1-7天是群落演替的高峰期。
通过对环氧树脂涂覆的板材浸泡第7天、氟改性树脂涂覆的板材浸泡第15天和硅改性树脂涂覆的板材浸泡第7天的表面附着微生物进行Alpha多样性分析(表1)，发现环氧树脂涂覆的板材、氟改性树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材涂层表面微生物E指数、Chao指数、Shannon指数、Simpson指数的大小相似，环氧树脂涂覆的板材、氟改性树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材涂层表面微生物多样性相近，环氧树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材涂层表面微生物的多样性会略高一些，提示氟改性树脂的防污损性能更佳。
表1：不同树脂表面附着的生物的Alpha多样性分析
样品 ACE指数 Chao指数 覆盖范围(％) Shannon指数 Simpson指数
环氧树脂 941.4698 958.1131 0.99806 3.74964 0.14304
氟改性树脂 871.1175 887.342 0.99758 3.995 0.11808
硅改性树脂 911.3316 914.3698 0.9976 3.33412 0.15776
5)组间差异显著性分析
LEfSe(LDAEffect Size)分析，可以于两个或多个分组之间的比较，从找到组间有显著性差异的物种(即biomarker)，分析步骤主要分为三步：
Step1：利用Kruskal-Wallis秩和检验检测所有的特征物种，通过检测不同组间的物种丰度差异，获得显著性差异物种。
Step2：再利用Wilcoxon秩和检验检测上步获得的显著性差异物种的所有亚种是否都趋同于同一分类级别。
Step3：最后用线性判别分析(LDA)，得到最终的差异物种(即biomarker)。
将环氧树脂涂覆的板材浸泡于海水中，分别于第1、3、7、15天对环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物进行组间差异显著性分析，LDA值分布柱状图(图12)展示了在不同时间点起到重要作用的微生物群的影响大小，从中可以推断最适合作为监测污损进程的biomarker，第1天、第3天、第7天、第15天的biomarker分别为：Saccharospirillaceae，Methylophaga，Methylotenera，Rhodobacteraceae。
6)相关性分析
将环氧树脂涂覆的板材浸泡于海水中，对第1、3、7、15天的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物进行相关性分析，发现第1、3、7、15天的环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物中，Methylotenera与Thalassobius和Thalassococcus有共存关系，在污损过程中可能存在协同作用(图13)。
环氧树脂涂覆的板材涂层表面附着微生物早期有明显群落演替，Methylotenera是一种在环氧涂层污损和腐蚀进程中的潜在biomarker，与Thalassobius和Thalassococcus在环氧树脂涂覆的板材涂层表面有显著的共存关系，在污损过程中可能存在协同作用；高通量测序分析结果得出氟改性树脂的防污效果最佳，有望成为一种新型的防污涂料。
通过对浸泡于海水中第7、15、30、57、90天的环氧树脂涂覆的板材、氟改性树脂涂覆的板材和硅改性树脂涂覆的板材的挂板情况进行对比(图14)，再一次验证了本发明利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法的准确性与可行性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 集美大学
<120> 一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actcctacgg gaggcagcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 806R引物
<400> 2
ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims (10)

1.一种利用高通量测序技术评价防污损涂料防污效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)样品采集；2)DNA提取和PCR扩增；3)高通量测序；4)生信分析，所述的生信分析包括聚类分析、多样性指数分析和丰度分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的多样性指数分析包括ACE指数分析、Chao指数分析、Shannon指数分析和Simpson指数分析。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的丰度分析包括PERMANOVA/Anosim分析、heatmap热图分析和PCoA分析。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的防污损涂料为树脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述的树脂包括但不限于环氧树脂、硅改性树脂、氟改性树脂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的样本采集包括：冲洗防污损涂料表面的生物附着物，取下生物附着物并离心去上清的操作。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的PCR扩增的引物为：
338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的PCR扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃复性90s，72℃延伸10s，27个循环；72℃延伸5min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的DNA提取通过基因组DNA提取试剂盒进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述的用于冲洗防污损涂料表面的生物附着物的试剂为PBS缓冲液。
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CN106047869A (zh) * 2016-08-23 2016-10-26 厦门基源医疗科技有限公司 一种海水微生物宏基因组的提取方法
CN114231119A (zh) * 2021-11-24 2022-03-25 中山大学 一种具备自修复功能的防腐防污一体化涂料的制备方法及其应用

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Title
刘珺: "海洋环境下硅烷乳液对水泥基材料的生物污损防护效果及机理研究", 中国硕士学位论文电子期刊工程科技, no. 2, 15 February 2022 (2022-02-15), pages 1 - 89 *
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