CN104651350A - 一种土壤样品中微生物总dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法；具体为：向土壤样品中加入DNA提取缓冲液，在液氮和热水浴中反复冻融；再加入蛋白酶K，37℃水浴30min；加入十二烷基磺酸钠溶液，65℃水浴30min，离心弃沉淀，收集上清液；用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心后收集上清液，再倒入氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心后收集上清液；在所述上清液中加入异丙醇对其沉淀，离心后收集沉淀；加入乙醇洗涤室温干燥后，加入TE缓冲液溶解。最后将上述DNA粗提液采用吸附柱纯化后分装、保存于-20℃。本发明方法对于深层土壤、干燥砂土等生物量少的样品以及粘性土壤尤为有效，所得的DNA提取液可直接用于后续分子生物学检测。

Description

一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法，更具体地，本发明为油气田土壤样品中微生物总DNA的提取方法。

背景技术

传统的油气微生物勘探技术是利用微生物计数、富集培养、分离以及微生物代谢产物的生理、生化分析来研究土壤中油气微生物的异常，从而预测油气藏的存在。但是近年来，国内外许多研究者已经逐渐认识到常规的微生物分离培养技术在微生物计数测定时具有很大的局限性，具体表现为可分离出的微生物种类只占土壤微生物种类总数的0.1%-1%，许多“存活但不能培养”的微生物不能被分离和鉴定。因此传统培养法有可能使土壤微生物在土壤生态系统中的生活特征和生态功能的信息被忽视。其次，传统微生物的培养计数方法（如MPN法和平板计数）还具有耗时费力、不能及时反映菌体生长情况、不能区分细胞死活、受培养基成分和代谢产物性质影响等缺点。MPN法需要做梯度稀释，一般需要5-7个稀释度，而且要重复3-5管，而且还要2-3个平行，因此工作量巨大，给规模化操作和快速检测造成了困难。MPN法检测油气指示微生物还面临观察微生物生长比较困难的难题。油气指示微生物需要通气培养，微生物生长非常缓慢而且表现不明显，需要添加指示剂进行观察其生长状况，结果容易造成误判。因此，利用传统的微生物培养来检测油气微生物还存在很大的不足。分子生物学的快速发展为油气微生物的检测提供了新的契机，其优点首先在于该方法不依赖于培养技术，可以避免油气指示微生物生长周期长，难于培养和检测的缺点。其次，具有快速、灵敏的特点，特别适合样品中数量较少的油气指示菌的情况，可以快速检测特定基因得到结果。

作为分子生物学检测方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的微生物总基因组DNA。土壤样品成分复杂，含大量有机和无机化合物，并且微生物细胞通常紧紧吸附于颗粒表面。另外，土壤样品中通常含有大量影响DNA后续分子操作(如限制性内切酶酶切、转化、PCR扩增等)的物质，例如腐植酸、重金属离子等，且各种土壤类型组成不一，这些都为从土壤中有效提取高质量的DNA带来了困难。特别的，用于微生物油气勘探的土壤样品，为避免地表环境的干扰，大多采样深度较深，相对于表层土壤，微生物种类和数量明显偏少。另外，勘探过程中会遇到大量的粘土样品，而粘土样品的DNA提取恰恰是目前国内外急需解决的难题。

CN101230342A公开一种提高DNA质量的土壤样品总DNA提取方法，在该方法中，先使用酶法和化学法对细胞进行破碎，然后对其进行冻融处理，该方法对微生物细胞壁破碎效率不高。US5824224A公开了一种快速提取DNA的装置及利用该装置快速提取DNA的方法；但其中采用常规的DNA提取方法和试剂，其提取效果一般。

鉴于此，很有必要开发一种能够高效提取油气勘探土壤样品DNA的方法，以提高微生物油气勘探的准确性和可靠性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够高效提取油气勘探土壤样品中总DNA的方法。本发明依次采取物理法、酶法和化学法三种裂解方法结合进行细胞破碎，针对各种不同类型的油气勘探土壤样品都能够稳定高效地提取得到DNA，从而保证后续分子生物学检测的灵敏度和准确性，以满足科研和生产的需要。

因此，本发明提供一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法，包括：步骤A，在土壤样品中加入DNA提取缓冲液后，对土壤样品中的微生物进行物理法细胞破碎；步骤B，然后使用蛋白酶K溶液对步骤A得到的土壤样品中的微生物进行酶法细胞破碎；步骤C，再对步骤B得到的土壤样品中的微生物进行化学法细胞破碎后，将所得溶液离心并收集上清液；步骤D，用有机溶剂对所述上清液进行抽提后离心并收集上清液；在所述上清液中加入沉淀剂进行沉淀，离心并收集沉淀；然后将所述沉淀洗涤并干燥和溶解后，得到DNA粗提液；步骤E，将所述DNA粗提液采用吸附柱纯化后得到纯化的DNA提取液。

本发明中，步骤E中的所述纯化的DNA提取液可直接用于后续分子生物学检测，或分装并保存于-20℃待用。

在本发明中，优选地，步骤A中所述物理法细胞破碎为对其冻融2～5次；步骤B中酶法细胞破碎的水浴温度为30～45℃；步骤C中所述化学法细胞破碎为使用表面活性剂进行细胞破碎；优选步骤B中加入蛋白酶K溶液的水浴时间为5min～3h。更优选所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠溶液，且化学破碎的温度为60～70℃，水浴时间为5min～3h。

在本发明中，优选地，步骤D中对所述上清液用有机溶剂抽提包括先对所述上清液用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心并收集上清液；再用氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心并收集上清液。另外，优选该步骤中所述沉淀剂为异丙醇。在步骤D中，优选每次抽提所用有机溶剂与待抽提的上清液体积相近，例如为其1/2～2倍；优选异丙醇的体积为待抽提的上清液体积的0.2～1倍。步骤D中沉淀温度优选为-20℃～4℃，沉淀时间为5min～3h。

在本发明中，步骤D中优选使用乙醇水溶液洗涤所述沉淀，例如使用70wt%的乙醇；且使用TE缓冲液溶解所述沉淀，所述TE缓冲液中例如包含10mMTris-HCl，1mM EDTA，其pH=8.0。

在一个具体实施方式中，步骤A中所述DNA提取缓冲液中包含50～150mM的Tris-HCl、50～150mM的EDTA、50～150mM磷酸盐缓冲液和0.5～2.5M的NaCl；优选其中还包括0.5～2wt%的CTAB。针对腐植酸含量高的土壤样品，或多糖及蛋白质含量较高的表层沃土，在DNA提取缓冲液中加入所述CTAB将特别有利。

在本发明中，优选步骤A所述冻融中的冷冻是在液氮环境下进行，而溶解是在60～70℃的水浴环境下进行。且优选样品在液氮环境下的冷冻时间为0.2～5min。

在本发明中，具体地，所述DNA提取缓冲液与所述土壤样品的质量比例如为1∶1～2∶1。

本发明中，所述吸附柱可以为任何能够选择性吸附DNA以达到纯化目的的吸附柱，本发明对此不作限制。在一些具体实例中，所述吸附柱可以为采用手工法灌柱自制的DNA吸附柱，也可以是商用的DNA回收纯化柱（硅胶膜）。本发明所述吸附柱优选采用硅胶膜作为填料；由于硅胶膜对DNA具有特异性吸附作用，它对其他生物材料基本不吸附；可以保障最大程度地回收样品中的DNA，同时去除其他杂质。

另外，优选本发明中所述土壤样品为油气田土壤样品。

本发明还提供一种如上所述提取方法在油气勘探开发领域的应用。

本发明的DNA提取方法与CN101230342A中公开的DNA提取方法相比，首先，本发明是依次采取物理法、酶法和化学法三种裂解方法结合进行细胞破碎，而现有技术中的该方法是在冻融处理前对样品进行酶法和化学法裂解，本发明的破胞效率要远远高于该现有方法。其次，该现有方法中使用漩涡振荡法进行机械破碎，容易造成DNA片段破碎；而本发明并不使用涡旋振荡，而仅使用循环冻融的物理破胞方法，所得DNA片段较为完整。还有，该现有方法中使用苯酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇洗涤法对DNA粗提物纯化，其步骤繁琐且纯化效果一般；而本发明中对DNA粗提液采用吸附柱纯化，其简便易行且纯化效果好，产物中DNA浓度高且得率也较高。也正因为本发明的前述步骤中破壁效率高且DNA完整保留，因而对DNA粗提液纯化时，使用简单的吸附柱纯化即能达到很好的纯化效果。

另外，本发明是针对各种不同类型的油气田区土壤样品，开发的高效率、低成本的DNA提取方法。其特点为：①与商用试剂盒相比，单个样品成本降低约80%，大大节约了成本。②该技术得到的油田区土壤DNA样品，其DNA产率高于商用试剂盒提取方法的3～10倍，初提DNA经过吸附柱纯化即可满足后续分子生物学检测的要求，为油气指示微生物的定量研究奠定了基础；③本发明中的方法对于深层土壤、干燥砂土等生物量少的样品以及粘性土壤尤为有效；④该技术完成一次DNA提取工作所需要的时间，最短可控制在3.5小时以内，打破了手提方法实验周期长的传统观念。

本发明中方法可用于油气微生物勘探的土壤样品DNA提取，提取和检测结果用于油气微生物勘探；也可应用于微生物采油和石油污染生物修复领域。尤其是针对油气田上方受到轻烃微渗漏影响的表层土壤样品，其烃类浓度较低、油气微生物数量较少。本发明适合大规模工业化测试，应用前景乐观。

附图说明

图1为本发明方法与商用试剂盒法获得的土壤DNA琼脂糖凝胶电泳图。

其中，电泳条件为：100V，80mA，0.8%琼脂糖凝胶，电泳时间40min。图中从右至左依次分别为：泳道1：DNA分子量标记；泳道2-3：沃土样品采用试剂盒法提取的DNA产物（两个平行样，下同）；泳道4-5：沃土样品采用本发明方法提取的DNA产物；泳道6-7：粘土样品采用试剂盒法提取的DNA产物；泳道8-9：粘土样品采用本发明方法提取的DNA产物。

具体实施方式

实施例1

本实施例中所述土壤样品为油气田附近的砂土样品。本实施例的土壤样品中微生物总DNA的提取方法如下。

（1）称取0.5g土壤置于2ml离心管中，加入1ml DNA提取缓冲液（0.1MTris-HCl[pH8.0]、0.1M EDTA[pH8.0]、0.1M磷酸钠[pH8.0]、1.5M NaCl）；混合均匀；

（2）将已加入土样与提取液的离心管在液氮中速冻1min，再在65℃条件下水浴至融化，如此反复冻融处理三次；再加入25μl蛋白酶K溶液(10mg/ml)，混合均匀；37℃水浴30min，期间每隔5-10min摇动一次；

（3）加入20%的十二烷基磺酸钠（SDS）溶液200μL，并轻轻摇匀。65℃水浴30min，期间每隔5-10min摇动一次。室温10000×g离心10min，转移上清液到一个新的2ml离心管中。

（4）在装有上清液的离心管中倒入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1），摇匀后，4℃12000rpm离心10min。收集上清液，倒入等体积的氯仿/异戊醇（体积比为24∶1），摇匀后，4℃12000rpm离心10min。收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃或4℃下沉淀30min。室温13000×g离心20min。

（5）收集沉淀，加入1ml70%的乙醇，用枪头吸打充分混匀，洗涤沉淀。室温13000×g离心10min，倒掉上清液。待沉淀干燥后，向离心管中加入100μlTE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0）。

（6）将上述DNA粗提液采用商用吸附柱纯化。所述吸附柱纯化的具体步骤为：将DNA粗提液全部转移至DNA吸附柱中，6000×g离心1分钟，倒掉套管中的液体，随后在DNA吸附柱中加入500μl洗液，该洗液与商用纯化柱配套，例如为55-80wt%的乙醇溶液，静置1分钟，6000×g离心1min，倒掉套管中的液体。将DNA吸附柱重新装入套管，用洗液重复洗涤一次吸附柱。然后将DNA吸附柱装入一无DNA酶的新的1.5ml离心管，在硅胶膜中央加入50μl预热至50℃的洗脱液，所述洗脱液例如可以是纯水，也可以是TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)）；室温静置4分钟，10000×g离心2分钟，离心管中得到的液体即为待检DNA纯化液。将该DNA纯化液进行分装、保存于-20℃。该DNA纯化液可直接用于后续分子生物学检测。在这里，套管一般针对吸附柱而言，它可以容纳吸附柱，二者一并装入离心机进行离心，且套管可以承纳离心下的液体。

实施例2

本实施例中所述土壤样品为油气田附近的沃土样品。本实施例的土壤样品中微生物总DNA的提取方法与实施例1中的提取方法基本相同，但在DNA提取缓冲液中还加入1wt%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。

实施例3

本实施例中所述土壤样品为油气田附近的粘土样品。本实施例的土壤样品中微生物总DNA的提取方法与实施例1中的提取方法相同。

对比例1～3

对比例1～3中所述土壤样品为油气田附近的砂土、沃土和粘土样品。对比例的土壤样品中微生物总DNA的提取方法均为使用商用试剂盒法提取。所述商用试剂盒采用Mobio公司的PowerSoil DNA Isolation Kit。

表1中列出了实施例1～3和对比例1～3中所得DNA样品的浓度及得率。

表1

	浓度(ng/μL)	得率(μg/g干土)
			实施例1	91.40±39.99	8.36±3.26
实施例2	264.67±108.25	25.38±11.25
			实施例3	228.44±52.55	21.95±5.66
对比例1	10.40±8.47	2.43±2.50
			对比例2	9.36±7.06	1.17±0.65
对比例3	7.28±5.45	1.35±0.70

从表1可见，本发明方法针对各种类型的土壤在DNA浓度和得率上均明显优于商用试剂盒，DNA的浓度提高了7.7-30.3倍，而得率也提高了2.4-20.6倍，本发明高质量地提取了土壤微生物中总DNA。另外，从图1中土壤DNA的琼脂糖凝胶电泳图也可以看出，本发明中的DNA条带亮度明显高于商用试剂盒法。本发明的方法为后续的分子生物学检测提供了必要的技术基础，从而提高了微生物油气勘探的准确性和可靠性。

Claims (10)

1.一种土壤样品中微生物总DNA的提取方法，包括：

步骤A，在土壤样品中加入DNA提取缓冲液后，对土壤样品中的微生物进行物理法细胞破碎；

步骤B，然后使用蛋白酶K溶液对步骤A得到的土壤样品中的微生物进行酶法细胞破碎；

步骤C，再对步骤B得到的土壤样品中的微生物进行化学法细胞破碎后，将所得溶液离心并收集上清液；

步骤D，用有机溶剂对所述上清液进行抽提后离心并收集上清液；在所述上清液中加入沉淀剂进行沉淀，离心并收集沉淀；然后将所述沉淀洗涤并干燥和溶解后，得到DNA粗提液；

步骤E，将所述DNA粗提液采用吸附柱纯化后得到纯化的DNA提取液。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤A中所述物理法细胞破碎为对其冻融2～5次；步骤B中酶法细胞破碎的水浴温度为30～45℃；步骤C中所述化学法细胞破碎为使用表面活性剂进行细胞破碎；优选所述表面活性剂为十二烷基磺酸钠溶液，且化学破碎的温度为60～70℃。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤D中对所述上清液用有机溶剂抽提包括先对所述上清液用苯酚、氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心并收集上清液；再用氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心并收集上清液；且所述沉淀剂为异丙醇。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤D中使用乙醇水溶液洗涤所述沉淀，且使用TE缓冲液溶解所述沉淀。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的提取方法，其特征在于，步骤A中所述DNA提取缓冲液中包含50～150mM的Tris-HCl、50～150mM的EDTA、50～150mM磷酸盐缓冲液和0.5～2.5M的NaCl；优选其中还包括0.5～2wt%的CTAB。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤A所述冻融中的冷冻是在液氮环境下进行，而溶解是在60～70℃的水浴环境下进行。

7.根据权利要求1～6中任意一所述的提取方法，其特征在于，所述DNA提取缓冲液与所述土壤样品的质量比为1∶1～2∶1。

8.根据权利要求1～6中任意一所述的提取方法，其特征在于，所述吸附柱采用硅胶膜作为填料。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的提取方法，其特征在于，所述土壤样品为油气田土壤样品。

10.一种如权利要求1～9中任意一项所述的提取方法在油气勘探开发领域的应用。